人脐带间充质干细胞体外诱导分化为成纤维细胞

背景：脐带间充质干细胞具有多向分化能力,但其向成纤维细胞分化研究较少。目的：验证人脐带间充质干细胞向成纤维细胞的分化能力。方法：采用贴壁法分离脐带间充质干细胞,流式细胞仪分析其表面抗原。取第3代脐带间充质干细胞进行成脂成骨诱导分化,以碱性成纤维细胞生长因子诱导脐带间充质干细胞向成纤维细胞分化。结果与结论：贴壁法能稳定从脐带中分离出干细胞,脐带间充质干细胞极低表达 CD31、CD45、CD40、HLA-DR,强表达 CD29、CD90、CD44、CD105。脐带间充质干细胞成脂诱导后油红O染色显示胞浆中充满红色的油滴;成骨诱导后茜素红染色可在细胞密集区见红色的钙结节。碱性成纤维细胞生因子诱导后细胞表达Ⅰ型胶原明显高于对照组。提示贴壁法分离脐带间充质干细胞可靠、纯度高,碱性成纤维细胞生长因子可诱导脐带间充质干细胞向成纤维细胞分化。     

人脐带间充质干细胞分离培养及向脂肪与成骨细胞的分化

背景:研究报道显示人脐带间充质干细胞体外分离方法及效率、培养条件各不相同,并且尚未有统一的鉴定标准.因此建立高效、经济的培养体系十分必要.目的:建立从人脐带组织分离培养间充质干细胞的方法,并进行向脂肪细胞和成骨细胞的诱导分化.方法:采用组织块贴壁法和酶消化法分离纯化获得人脐带间充质干细胞,取对数生长期的第3代细胞,分析其细胞形态、增随方式和某些免疫表型,并在体外诱导其向脂肪细胞和成骨细胞分化.结果与结论:采用组织块贴壁法和酶消化法均能成功获得贴壁生长的人脐带间充质干细胞,并在体外扩增培养.流式细胞术分析结果显示,人脐带间充质干细胞强表达CD29,CD44,CD59,CD105,阴性表达CD28,CD31,CD34,CD45,CD40,CD86,HLA-DR.人脐带间充质干细胞在适当的诱导条件下能向脂肪和成骨细胞分化,体外能连续传代40次以上,且形态和表型保持稳定.这证实了人脐带组织存在间充质干细胞,且具有向脂肪和成骨细胞分化的潜能,因此将可能成为细胞治疗和组织工程新的种子细胞.     

两性霉素B处理人脐带间充质干细胞的培养与分化

背景：建立和完善避免真菌污染的方法,有效降低采集脐带时分离培养的污染率,以便获得优质高效的脐带间充质干细胞。目的：探讨两性霉素B对脐带间充质干细胞的生长状态及分化潜能的影响。方法：采用胶原酶消化法从正常顺产足月新生儿脐带中分离出间充质干细胞,经两性霉素 B 处理,用MesenPRO RS？培养基进行体外扩增培养。取对数生长期的第3代脐带间充质干细胞,分析其形态、增殖方式和免疫表型,在体外诱导其向成骨和脂肪细胞分化。结果与结论：经两性霉素B处理后,在体外仍能成功分离培养出脐带间充质干细胞。流式细胞术结果显示,人脐带间充质干细胞仍强表达CD44,CD105,CD73,CD90,阴性表达HLA-DR,CD29,CD31,CD34。两性霉素B处理后的人脐带间充质干细胞经体外诱导能向脂肪和成骨细胞分化。     

体外诱导脐血间充质干细胞分化为成骨细胞

背景:脐血间充质干细胞在特定的诱导条件下可以分化成为多种类型的细胞,易于体外培养扩增,但脐血中间充质干细胞的建立时间长、频率低是其主要缺点.目的:体外分离培养脐血间充质干细胞,并诱导其向成骨细胞方向分化.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008 06/2009 01在青岛大学医学院试验室完成.材料:脐血取自足月正常分娩的产妇,由青岛市立医院妇产科提供.方法:采用percoll密度梯度法体外分离培养人脐血间充质干细胞,当细胞汇合90%单层细胞后胰蛋白酶消化传代.取第3代脐血间充质干细胞,以1×106密度接种,当细胞达50%～60%融合时,加入含0.1 μmol/L地塞米松、10mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L维生素C的DMEM成骨细胞诱导液;对照组加入普通低糖DMEM培养液培养.主要观察指标:倒置显微镜下观察细胞生长及增殖情况,流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达,细胞生长曲线分析,透射电镜观察细胞超微结构,von Kossa染色和碱性磷酸酶染色检测向成骨细胞诱导分化情况.结果;原代培养的脐血间充质干细胞形态与骨髓间充质干细胞相似,传代后细胞形态均一,呈梭形旋涡状排列.第3代脐血间充质干细胞高表达CD29,CD44,CD13,不表达CD34.生长潜伏期为两三天,第三四天进入对数增殖期,1个月后进入平台期.胞核呈类圆形或不规则形,核膜清晰,有一两个核仁,染色质较粗,胞质中细胞器丰富,细胞表面有微绒毛.第3代脐血间充质干细胞成骨诱导7 d后逐渐汇合呈铺路石状,14 d后von Kossa染色出现钙化结节,碱性磷酸酶染色呈阳性;对照组未见钙化结节,碱性磷酸酶染色呈阴性.结论:采用percoll密度梯度法可成功从人脐血中分离出间充质干细胞,并在体外诱导分化为成骨细胞.     

人脐带间充质干细胞低温冻存后生物学鉴定

目的观察人脐带间充质干细胞(HUC-MSCs)经低温冻存复苏后的生物学特性,验证其是否仍具有间充质干细胞的基本特征。方法用胶原酶和胰蛋白酶消化脐带,分离诱导获得HUC-MSCs,传代培养,取第3代细胞加入冷冻保护剂(10%DMSO+40%FBS+50%DMEM/F12)后将其冻存于-80℃冰箱过夜,再转入液氮气相中保存1个月后复苏。采用倒置显微镜观察复苏后贴壁生长细胞的形态;台盼蓝拒染法比较冻存前后细胞活力;MTT法测定HUC-MSCs的增殖活性,比较冻存前后HUC-MSCs增殖活性的差异;流式细胞仪检测HUC-MSCs经冻存复苏后表面抗原的表达情况;复苏后HUC-MSCs进行成骨诱导分化培养,检验其是否仍具有多向分化潜能。结果 HUC-MSCs经低温保存复苏后,细胞仍保持贴壁生长等外形特征,复苏后HUC-MSCs存活率为91.17%;增殖活性与未冻存细胞比较,差异无统计学意义;细胞表面高表达CD105、CD73、CD71、CD90、CD29、CD44、CD13抗原,低表达或不表达CD34、CD133、CD45、CD14,HLA-DR、CD86、CD83、CD80、CD1α;复苏后HUC-MSCs具有向成骨细胞诱导分化能力,细胞经茜素红、ALP和Von-Kossa′s染色呈阳性反应。结论经冻存复苏后的HUC-MSCs保持了间充质干细胞的基本形态,其表型满足间充质干细胞的基本要求,仍具有向成骨细胞分化的潜能。     

体外分离培养人源性脂肪间充质干细胞及其鉴定

目的 体外分离培养人皮下脂肪来源的细胞群,依据国际标准规定通过形态观察、免疫表型检测及多种分化潜能的鉴定证实体外获得的细胞群为脂肪来源的间充质干细胞.方法 采用0.1％胶原酶Ⅰ及0.25％胰酶双消化法进行细胞的体外分离,LG-DMEM培养基加入体积分数为10％胎牛血清,于37℃、5％ CO2的饱和湿度条件下培养,待细胞生长至70％ ～ 80％融合时消化传代扩增.通过倒置显微镜观察细胞形态;流式细胞仪检测细胞免疫表型表达;取第3代细胞,于培养基中分别加入成骨及成脂诱导剂进行定向诱导分化,并对诱导后的细胞染色鉴定.结果 分离培养的细胞群呈长梭状,漩涡样贴壁生长;流式细胞仪检测P2代细胞,其中CD73,CD105,C90,CD44,CD29及CD49d呈阳性表达,而CD14,CD34,CD45,HLA-DR及CD106呈阴性表达;成骨诱导3周后,茜素红染色、VON-KOSSA染色及细胞碱性磷酸酶染色都呈阳性;成脂诱导2周后,细胞内有小脂滴出现,油红O染色呈阳性.结论 胶原酶胰酶双消化法从脂肪组织中分离获得的细胞可贴壁生长;流式细胞仪检测证实细胞表达与间充质干细胞相符的免疫表型;定向诱导后具有成骨及成脂分化能力;符合间充质干细胞的特性.     

人脐带间充质干细胞分离培养鉴定及诱导分化实验

目的 建立人脐带间充质干细胞(MSCs)分离培养方法,并进行生物学鉴定及定向诱导分化研究。方法 采用酶消化Wharton胶法体外分离培养人脐带干细胞,通过流式细胞仪分析其表面标记分子,并向成骨、成脂方向诱导分化,钙钴法染色检测ALP,茜素红染色检测矿化结节,油红“O”染色检测脂肪滴,进行干细胞的成骨成脂活性鉴定。结果 分离培养的脐带间充质干细胞CD73,CD90和CD105均表达阳性,阳性率为92.45%,95.45%和96.45%,CD34表达阴性,阳性率仅为1.07%。成骨诱导3周后ALP染色胞质内可见黑色颗粒,4周后可见大量矿化结节。成脂诱导2周后细胞内出现大量脂肪小滴,多数细胞形态变圆,油红“O”染色阳性。结论 脐带来源的间充质干细胞具有成骨、成脂多向分化潜能,为临床干细胞治疗研究的种子细胞来源奠定了基础。     

脐带沃顿胶间充质干细胞的分离培养及其诱导分化

背景:骨髓是目前间充质干细胞的丰要来源,但由于取材不便、细胞数量受年龄限制等原因,其应用具有一定局限性.近年来,脐带作为阈充质干细胞的新来源已经得到广泛关注.目的:探讨从人脐带沃顿胶中分离、扩增间充质干细胞的方法,鉴定其免疫表型与分化潜能.方法:种植法分离和扩增间充质干细胞:用FasGrow培养基培养,光镜观察获得的人脐带沃顿胶间充质干细胞的形态:免疫组织化学方法检测其免疫表型:Gomori钙钴碱性磷酸酶染色、von Kossa钙结节染色、四环素荧光标记鉴定其向成骨方向分化的能力及油红O染色鉴定其向成脂肪分化的能力.结果与结论:种植法容易从人脐带沃顿胶中获得间充质干细胞;原代培养后12-16 d达70%～80%融合,传代后可维持未分化状态并稳定增殖;细胞倍增时间为2 d左右,体外增殖达20代以上:表面标记分析显示:CD44、CD105、CD133、MHC-1呈阳性,CD34、CD45呈阴性;体外诱导实验表明:该细胞具有体外成脂肪、成骨和神经样细胞分化的能力.     

人脐带间充质干细胞体外长期培养及向肝样细胞的分化

目的:观察人脐带间充质干细胞体外长期培养的生物学特性,探讨其向肝样细胞分化的可能性.方法:脐带来源于天津市第三中心医院住院的健康足月产妇,采用酶消化法分离培养人脐带间充质干细胞,待细胞生长至80%-90%融合时传代.取传至第9代细胞接种于12孔板内,调整细胞浓度为5×10~(10)L~(-1),加入含肝细胞生长因子、成纤维生长因子4、抑瘤素的DMEM培养基,诱导28 d.MTT法测定细胞生长活性,流式细胞仪检测细胞周期,免疫细胞化学及流式细胞仪鉴定细胞表型;免疫细胞化学染色鉴定诱导后肝细胞特异表面标志物的表达,以及糖原染色结果.结果:从人脐带中分离得到的间充质干细胞贴壁生长,形态类似于成纤维细胞,80%以上处于G_0/G_1期,具有良好的生长活性,可在体外稳定传代20次以上;CD29,CD90,CD105,Vimentin呈阳性表达,基本不表达造血细胞标志CD34和内皮细胞标志CD31.随诱导时间的延长,圆形细胞逐渐增多,形态似肝细胞;诱导1周时细胞开始表达肝细胞表面标志物甲胎蛋白、细胞胶蛋白18、细胞胶蛋白19;诱导3周时开始表达成熟肝细胞标志白蛋白;诱导4周时白蛋白表达增强,且诱导细胞糖原染色呈阳性.结论:从人脐带中可成功分离出间充质干细胞,实现体外长期培养,并可诱导分化为肝样细胞.     

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养及多向诱导分化

背景:间充质干细胞不仅自身免疫原性弱,还可以调节细胞免疫功能,减轻移植物排斥反应,在组织工程中具有良好的应用前景.但骨髓中间充质干细胞含量稀少,约占单个核细胞的十万分之一到百万分之一.目的:建立一种分离、培养扩增兔骨髓间充质干细胞的方法,观察体外培养骨髓间充质干细胞的生长特性,及其潜在的诱导分化能力.方法:采用灌流法获取兔胫骨骨髓,密度梯度离心法联合贴壁培养法体外纯化扩增,相差显微镜观察其形态学特点,MTT法测定绘制传代骨髓间充质干细胞生长曲线,经成骨诱导液(L-DMEN/F12,体积分数为10%胎牛血清,0.1 μmol/L地塞米松,200 μmol/L抗坏血酸,10 mmol/L β-甘油磷酸钠)、成脂诱导液(L-DMEN/F12,体积分数为10%胎牛血清,1 μmol/L地塞米松,200 μmol/L吲哚美辛,0.5 mmol/L IBMX,10 mg/L胰岛素)、成软骨诱导液(L-DMEN/F12,体积分数为10%胎牛血清,10 μg/L转化生长因子β1,0.1 μmol/L地塞米松,50 μmol/L抗坏血酸,6.25 mg/L胰岛素)体外诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞分化,并分别经碱性磷酸酶染色、油红O染色和甲苯胺蓝染色法鉴定.结果与结论:通过密度梯度离心法联合贴壁培养法可在体外大量扩增、纯化骨髓间充质干细胞,所获细胞具有高度自我更新能力和多向分化潜能,原代及传代骨髓间充质干细胞为梭形.经成骨细胞诱导,细胞碱性磷酸酶染色阳性;经成脂肪细胞诱导,细胞内出现红色脂滴,经成软骨细胞诱导,甲苯胺蓝染色阳性.     

脐带间充质干细胞的体外分离及生物学特性观察

背景:脐带组织依赖于母体免疫系统的保护,且胚胎自身免疫系统相对不发育、MHC表达低下,故来源于脐带的间充质干细胞的生物学特性已成为目前研究热点.目的:拟在体外分离培养人脐带组织间充质干细胞,并观察其多向分化能力.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-10/2007-05在四川大学组织工程重建实验室完成.材料:脐带来源于胎龄37～40周的健康新生儿,由四川大学华西第二医院产房提供.方法:取脐带沿血管长轴切开,去掉血管,再将脐带重新缝合形成环状,灌入胶原酶悬液,6～8 h后灌洗离心,获取细胞后贴壁法分离培养、扩增,细胞呈集落生长后传代.取传至第5代细胞,分别加入成骨、成脂诱导分化培养基.主要观察指标:脐带间充质干细胞的形态、生长状况、表面抗原分子的表达、多向分化潜能.结果:去除血管后获取脐带组织细胞的方法可获得贴壁生长的细胞,呈短棒状或梭形样细胞,易扩增和形成集落;高表达基质细胞抗原CD29,CD51,CD71,而不表达CD34,CD45及HLA-DR等造血干细胞抗原分子;成骨诱导后茜素红染色胞浆中有大量的钙沉积,碱性磷酸酶钙钴法染色胞质呈灰黑色,阳性细胞率＞85%;成脂诱导后油红O染色示胞浆充满油滴空泡.结论:脐带组织存在具有分化能力的间充质干细胞,并可在体外进行培养扩增形成集落细胞传代,传代细胞表达基质细胞表面抗原,能够向成骨细胞、成脂肪细胞方向分化.     

体外诱导人脐带间充质干细胞分化为许旺细胞

背景:人脐带Wharton’s Jelly源间充质干细胞避免了伦理的限制,来源丰富,可以作为种子细胞进行组织修复。目的:观察体外诱导脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞向许旺细胞分化的可行性。方法:分离、培养脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞,流式细胞术鉴定细胞表面标志。利用神经细胞培养基、碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、维甲酸、血小板源性生长因子等采用两步法将脐带间充质干细胞诱导分化为许旺细胞,倒置显微镜下观察细胞形态变化。利用免疫细胞化学染色法检测巢蛋白、S-100、纤维酸性蛋白的表达,反转录-聚合酶链反应、免疫印记技术检测许旺细胞特异性蛋白产物表达。结果与结论:脐带细胞培养第7天形态发生变化,部分细胞变成梭形。原代细胞培养10d左右可达80%～90%融合,细胞呈梭形。分离培养的细胞表达具有间充质干细胞表面特有标志:CD44(91.4%),CD29(91.3%),CD105(99.2%),不表达CD34(0.2%),CD45(0.9%),CD14(0.6%)。脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞经第一阶段诱导后,细胞由短梭形变成长梭形或纺锤形,并出现聚集现象,由形状规则、表面圆滑的球形细胞团形成。第二阶段诱导后,有长梭形细胞从球形细胞团爬出,96h后细胞形态多为长梭形,伴有多极现象。免疫细胞化学染色结果示:长梭形多极细胞具有许旺细胞特异的纤维酸性蛋白、S100蛋白染色。结果表明脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞可在体外诱导分化为许旺细胞。     

确证家兔外周血中存在具有多向分化能力的间充质干细胞

本研究确证家兔外周血中存在具有多向分化潜能的间充质干细胞（MSC）。取成年新西兰大白兔,经每日皮下注射粒细胞集落刺激因子30μg/kg动员6d后采集外周血样品,用Ficoll密度梯度离心和贴壁培养法分离纯化外周血间充质干细胞（PBMSC）,镜下观察其生长形态并绘制增殖曲线;流式细胞术分析其表型特征;并分别对培养的PBMSC进行成骨、成软骨及成脂细胞诱导分化能力鉴定。结果表明：①原代培养24h后,可见较多短梭形及多角形贴壁细胞,3-4d后出现集落样生长,传代培养的PBMSC形态均一、呈长梭形漩涡状生长;②PBMSC增殖能力旺盛,培养2d后进入对数生长期,细胞倍增时间为37．4h;③流式细胞术检测显示,培养的PBMSC高表达CD29,不表达CD14;④PBMSC经成骨诱导培养21d后,茜素红染色显示有明显的钙结节形成;经微团无血清软骨培养体系诱导培养21d后,细胞团切片,阿利新蓝染色呈强阳性反应;经成脂诱导培养21d后,油红染色显示诱导细胞胞浆内有大量脂滴。结论：成功从兔外周血中分离培养了PBMSC,在适宜诱导培养条件下具有向成骨、成软骨、成脂分化的能力。     

体外诱导人脐带间充质干细胞分化为许旺细胞

背景：人脐带Wharton’s Jelly源间充质干细胞避免了伦理的限制,来源丰富,可以作为种子细胞进行组织修复。目的：观察体外诱导脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞向许旺细胞分化的可行性。方法：分离、培养脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞,流式细胞术鉴定细胞表面标志。利用神经细胞培养基、碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、维甲酸、血小板源性生长因子等采用两步法将脐带间充质干细胞诱导分化为许旺细胞,倒置显微镜下观察细胞形态变化。利用免疫细胞化学染色法检测巢蛋白、S-100、纤维酸性蛋白的表达,反转录-聚合酶链反应、免疫印记技术检测许旺细胞特异性蛋白产物表达。结果与结论：脐带细胞培养第7天形态发生变化,部分细胞变成梭形。原代细胞培养10d左右可达80%～90%融合,细胞呈梭形。分离培养的细胞表达具有间充质干细胞表面特有标志：CD44（91.4%）,CD29（91.3%）,CD105（99.2%）,不表达CD34（0.2%）,CD45（0.9%）,CD14（0.6%）。脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞经第一阶段诱导后,细胞由短梭形变成长梭形或纺锤形,并出现聚集现象,由形状规则、表面圆滑的球形细胞团形成。第二阶段诱导后,有长梭形细胞从球形细胞团爬出,96h后细胞形态多为长梭形,伴有多极现象。免疫细胞化学染色结果示：长梭形多极细胞具有许旺细胞特异的纤维酸性蛋白、S100蛋白染色。结果表明脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞可在体外诱导分化为许旺细胞。     

人血小板裂解液替代胎牛血清大规模扩增人脐带间充质干细胞

背景：目前国内外大多数实验仍采用经典的培养基和胎牛血清进行脐带间充质干细胞培养,血清培养潜在的不安全因素限制了未来临床应用的可行性。目的：以人血小板裂解液替代胎牛血清培养、鉴定人间充质干细胞,以期进一步应用于临床低密度扩增人间充质干细胞。方法：人血小板裂解液通过反复冻融、离心、过滤、浓缩等方法制备。以 IMDM 为基础培养基,添加5%浓缩血小板裂解液作为实验组培养基;以添加体积分数10%胎牛血清为对照组培养基。采用酶消化法分离培养人脐带间充质干细胞,以3000/cm2的浓度进行传代培养,待细胞扩增至P5代后,进行细胞形态与直径、免疫表型、成骨成脂分化、克隆形成率等细胞生物学特性检测,并比较两者之间的差别。结果与结论：人血小板裂解液扩增的脐带间充质干细胞形态细长,有更高的细胞累积群倍数;克隆形成检测结果显示两者形成的克隆效率差异无显著性意义,流式细胞术检测结果显示两者有相似的细胞表型,体外诱导分化显示两者都具有成骨、成脂分化能力,但人血小板裂解液扩增的间充质干细胞成骨分化能力更强。提示人血小板裂解液可以取代胎牛血清用于临床低密度扩增人间充质干细胞。     

脐血血浆替代胎牛血清培养脐带间充质干细胞及冷冻保存

背景：采用胎牛血清扩增培养及冷冻保存的间充质干细胞,在临床应用中存在一定的风险。目的：探讨以脐血血浆替代胎牛血清体外分离培养、扩增及冷冻保存脐带间充质干细胞的可行性。方法：选择符合广州脐血库供者合格性筛选标准的脐血,收集脐血干细胞制备过程中去除的血浆,经病原学及微生物检测合格,多份混合用于细胞培养。采用酶消化法从健康足月分娩新生儿的脐带组织分离获得脐带间充质干细胞,分为两组,分别以DMEM/F12为基础培养基,添加胎牛血清或混合脐血血浆,经培养扩增后,采用流式细胞仪检测细胞免疫表型,并进行间充质干细胞成骨、成脂分化鉴定。在含有10%二甲基亚砜的DMEM/F12培养基中,分别添加体积分数为20%的胎牛血清或混合脐血血浆作为冷冻保存液,对扩增至第3代的细胞冷冻保存至6个月以上,观察复苏后细胞的活率、贴壁情况、增殖、免疫表型及向成骨细胞分化的能力。结果与结论：两种培养体系下的脐带间充质干细胞均呈现典型的梭形漩涡状生长,间充质干细胞免疫表型的表达谱系基本无差异,均具有成骨、成脂分化的能力,但脐血血浆培养条件下细胞的增殖速度显著高于胎牛血清。冻存复苏后的细胞可正常贴壁,且具有向成骨细胞分化的能力,采用脐血血浆冻存的细胞具有更高的贴壁效率及扩增能力。上述结果表明,脐血血浆可以替代胎牛血清用于脐带间充质干细胞的扩增培养及冷冻保存,并维持了间充质干细胞的基本生物学特性,是大量扩增间充质干细胞用于临床治疗较为安全的选择。     

诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞和成软骨细胞分化

目的探讨小香猪骨髓间充质干细胞(MSC)向成骨细胞和成软骨细胞诱导分化的能力。方法选用早期贴壁培养的小香猪骨髓MSC,在传代两三次后加入条件培养基,观察了细胞的形态学变化,同时检测碱性磷酸酶、钙盐沉积以及细胞外基质和II型胶原的表达。结果MSC在骨形成蛋白(BMP)、地塞米松和β-磷酸甘油钠的作用下,两三天细胞从梭形变为圆形或类圆形,细胞体积增大,12～15d时细胞集落的表面可见有颗粒状物质分泌,碱性磷酸酶染色为阳性,20～25d时,分泌颗粒更加明显,核固红染色为阳性,表现出成骨细胞的特点;在培养体系中加入地塞米松和转化生长因子-β1后两三天,可见细胞由类成纤维状变为圆形或椭圆形状,有的呈肾性,体积增大,10d后可见细胞周围有基质分泌,II型胶原染色为阳性,表现为软骨细胞分化的特点。结论在一定培养条件下成功诱导小香猪骨髓MSC向成骨细胞和成软骨细胞分化,为我们进一步的研究打下基础。     

人脐带间充质干细胞诱导分化为心肌细胞的特异性基因表达

背景：脐带来源的间充质干细胞进行自体心肌内移植,修复损伤心肌组织,是心血管研究领域的热点。目的：应用5-氮胞苷诱导人脐带间充质干细胞转化为心肌样细胞后进行鉴定,以确定心肌样细胞的结构、形态和功能。方法：分离培养人脐带间充质干细胞,在第2代细胞中分别加入浓度为2.5,5,10,20,40,80μmol/L 的5-氮胞苷,作用24 h 后除去,继续培养4周。结果与结论：5-氮胞苷诱导前,无细丝样结构、无颗粒,胞浆量均匀且少,核/浆比例高,细胞形态呈现典型的梭形,细胞呈漩祸样或同心圆生长,核内会见到较为明显的核仁;在5-氮胞苷处理24 h 之后,各组细胞都会出现部分死亡,失去典型的梭形形态,成为棍状或者柱状,40,80μmol/L 组细胞形态变化明显。反转录-聚合酶反应检测2.5,40μmol/L 组诱导4周,5,10,20μmol/L 组诱导1,2,3,4周时人脐带间充质干细胞心钠素、α-骨骼肌动蛋白基因表达呈阳性。提示经5-氮胞苷诱导的人脐带间充质干细胞表达心肌细胞的特定基因。     

人脐带间充质干细胞冻存复苏后的生物学特征

背景:冻存脐带间充质干细胞,并有效地保持其生物学特性,是储存脐带间充质干细胞以供临床使用的重要工艺之一.目的:观察冻存后脐带间充质干细胞的生物学特性,验证其是否仍具有间充质干细胞的基本特征.方法:从脐带分离得到间充质干细胞后,将其冻存于液氮之中.比较经冻存复苏后的脐带间充质干细胞和新鲜制各的脐带间充质干细胞活率、抑制人外周血单个核细胞分泌γ-干扰素等方面的异同.检验经冻存复苏后的脐带间充质干细胞是否具有多向分化潜能,其表型是否满足间充质干细胞的基本特征.结果与结论:在细胞活率和抑制人外周血单个核细胞分泌γ-干扰紊方面,冻存和新鲜的脐带间充质干细胞差异无显著性意义.经冻存复苏后的脐带间充质干细胞保持了间充质干细胞的基本形态,其表型满足间充质干细胞的基本要求,具有多向分化的潜能.     

肝细胞生长因子与成纤维生长因子联合诱导人脐带间充质干细胞向肝样细胞的分化

背景：成纤维生长因子可促进间充质干细胞增殖、贴壁生长,但对其诱导间充质干细胞向肝细胞分化的实验报道为数不多。当肝细胞生长因子质量浓度达1μg／L时,可促进肝细胞有丝分裂,它是正常肝细胞最强的促有丝分裂剂。 目的：体外分离培养人脐带间充质干细胞,拟揭示其生物学特性及在细胞因子联合诱导下向肝样细胞分化的能力。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008—08／2009-04在暨南大学血研所完成。 材料：脐带取自健康足月胎儿,产妇对实验知情同意,由广州华侨医院提供。肝细胞生长因子、成纤维生长因子为美国Peprotech产品。 方法：Ⅳ型胶原酶消化＋差速贴壁法分离培养人脐带间充质干细胞,取传至第3代细胞,进行细胞表面抗原分析、细胞周期测定,检测其成脂、成骨能力。取第5代细胞,调整细胞密度为5×10^9L^-1,分为2组：对照组用含体积分数为5％胎牛血清的DMEM／F12培养液培养：诱导组在其基础上,添加20μg／L肝细胞生长因子、10μg／L成纤维生长因子联合诱导其向肝样细胞分化。 主要观察指标：人脐带间充质干细胞的生物学特性,人脐带间充质干细胞体外向肝样细胞的分化情况。 结果：成功从人脐带中分离并纯化得到间充质干细胞,第3代细胞92．2％处在G0/G1期：表达CD29,CD44,CD105,不表达造血细胞标志CD34,CD45．油红O染色后胞浆中呈现红色颗粒,碱性磷酸酶染色后细胞质呈黑色,具有成脂、成骨能力。经肝细胞生长因子、成纤维生长因子联合诱导10d后,RT-PCR及Western blot检测结果显示细胞表达肝细胞特异性抗原甲胎蛋白、白蛋白,对照组均呈阴性表达。 结论：人脐带中含有丰富的间充质干细胞,其具有较强的多向分化潜能,经肝细胞生长因子与成纤维生长因子联合诱导后,易向肝样细胞分化。