家蝇幼虫抗菌肽Attacin基因的克隆表达及抑菌生物学活性

目的克隆家蝇幼虫Attacin抗菌肽基因．构建原核融合表达载体,建立Attacin体内抗菌活性检测系统,优化表达和纯化Attacin目的蛋白,并初步研究其抗菌生物学功能。方法以pUC m-T／Attacin重组质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增Attacin编码区序列,分别克隆至原核表达载体pET30a（＋）和pGEX-4T-1。构建原核重组质粒,转化大肠埃希菌,表达重组Attacin蛋白,并在大肠埃希菌中体内检测Attacin的抗菌活性。利用亲和层析柱纯化重组融合蛋白Attacin,SDS-PAGE进行纯度分析,琼脂糖平板抑菌试验鉴定其生物活性。结果pET30a（a＋）／Attacin和pGEX-4T—1／Attacin重组质粒分别转化大肠埃希菌后,以IPTG诱导表达,与未诱导对照相比,含有重组质粒的宿主菌生长受到抑制。从pET30a（＋）／Attacin重组质粒的表达宿主菌中未能获得His-Attacin融合蛋白,而从pGEX-4T—1／Attacin重组质粒转化菌种获得GST-Attacin融合蛋白。SDS-PAGE分析表明Attacin重组蛋白分子量与预期结果一致,琼脂糖平板抑菌试验显示重组Attacin具有抗菌活性。结论Attacin基因在原核系统中成功表达,并且纯化后具有抑菌活性,为下一步研究Attacin的生物学功能及其应用开发奠定了基础。     

家蝇抗菌肽Cecropin-His_6融合基因的克隆、序列分析及其表达载体构建

克隆家蝇幼虫抗菌肽Cecropin -His 6融合基因 ,构建其真核表达载体 ,为更深入的抗菌肽活性研究及制备新型肽类抗生素创造条件。该文从家蝇幼虫组织中提取总RNA ,RT -PCR扩增编码Cecropin开放阅读框cDNA序列 ,将其克隆至pUCm -T载体进行序列测定 ;然后用含 6×His标签序列的下游引物克隆Cecropin -His 6融合基因 ,并将其构建于真核表达载体pcDNA3.1( )中 ;同时应用生物信息学对融合基因的理化性质和二级结构进行预测分析。结果表明 ,RT -PCR扩增得到约 2 30bp的目的cDNA片段 ,与Genebank中报道的家蝇CecropincDNA序列存在一个无义变异差异 (Lys:AAG→AAA) ;6×His标签成功融合到Cecropin的C端。Cecropin -His 6融合基因的克隆和真核表达载体的成功构建 ,为进一步制备抗耐药菌的肽类抗生素奠定了基础。     

家蝇抗菌肽的抑菌动力学研究及其机理初探

利用鼠伤寒沙门氏菌针刺诱导家蝇幼虫表达抗菌肽,对抗菌肽的抑菌动力学进行研究,并通过抗菌肽样品对不同细菌动力学特性的研究出发对抗菌肽抑菌作用机制进行探讨。研究发现抗菌肽样品的活性与作用时间有关,24h内出现一到两个活性峰,同一抗菌肽样品对不同细菌的抑菌动力学有差异,抗菌肽的抑菌动力学机制应该与它的的抑菌作用机制有关。通过电镜观测、细胞磷代谢、紫外吸收物测定以及抗菌肽与细菌DNA相互作用结果可知,微生物诱导家蝇表达的抗菌肽样品不仅能够造成细菌细胞的快速坍塌破裂而且能够破坏细胞核心,与DNA结合作用。抗菌肽抑菌动力学的解释：微生物诱导产物中含有两类抗菌肽,一类抗菌肽能造成细胞膜的快速坍塌破裂形成第一个活性峰;另一类抗菌肽可进入细胞,破坏细胞核心,造成紫外吸收物大量外泄形成第二个活性峰。     

家蝇抗菌肽MDC对鼠伤寒沙门氏菌的抑菌稳定性研究

以鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)作为研究对象,探讨家蝇抗菌肽(Musca domestica cecropin,MDC)在不同条件下的抑菌稳定性。采用牛津杯法研究pH值、温度、光照、蛋白酶、金属离子、表面活性剂及有机试剂对MDC抑菌活性(抑菌圈大小)的影响。在酸性条件下MDC的抑菌活性稍有下降,保持在85%左右,但在碱性条件下的抑菌活性无明显改变,稳定性较好。经低温和高温处理后,抑菌活性无显著差异。MDC在黑暗、正常光及紫外线照射处理30 min,其抑菌活性仍保持稳定。MDC对胰蛋白酶敏感,抑菌活性完全消失,而对胃蛋白酶具有良好的稳定性。MDC对Ca²⁺、K⁺有良好的稳定性,但对Mg²⁺敏感,在Fe³⁺作用下其抑菌活性较对照组有所升高(P<0.05)。表面活性剂和有机试剂处理MDC后,其抑菌活性均明显降低。家蝇抗菌肽MDC能显著抑制鼠伤寒沙门氏菌生长繁殖,其活性几乎不受pH值,温度和光照变化、胃蛋白酶和某些金属离子的影响,且Fe³⁺能够协同...     

家蝇抗菌肽AMPs17蛋白原核表达条件的优化及其抗真菌活性检测

目的:优化AMPs17重组蛋白的原核表达条件,分析重组蛋白的抗真菌活性。方法:比较不同的诱导温度(25℃、28℃、30℃、32℃、34℃)、异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导浓度(0. 025mmol/L、0. 05mmol/L、0. 1mmol/L、0. 3mmol/L、0. 5mmol/L、0. 8mmol/L、1. 0mmol/L)和诱导时间(12h、15h、18h、21h、24h)对AMPs17重组蛋白表达量的影响,筛选AMPs17重组蛋白的最佳表达条件;采用镍离子金属螯合剂亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,SDS-PAGE和ImageJ图像分析系统对表达结果进行分析,Western blot对AMPs17重组蛋白进行鉴定,高效液相色谱分析重组蛋白的纯度,微量液体稀释法及菌落计数法检测其抗真菌活性。结果:在诱导温度为32℃、IPTG浓度为0. 05mmol/L的条件下诱导培养15h,AMPs17重组蛋白的表达量最高且最为稳定;HPLC色谱仪分析显示AMPs17重组蛋白纯度可达到90%以上;优化后的AMPs17重组蛋白能有效抑制白色念珠菌的生长。结论:优化了家蝇抗菌肽AMPs17的诱导表达条件,获得了高表达、稳定且具有抗真菌活性的蛋白质,为后续抗菌机制及应用研究提供一定的实验基础。     

杂合抗菌肽在毕赤酵母中的表达及其活性测定

为获得溶血活性低、抗菌活性高的杂合抗菌肽,以家蝇抗菌肽Cec Md和中国林蛙抗菌肽Chensirin为母体肽,并结合毕赤酵母偏爱密码子的原则,设计出6条具有抗菌潜力的新型杂合抗菌肽,将其命名为CC22、CC28、CC29、CC30和CC34(1),CC34,利用SOE-PCR技术合成所需的目的基因,并将其克隆至毕赤酵母表达载体pGAPZαA,通过电击转化技术,将其转化至毕赤酵母SMD1168中,经含有Zeocin的抗性平板筛选阳性转化子,YPD液体培养72h后,经Tricine-SDS-PAGE检测出目的蛋白,然后采用高效液相色谱法对其进行纯化。检测结果显示,表达产物CC29对大肠杆菌、鸡沙门氏菌的最小抑菌浓度(MIC)均为25μg/ml;CC34(1)对大肠杆菌表现相对较弱的抑制作用,最小抑菌浓度为100μg/ml;CC34对鸡沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为50μg/ml;且杂合抗菌肽对有益菌均没有表现出抑制作用。6条杂合肽的溶血活性均呈现较低水平,其中表现出抗菌活性的3条抗菌肽中,以CC29的溶血活性最低,CC34(1)和CC34相对次之。结合抑菌活性,CC29和CC34的抑菌效果较为明显,从而确定溶血活性低且抗菌活性较高的CC29和CC34为新型杂合抗菌肽。     

人源抗菌肽LL-37的原核表达及活性鉴定

目的:实现大肠杆菌高效可溶表达人源抗菌肽LL-37。方法:LL-37基因克隆至原核载体pET32a,于大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。运用相关生物信息学软件分析重组蛋白Trx-LL-37的理化性质、亲/疏水性、蛋白质二级结构及其可溶表达概率。实验还考察了不同诱导温度对重组蛋白可溶表达比例的影响。结果:生物信息学分析显示,Trx-LL-37分子量21.5kD,理论等电点6.3,物理性质稳定,二级结构简单,具有可溶表达倾向。重组蛋白最佳诱导温度为17℃,与37℃相比,可溶表达比例由37.2%提高至50.2%,并且总表达量也提高了5%左右。抑菌结果显示纯化产物对多种常见细菌的生长具有抑制作用。结论:可采用融合方式通过原核系统高效可溶表达LL-37,为LL-37的功能研究打下基础。     

家蝇抗菌肽基因MAF-1的表达模式及响应微生物刺激分析

Musca domestica antifungal peptide-1(MAF-1)是家蝇体(Musca domestica)内组成型表达的一种独特且具有良好抑菌效果的抗真菌肽.本研究利用实时荧光定量PCR技术分析MAF-1在家蝇不同发育时期、不同组织器官及家蝇3龄幼虫经微生物(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌)刺激后的表达特征.结果显示,MAF-1在家蝇各个发育时期的相对表达量依次为:2龄幼虫＞1龄幼虫＞3龄幼虫＞雄蝇成虫＞卵＞雌蝇成虫＞蛹;MAF-1在家蝇3龄幼虫各组织器官的相对表达量依次为:脂肪体＞唾液腺＞气管＞肠道＞体壁.通过超微量显微注射法向家蝇3龄幼虫体内注入病原微生物,其中金黄色葡萄球菌刺激后MAF-1的表达量呈下降趋势;大肠杆菌刺激后MAF-1的表达量先降低后升高再降低;白色念珠菌刺激后MAF-1的表达量先升高然后逐渐下降.本研究从RNA水平上说明了MAF-1的表达随着家蝇幼虫的生长发育阶段变化,对不同微生物刺激的响应具有不同的特征.同时MAF-1还是家蝇抵抗病原微生物感染的重要天然免疫分子,这为进一步研究其参与家蝇天然免疫防御过程提供了基础.     

家蝇抗菌肽基因MAF-1的表达模式及响应微生物刺激分析

Musca domestica antifungal peptide-1(MAF-1)是家蝇体(Musca domestica)内组成型表达的一种独特且具有良好抑菌效果的抗真菌肽.本研究利用实时荧光定量PCR技术分析MAF-1在家蝇不同发育时期、不同组织器官及家蝇3龄幼虫经微生物(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌)刺激后的表达特征.结果显示,MAF-1在家蝇各个发育时期的相对表达量依次为:2龄幼虫＞1龄幼虫＞3龄幼虫＞雄蝇成虫＞卵＞雌蝇成虫＞蛹;MAF-1在家蝇3龄幼虫各组织器官的相对表达量依次为:脂肪体＞唾液腺＞气管＞肠道＞体壁.通过超微量显微注射法向家蝇3龄幼虫体内注入病原微生物,其中金黄色葡萄球菌刺激后MAF-1的表达量呈下降趋势;大肠杆菌刺激后MAF-1的表达量先降低后升高再降低;白色念珠菌刺激后MAF-1的表达量先升高然后逐渐下降.本研究从RNA水平上说明了MAF-1的表达随着家蝇幼虫的生长发育阶段变化,对不同微生物刺激的响应具有不同的特征.同时MAF-1还是家蝇抵抗病原微生物感染的重要天然免疫分子,这为进一步研究其参与家蝇天然免疫防御过程提供了基础.     

家蝇抗菌肽基因MAF-1的表达模式及响应微生物刺激分析

Musca domestica antifungal peptide-1(MAF-1)是家蝇体(Musca domestica)内组成型表达的一种独特且具有良好抑菌效果的抗真菌肽.本研究利用实时荧光定量PCR技术分析MAF-1在家蝇不同发育时期、不同组织器官及家蝇3龄幼虫经微生物(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌)刺激后的表达特征.结果显示,MAF-1在家蝇各个发育时期的相对表达量依次为:2龄幼虫＞1龄幼虫＞3龄幼虫＞雄蝇成虫＞卵＞雌蝇成虫＞蛹;MAF-1在家蝇3龄幼虫各组织器官的相对表达量依次为:脂肪体＞唾液腺＞气管＞肠道＞体壁.通过超微量显微注射法向家蝇3龄幼虫体内注入病原微生物,其中金黄色葡萄球菌刺激后MAF-1的表达量呈下降趋势;大肠杆菌刺激后MAF-1的表达量先降低后升高再降低;白色念珠菌刺激后MAF-1的表达量先升高然后逐渐下降.本研究从RNA水平上说明了MAF-1的表达随着家蝇幼虫的生长发育阶段变化,对不同微生物刺激的响应具有不同的特征.同时MAF-1还是家蝇抵抗病原微生物感染的重要天然免疫分子,这为进一步研究其参与家蝇天然免疫防御过程提供了基础.     

家蝇抗菌肽Attacin-2基因的克隆、序列分析和诱导表达

攻击素(attacin)作为昆虫抗菌肽之一, 在昆虫的先天免疫中起着重要作用。本研究通过家蝇Musca domestica EST序列筛选并结合RACE技术克隆了家蝇的Attacin-2基因(Mdatta2) cDNA序列。其全长819 bp, 包含一个726 bp的完整开放阅读框(open reading frame, ORF), 以及42 bp的5′末端非翻译区(5′-UTR)和51 bp的3′末端非翻译区(3′-UTR), 编码241个氨基酸残基, 推导的多肽N端22个氨基酸残基为信号肽序列。同源性分析表明, 其氨基酸序列与嗜凤梨果蝇Drosophila ananassae的Attacin一致性最高(46%)。以邻接法(Neighbor-Joining, NJ)构建的系统关系表明, 家蝇的Attacin-2与其他双翅目昆虫的Attacin起源于共同的祖先, 属于Attain_C超家族。应用实时荧光定量PCR的方法研究家蝇幼虫在受到外源细菌刺激时Mdatta2基因的表达, 结果显示, 在大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus分别刺激后3 h和6 h, 家蝇幼虫Mdatta2表达量出现显著上调。Mdatta2基因在家蝇幼虫体内呈诱导型表达, 表达水平随诱导时间的不同而变化, 提示Mdatta2基因可能在家蝇免疫防御过程中起着重要作用。     

家蝇Denfensin-1基因的克隆、诱导表达及启动子活性分析

【目的】鉴定一种新的家蝇Musca domestica防御素基因, 并分析其功能。【方法】从家蝇转录组数据库中鉴定了1条新的防御素基因cDNA序列, 并将其命名为家蝇防御素1 (Md-defensin-1)基因Mdde-1。利用生物信息学网站、 软件预测其结构等信息。以实时荧光定量PCR技术研究该基因的表达模式, 并且利用基因步移技术获得了启动子序列, 同时采取细胞转染技术验证Mdde-1启动子活性。【结果】该序列包含一个276 bp的开放阅读框, 编码91个氨基酸残基。推导的氨基酸序列N端包括1个23个氨基酸残基的信号肽和1个28个氨基酸残基的前肽。成熟肽由40个氨基酸残基组成, 含有1个典型的CSαβ基序。实时荧光定量PCR结果显示, 家蝇2龄幼虫受金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus (G+)刺激后Mdde-1表达明显上调, 而大肠杆菌Escherichia coli (G^-)刺激后表达下调;Mdde-1在家蝇幼虫受到热激时呈上调表达。为进一步研究其调控机制, 克隆了Mdde-1启动子, 并证明了该启动子具有活性。【结论】据此认为Mdde-1是一种新的家蝇防御素, 并且在免疫革兰氏阳性菌方面发挥重要作用; 同时我们首先证明了Mdde-1的启动子具有活性。本研究为进一步研究家蝇防御素的作用机制奠定了基础。     

家蝇金属硫蛋白基因的克隆、原核表达及活性检测

金属硫蛋白是一类普遍存在于生物体内、富含半胱氨酸的小分子蛋白,能螯合多种金属离子。本研究根据EST序列信息,利用RACE技术克隆到1条家蝇Musca domestica金属硫蛋白基因MdMtn（GenBank登录号为GU289398）。序列分析表明,MdMtn cDNA全长408 bp,包含1个123 bp的开放阅读框,编码40个氨基酸残基,其中半胱氨酸残基10个,呈-C-X-C-方式排列。此蛋白理论分子量为3.8 kD,等电点为878。为了解家蝇金属硫蛋白对重金属的结合活性,构建了pET-DsbA-MT表达载体,并转化Escherichia coli BL21（DE3）宿主菌进行融合表达。研究发现MT重组菌对重金属镉的耐受性得到了明显加强,提示MdMtn基因可能在家蝇适应重金属环境中起到积极作用。     

家蝇Thymosin(THY)基因的克隆及原核表达

采用EST测序技术从构建的家蝇(Musca domestica)幼虫c DNA质粒文库中筛选到胸腺肽(Thymosin,THY)基因,以该基因的c DNA文库质粒为模板,设计引物,通过PCR扩增,测序鉴定,获得THY基因完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽和亚细胞定位等方面进行预测和分析。构建p ET-28a(+)-THY重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。研究结果表明,THY基因ORF全长384 bp,编码127个氨基酸,理论分子量14.3 k D,等电点为5.22,具有THY家族的蛋白保守结构域。构建重组原核质粒p ET-28a(+)-THY,经IPTG诱导,蛋白在大肠杆菌中获得表达,经亲和层析柱纯化获得目的蛋白,Western blot检测发现纯化的目的蛋白大小正确。     

家蝇防御素基因的cDNA克隆及序列分析

Defensin is a kind of cationic.inducible antimicrobial peptide found in a large range of living organisms that contributes to host defense by disrupting the cytoplasmic membrane of microorganisms.with their broad antimicrobial spectrum and strong pharmaceutical effects.antimicrobial peptides,including defensins,represent a source of novel antibiotic agents.A novel full-length 430 base pairs cDNA of an insect defensin was cloned using polymerase chain reaction (PCR) from the cDnA library of houseflies(Musca domestica) that had been challenged by E.coli and staphylococcus taincd an NH2-terminal signal sequence(1-22)followed by a propeptide and the mature peptide(53-92),The sequence identity with other insect defensin is between 51% and 73%.The mature peptide,with a predicted molecular weight of 4.0kDa,and pI of 8.69,has 1 negative charged amino acid and 4 positice ones,the putative housefly defensin is characterized by 6 invariant cysteine residues forming 3 disulfide bonds,Cys1-Cys4,Cys2-Cys5 and Cys3-Cys6,These results suggest that the novel full-length cDNA of the defensin gene.Denominated Mdde,has been successfully cloned from houseflies.     

家蝇溶菌酶2基因的克隆及其性质研究

溶菌酶(lysozyme)作为抗菌肽重要一员,在昆虫先天免疫系统中起着重要作用.本文通过家蝇EST序列筛选并结合RACE技术克隆了家蝇Musca domestica的lysozyme 2基因(Md-lysozyme 2,MdL2)全长516 bp的cDNA序列.MdL2包含429 bp的开放阅读框,编码142个氨基酸残基,推导的氨基酸序列N端包括加个氨基酸残基的信号肽,成熟肽由122个氨基酸残基组成,理论分子量为13.89 kD,理论等电点为6.45,有8个半胱氨酸组成4对分子内二硫键.实时荧光定量PCR结果显示大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别刺激后,家蝇幼虫体内MdL2基因的表达模式发生了非常相似的变化.在刺激3～12 h表达下调,12～24 h出现一个短暂的恢复,在刺激24 h后表达又开始下调.不同组织定量PCR结果表明MdL2表达量在肠和血细胞中较高,而在表皮和脂肪体中较低.MdL2成熟肽编码序列被克隆人pET-DsbA表达载体,并转化大肠杆菌后得到高效表达.     

家蝇卵黄蛋白基因的克隆与结构序列分析

家蝇卵黄蛋白基因编码的卵黄蛋白是家蝇胚胎发育的重要营养来源 .根据 3种家蝇卵黄蛋白cDNA保守序列设计引物 ,用PCR技术从家蝇基因组DNA中扩增到大小为 76 8bp的mdYP1基因的部分DNA片段 .经地高辛标记成特异性探针 ,从构建的家蝇基因组文库中筛选出一个阳性克隆 ,并从该克隆中分离到大小为 3991bp的mdYP1基因组基因 .序列分析显示 ,该基因组序列含有约1 6kb的 5′ 上游区和 1 0kb的 3′ 下游区 ,编码区由一个 6 1bp的内含子和大小分别为 2 2 2bp和10 2 8bp的 2个外显子组成 .5′ 上游区含有典型的CAAT TATA盒 .