CRISPR-Cas12a在食源性致病菌检测中的应用

食源性致病菌快速检测方法对食源性疾病的高效预防和控制具有重要意义。CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)及相关蛋白(CRISPR-associated protein, Cas)构成的CRISPR-Cas系统是一种强大的基因编辑工具, 基于其对靶标核酸的特异性识别及切割活性, 应用于食源性致病菌检测中, 已成为快速检测方法研究的热点。CRISPR-Cas12a检测技术具有特异性强、灵敏性高的优点, 在食源性致病菌的检测中有着巨大的应用前景。本文主要介绍了CRISPR-Cas12a的作用机制, 重点综述了CRISPR-Cas12a结合多种核酸扩增技术在食源性致病菌检测中的研究进展, 进一步讨论了CRISPR-Cas12a在致病菌检测中存在的问题和不足, 对未来的研究前景进行了展望, 以期为更好地开发准确、快速灵敏的食源性致病菌检测技术提供参考和依据。     

快速检测牛奶中大肠杆菌的压电生物传感器研究

构建了一台基于串联式压电传感器的自动化微生物检测仪。对加入大肠杆菌的模拟牛奶样品进行检测,根据检测时间和样品中细菌浓度之间的线性关系,可以对样品中的细菌浓度进行计数,测定范围为10 个/ml 到106个/ml,检测时间3～15h。该方法的准确度与标准的平板计数法相当(r ≥ 0.99),但是更灵敏、快速、简便。     

牛奶中志贺氏菌PCR检测方法的建立

根据Genbank志贺氏菌侵袭性质粒抗原H (ipaH)基因序列, 自行设计引物, 扩增特异的326 bp核酸片段, 经过优化PCR扩增条件, 建立了志贺氏菌特异、敏感、快速的PCR检测方法, 并对牛奶中的志贺氏菌进行了检测.特异性试验结果表明, 志贺氏菌参考菌株均能扩增出特异的核酸片段, 大肠杆菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌的扩增结果均为阴性.敏感性试验结果表明, 采用试剂盒提取基因组, 该方法的敏感性可达到1.75×102 cfu/mL.人工污染牛奶的模拟检测结果表明, PCR方法的检测限为1.75×103 cfu/mL.     

拮抗大肠杆菌的海洋微生物的筛选与鉴定

该研究采用涂布平板法、对峙培养法及琼脂扩散法从北冰洋沉积物样品中分离、筛选出对大肠杆菌（Escherichia coli）具有良好拮抗作用的一株菌株,通过对其菌株形态进行观察、分析其生理生化试验结果以及进行分子生物学技术检测,进行分类鉴定,并进行了抑菌谱研究。结果表明,从北冰洋沉积物样品中共分离纯化出97株菌株,其中21株菌株对大肠杆菌有一定的拮抗作用,且1株菌株拮抗效果最好,编号为105号,平均抑菌圈直径为（19.3±1.0） mm。该菌株被鉴定为萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）,抗菌谱较为广泛,对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌都具有抑制作用。     

食品中大肠杆菌检测方法研究进展

大肠杆菌是人及各种动物肠道中的正常菌群,食品中检出大肠杆菌意味着食品己经被污染。大肠杆菌作为各种食品的粪源性污染卫生细菌学指标,是国际上公认的卫生监测指示菌,因此大肠杆菌的检测技术显得十分重要,并相应出现了大量的大肠杆菌的各种检测方法。本研究阐述了大肠杆菌的几种检测方法,并与传统的检测技术进行了对比。     

食品中大肠杆菌的快速检测方法

大肠杆菌是人及各种动物肠道中的正常寄居菌,食物或水中大肠杆菌的检出意味着直接或间接的近期粪便污染。大肠杆菌作为饮水、食品等的粪源性污染卫生细菌学指标;而且他在外界存活时间与一些主要肠道病原菌相近,它的出现也可能预示某些肠道病原菌（如沙门氏菌、志贺氏菌）的存在。大肠杆菌是国际上公认的卫生监测指示菌,因此大肠杆菌的检测技术显得十分重要,相应出现了大量的大肠杆菌的各种检测方法。     

牛奶中大肠杆菌和无乳链球菌的快速检测

大肠杆菌和无乳链球菌是两种导致奶牛乳房炎的重要致病菌,这两种致病菌的检测有助于及时诊断和治疗奶牛乳房炎,从而有效控制牛奶质量.利用16S-23S rDNA间区作为检测靶点,建立牛奶中大肠杆菌和无乳链球菌的快速PCR检测方法,并对该检测方法的灵敏度和特异性进行了确认.结果显示,该方法对于牛奶中大肠杆菌和无乳链球菌的检出限均能够达到1 cfu/mL,并且与其它7种对照菌株均无交叉反应,整个检测过程可在20 h内完成.     

食品中大肠杆菌生物检测方法的研究进展

大肠杆菌是人类及各种动物肠道中的正常寄居菌,一旦食品、饮用水被检测出含有E.coli就意味着食品可能直接或间接受到了粪便的污染.大肠杆菌是国际上公认的卫生监测指示菌.近年来,由于大肠杆菌引起的食品安全事件频发,严重危害人类健康,研发大肠杆菌快速检测以及防控技术具有重要意义.本文就近几年大肠杆菌感染引发的食品安全事件、生物检测技术等方面的论文做一综述.     

白肋烟晾制期间烟叶中细菌的分离和鉴定

对晾制烟叶中分离到的33株优势菌株进行16S rDNA鉴定,鉴定结果为Pseudomonas、Bacillus、Enterobacter、Rhizobium、Corynebacterium、Pantoea、Acinetobacter、Arthrobacter、Xanthomonas、Paracoccus、Achromobacter、Rhodococcus。经硝酸盐和亚硝酸盐还原能力测定,结果表明:6株不能还原硝酸盐和亚硝酸盐,占总菌株数的18.18%;20株能还原硝酸盐而不能还原亚硝酸盐,占总菌株数的60.61%;7株既可以还原硝酸盐又可以还原亚硝酸盐(2株Rhizobium、1株Paracoccus、4株Pseudomonas),占总菌株数的21.21%,可能是抑制白肋烟叶中TSNA形成的菌株。      

牛奶中抗生素残留检测方法的研究现状

综述了抗生素残留的来源、危害，以及检测抗生素残留的各种方法，包括微生物检测法、理化检验法、免疫法等，指出应用免疫法快速检测试剂盒或生物传感器是今后抗生素残留控制与监督的发展方向．     

Development of a Simple Method for Detecting Presumptive Escherichia coli on Fresh Retail Beef

ABSTRACT: A simple method of detecting Escherichia coli on retail beef was developed. Diluent used in sponge-sampling of meat was added to a tube containing double-strength lauryl sulfate tryptone broth + 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide (X-GlcA) and a Durham tube. Tubes with blue color and gas after 24 h incubation at 35 °C were presumptive-positive. Chi-squared analysis showed a significant ( P < 0.05) relationship between the method and the Petrifilm™ E. coli /Coliform Count Plate method for E. coli in analysis of 66 retail beef samples and the 2 methods had a similar proportion of confirmed isolates (61 and 63%). The method developed is qualitatively comparable to the Petrifilm™ method and provides small-scale beef processors a simple way to monitor sanitary conditions in fabrication and grinding operations.     

肠毒素大肠杆菌K88可视化快速检测方法的建立

本研究通过肠毒素大肠杆菌(E.coli)K88菌毛蛋白的适配体识别,结合纳米金标记和银增强信号放大技术,建立了一种快速、灵敏、特异的E.coli K88可视化快速检测方法。该检测方法是将能与E.coli K88特异性结合的生物素化的适配体1(aptamer 1),与目标菌E.coli K88以及纳米金-巯基化适配体2轭合物(aptamer 2-Au NPs)在一定条件下孵育,形成三明治式的aptamer 1-E.coli K88-aptamer 2-Au NPs复合物,随后通过生物素与亲和素的结合将复合物固定到修饰了链霉亲和素的微孔板上,最后运用银增强显色将反应信号放大。通过对检测方法条件的优化,本方法可特异、定量地检测E.coli K88,在1.0×10~1~1.0×10~5 cfu/孔目标菌范围内,其定量拟合线性曲线决定系数R2可达0.9903,且检测灵敏度达10 cfu/孔,而检测其它非目标菌株均为阴性。本方法为E.coli K88在临床样品中的可视化检测奠定了基础。     

多重PCR-DHPLC检测4种主要致腹泻性大肠埃希氏菌方法的建立与应用

肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)和肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)是引起腹泻、危害食品安全和人类健康的4 种主要大肠杆菌。本实验基于ETEC LT 基因、EPEC bfpA 基因、EHEC O 抗原基因和EIEC 侵袭性质粒基因序列,设计了4 对特异性引物,利用聚合酶链反应(PCR)和变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)技术,通过体系优化,建立了致腹泻性大肠杆菌多重PCR-DHPLC 检测方法,达到同时检测4 种致病菌的目的。该方法灵敏度高,最低检测限为EHEC 6 × 101拷贝/μL、ETEC 1.3 × 102 拷贝/μL、EPEC 9 × 101 拷贝/μL、EIEC 7 × 101 拷贝/μL。特异性试验表明,对22种共41 株细菌进行检测,所试6 株致腹泻性大肠杆菌均为阳性。实践证明,该方法具有良好的实用性,可用于ETEC、EPEC、EHEC 和EIEC 的单一或混合感染的检测。     

产志贺毒素大肠杆菌O26多重双启动寡核苷酸引物-PCR检测方法的建立

为建立一种三重DPO-PCR方法用于食品样品中的产志贺毒素大肠杆菌O26的检测。以志贺毒素stx1和stx2、O抗原基因wzx O26特异性和实际检测效果,设计引物,构建三重DPO-PCR反应体系,进行特异性、灵敏度、模拟样品验证和实际样品验证。结果表明,三对DPO引物对退火温度不敏感,在49~69℃之间均能发生扩增,且引物之间干扰较小,具有较高的特异性,除目的基因外非目标细菌均无扩增条带出现,纯菌灵敏度检测表明,三重DPO-PCR方法对O26的最低检测限为3.8×10^3 cfu/g。在模拟样品和实际样品中具有良好的检测效果。本研究基于DPO引物构建的三重DPO-PCR方法具有效率高,特异性强,不受退火温度限制等优点,可用于食品样品中产志贺毒素大肠杆菌O26的快速准确检测提供一种高效的辅助检测方法。     

甲硫氨酸氨肽酶高通量微型化检测方法的建立

采用甲硫氨酸对硝基苯胺底物检测甲硫氨酸氨肽酶酶活,通过优化甲硫氨酸氨肽酶检测条件提高检测方法的准确性和灵敏性,并在此基础上建立了微型化的检测方法———酶标板法,适应微型化高通量发酵培养对高通量酶活检测的要求,以实现氨肽酶产生菌真正意义上的高通量筛选。优化后的甲硫氨酸氨肽酶酶活微型化检测条件为:氨-氯化铵缓冲液40 mmol/L、pH 8.0、甲硫氨酸对硝基苯胺浓度6 mmol/L、温度60℃、酶反应时间10 min,于380nm波长比色测定。     

检测产志贺毒素大肠杆菌的菌落PCR方法

针对产志贺毒素大肠杆菌的毒力基因stx 设计特异性引物,并建立一种菌落PCR 方法。菌落PCR 模拟实验证实,该方法特异性强,能良好的扩增出O157 的stx1 和stx2 基因,而普通大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌则无PCR 扩增产物。应用分子检测初筛、选择性培养、菌落PCR 相结合的方法,检测实际食品样品,分离检测到一株携带 stx1 的产志贺毒素大肠杆菌。本实验建立的菌落PCR 方法可应用于食品检验。     

荧光PCR检测副溶血性弧菌致病性方法的建立

目的 建立一种准确、快速、特异地检测副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus,VP）致病基因的荧光PCR方法。方法 用7株已知其致病基因的VP标准菌株和检出菌分别对6种VP致病基因荧光PCR检测文献方法和本文建立的方法进行验证比较,并用6种常见食源性病原菌对新建方法的特异性进行检验。结果 所建方法能够同时检测VP的3种溶血素,其检测结果与菌株的溯源结果及普通PCR结果完全一致,且与常见食源性病原菌无交叉反应。结论 本文建立的荧光PCR体系能够准确、快速、特异地检测VP的致病基因,具有较好的实用性。     

乳中志贺氏菌的荧光定量PCR检测方法的建立

为了快速、有效的检测乳中的志贺氏菌,建立一种特异性强、灵敏度高的荧光定量PCR方法。根据GenBank公布的志贺氏菌ipaH基因的保守序列设计特异性引物,对提取的志贺氏菌DNA模板进行PCR扩增,对目的基因进行克隆和测序,然后利用荧光定量PCR方法,对志贺氏菌进行检测,确定其扩增条件。建立的方法特异性强,检测的灵敏度可达到10-6 ng/μL。利用建立的方法可检测乳中2.84 cfu/mL的志贺氏菌。该方法为快速、准确检测乳中的志贺氏菌提供了参考。