HSP70腺相关病毒的制备、表达及纯化

目的 构建HSP70腺相关病毒载体,用于肾脏缺血预适应(ischemia preconditioning,IP)中HSP70的作用及机制研究.方法 利用已构建的转染真核表达重组质粒HSP70/pAAV-MCS,用磷酸钙转染法转染AAV-293细胞产生病毒颗粒,用氯仿- PEG8000/NaCl-氯仿的方法纯化病毒,用流式细胞仪检测病毒滴度.结果 AAV-293细胞产生表达绿色荧光蛋白病毒颗粒,经纯化,其获得滴度为2.2×106的病毒液,其感染活性能满足下一步体内外转染实验所需. 结论成功制备HSP70腺相关病毒并进行扩增及纯化,为下一步研究HSP70在肾脏缺血预适应中的作用及其机制打下基础.     

不同转染法用于第三代慢病毒包装系统包装效率的比较

目的 比较分别经磷酸钙转染法和脂质体转染法建立的第三代慢病毒包装系统的包装效率.方法 制备并纯化完整的重组慢病毒三质粒系统：转移质粒（PXZ171）、包装质粒（△NRF）以及包膜蛋白质粒（VSV-G）.分别用磷酸钙法和脂质体法将三质粒共转染包装细胞293T,72 h后收集病毒上清,批量快速测定法测定病毒滴度并进行比较.结果 磷酸钙转染法所产病毒滴度约达到脂质体转染法的1/10.结论 磷酸钙转染法获取的病毒滴度稍低,但价格相对便宜,病毒产量亦可满足实验要求.比较适合在普通实验室中开展.     

TAP1基因慢病毒载体的构建

目的:构建TAP1基因慢病毒过表达载体及检测其过表达效率,为制备前列腺癌的免疫细胞疫苗提供基础。方法:将pDONR223-TAP1质粒和pLenti6.3-IRES-EGFP构建形成pLenti6.3-TAP1-IRES-EGFP表达质粒,采用慢病毒包装试剂盒包装产生慢病毒;感染293T细胞后RT-PCR检测目的基因TAP1的表达;采用荧光FACS计算病毒活性滴度。RT-PCR检测转染PC-3细胞后TAP1表达。结果:PCR和测序证实pLenti6.3-TAP1-IRES-EGFP慢病毒质粒构建成功;包装纯化后收集的病毒液滴度经流式细胞仪检测滴度为2.87×107 TU/ml;转染后的PC-3后,TAP1转染组TAP1的表达量显著高于对照组。结论:成功构建人TAP1基因慢病毒过表达载体,可以上调PC-3细胞TAP1的表达。     

大鼠Nogo受体基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建大鼠Nogo受体(Nogo receptor,NgR)基因RNA干扰慢病毒表达载体,并观察其对293T细胞感染效率.方法: 应用基因工程技术,首先构建携带目的基因siNgR199的慢病毒穿梭质粒表达载体,然后使用慢病毒包装质粒混合物和构建好的慢病毒穿梭质粒共转染293T细胞,转染48 h后收集上清离心过滤后冰浴保存,最后进行病毒滴度测定,与标准病毒液分别感染293T细胞,按MOI值分为5个梯度:1、3、5、10、20,以确定病毒滴度及适合感染的MOI值.其中采用PCR方法对重组载体进行鉴定,利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测.结果: 酶切鉴定及PCR结果与病毒载体的预期结果一致,病毒滴度达1×108 ifu/m1,适合感染的MOI值为3.结论: 应用基因工程技术,成功构建了大鼠siNgR199慢病毒表达载体,为应用于治疗脊髓损伤后轴突再生创造了条件.     

大鼠STAT3特异性shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的在已经成功构建4个针对STAT3的shRNA质粒表达载体的基础上,筛选出干扰效果最佳者进行慢病毒包装并鉴定。方法将STAT3的干扰质粒shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4及Control1(空载体对照),Control2(无效shRNA对照)分别转染目的细胞(大鼠肾小球系膜细胞),48h后收集细胞提取mRNA,以RT-PCR检测各组分STAT3表达量。对于筛选所得干扰效果最佳的质粒,采用pPACKH1TM慢病毒载体系统进行病毒包装。利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对感染效率及病毒滴度进行检测。结果 RT-PCR检测结果显示,shRNA3样品受干扰的效果最佳。成功构建了慢病毒载体Lenti-shRNA3,共转染293T细胞24h、48h,荧光显微镜下可见强绿色荧光,细胞生长状态良好,表明病毒包装成功。转染HT1080细胞,收集慢病毒液,测定病毒滴度为3.34×108ifu/ml,适合感染目的细胞。结论成功构建了STAT3基因的shRNA慢病毒表达载体,为进一步应用奠定了基础。     

hBMP-7基因重组腺相关病毒载体的构建及人牙髓细胞转染的研究

目的:构建人骨形成蛋白-7(hBMP-7)基因重组腺相关病毒载体,并转染牙髓细胞,为牙组织损伤修复的基因治疗做探索性研究。方法:以含hBMP-7全长cDNA的载体PTcDNA-hBMP-7为模板进行PCR扩增,将回收产物和pAAVIRES-hrGFP分别双酶切后连接、转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得重组质粒pAAVIRES-hrGFP-hBMP-7。采用磷酸钙共沉淀法转染293细胞进行病毒包装,收获的病毒液按氯仿处理、PEG/NaCl沉淀、酚:氯仿反复抽提法浓缩纯化,斑点杂交法测病毒滴度,并转染体外培养的牙髓细胞。结果:酶切鉴定和测序结果表明,hBMP-7基因成功克隆入pAAVIRES-hrGFP载体中。在293细胞中包装出重组腺相关病毒载体rAAVIRES-hBMP-7,物理滴度为3.0×1011v.g/ml。rAAV转染牙髓细胞后GFP表达逐渐增强,可持续表达到4周以后。结论:重组腺相关病毒载体rAAVIRES-hBMP-7,能有效转染牙髓细胞表达目的基因。可用于牙组织工程基因治疗的研究。     

Hyper-IL-6重组腺病毒的制备

目的 探讨大量制备高滴度重组腺病毒的方法 .方法 以Pac-1酶切Hyper-IL-6重组腺病毒(AdHIL-6)质粒,乙醇沉淀回收DNA,将线性化的AdHIL-6质粒经脂质体转染293细胞进行病毒的包装扩增,以氯化铯密度梯度离心法纯化重组腺病毒,根据GFP(绿色荧光蛋白)计数法和有限稀释法原理测定病毒滴度及感染293细胞、L02细胞的MOI(Multiplicity of infection,感染复数),并以免疫细胞化学检测感染L02细胞后目的 蛋白Hyper-lL-6的表达.结果 收集的病毒液经PCIL扩增出目的 条带,测得病毒滴度为1.6×109pfu/mL,AdHIL-6感染293细胞、L02细胞的MO1分别是7和54,感染L02细胞后Hyper-IL-6强阳性表达.结论 成功地完成了Hyper-IL-6重组腺病毒的制备,为后续的腺病毒载体介导的基因治疗奠定了基础.     

慢病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白转基因小鼠的建立

目的 以慢病毒作为载体,制作增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转基因小鼠,建立慢病毒介导的转基因动物制备技术平台.方法 慢病毒包装采用三质粒系统.3个质粒分别为转基因质粒FUGW、病毒结构蛋白表达质粒psPAX2以及病毒包膜蛋白表达质粒pMD2.G.病毒包装时,用磷酸钙沉淀法将三质粒共转染来源于人胚肾细胞系的293FT细胞,培养48 h后,收取含病毒的上清,并通过高速离心浓缩病毒.将含浓缩病毒液作梯度稀释后感染293FT细胞,通过流式细胞计数仪测定病毒滴度.用显微注射法将浓缩的病毒液注射至FVB/N小鼠1-细胞期胚胎透明带下.在荧光显微镜下观察胚胎EGFP的表达.将注射后发育至2-细胞期的胚胎移植至假孕受体母鼠,得F0代小鼠.通过紫外光照射观测EGFP在小鼠活体内的表达水平.结果 病毒液浓缩前的滴度≥106 TU/ml(transducing unit,TU),经过高速离心对病毒进行浓缩和纯化,其滴度达到109 TU/ml以上.将浓缩病毒液注射至小鼠1-细胞期胚胎透明带下,注射后胚胎的2-细胞期卵裂率为81.8%(1 189/1 453),利用荧光显微镜分别在注射后60、84、132 h观察胚胎,均发现有较强荧光.在2-细胞期,每一视野下胚胎阳性率＞90%,说明包装的病毒成功并高效地转染小鼠胚胎.胚胎移植后假孕母鼠妊娠率为42.9%(12/28),首建鼠阳性率为60.8%(73/120),转基因小鼠的总体研制效率(转基因小鼠数/注射胚胎数)为5.0%(73/1 453).将F0代EGFP转基因小鼠分别与野生型小鼠交配,在其F1、F2、F3代小鼠中均获得了EGFP阳性小鼠,阳性率分别为91.4%(32/35)、93.8%(30/32)、93.1%(27/29).结论 通过慢病毒载体感染小鼠1-细胞期胚胎可有效地制备转基因小鼠.我们已初步建立了慢病毒介导的转基因小鼠制备技术体系.     

8型腺相关病毒的制备及体内表达的初步研究

目的探讨8型腺相关病毒的制备方法，初步检测其在体内的表达。方法采用载体质粒、辅助质粒和包装质粒三质粒磷酸钙共沉淀方法转染HEK293细胞，包装病毒，经超声破碎一饱和硫酸铵沉淀一氯化铯梯度离心提取并纯化病毒。肌肉注射感染肌肉组织，检测报告基因增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluoresent protein，EGFP）在体内的表达活性。结果成功包装制备出8型腺相关病毒，重组病毒能够有效感染肌肉组织，绿色荧光蛋白在肌肉组织中稳定高效表达。结论此实验方法制备病毒的质量能够满足小动物体内实验的要求，为进一步应用其进行基因治疗打下基础。     

VSV-G蛋白修饰的GFP逆转录病毒的构建及表达

目的 通过与疱疹性口腔炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)共转染,使含绿色荧光蛋白(GFP)基因的逆转录病毒经超速离心得以浓缩,进一步提高GFP逆转录病毒的细胞感染效率.方法 应用GFP-RV质粒转染PT67细胞,并用G418筛选出GFP阳性克隆,利用其产生的病毒上清液再转染GP2-293细胞,在G418筛选的同时,瞬时转染VSV-G基因.收集该GP2-293细胞产生的重组假病毒液,并通过低温超速离心制备含GFP基因假病毒的浓缩液,测定浓缩前后含GFP基因假病毒液滴度,并分别感染NIH 3T3细胞、软骨细胞、成纤维细胞、骨髓基质干细胞等,荧光显微镜下观察GFP在上述细胞内的表达情况,流式细胞仪检测GFP基因的转染阳性表达率.结果 GFP-GP2-293细胞转染VSV-G基因后产生的重组假病毒液滴度为7.36×104 CFU/mL,浓缩40倍后其滴度可提高至1.82×106 CFU/mL.用浓缩前后含GFP基因假病毒液分别转染NIH 3T3细胞,GFP阳性表达率可由44.21%升高至79.80%;转染兔软骨细胞和成纤维细胞、猪骨髓基质干细胞和脂肪干细胞后,均可见GFP阳性表达明显增强.结论 逆转录病毒与VSV-G共转染GP2-293包装细胞可以制备出高滴度的假病毒液.浓缩病毒液的高转染率为其在组织工程种子细胞标记方面的广泛应用奠定了基础.     

Construction of recombinant adeno-associated virus vector co-expressing hVEGF_(165) and hBMP_7 gene

Objective: To construct recombinant adeno-associated virus co-expressing human vascular epithelial growth factor 165(hVEGF165) and bone morphogenetic protein 7(hBMP7),measure the virus titer and verify the recombination. Methods:The AAV helper-free system was used as basis to generate recombinant AAV. The IRES sequence of plasmid pIRES was cut down and subcloned into ITR/MCS containing vector pAAV-MCS to construct recombinant plasmid pAAV-MCSa-IRES-MCSb. The hVEGF165 and hBMP7 gene was amplified by PCR and inserted into upstream MCSa and downstream MCSb respectively. Then,recombinant plasmid pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP7,pAAV-RC and pHelper were co-transfected into AAV-293 cells to complete rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP7 packaging. The GFP labeled rAAV-IRES-GFP was simultaneously packaged by using the parallel plasmid pAAV-IRES-hrGFP. The efficiency of AAV packaging was monitored under fluorescent microscope and recombinant viral particles were harvested from infected AAV-293 cells. The virus titer was measured by infecting AAV-HT1080 cells,and the recombinant AAV-hVEGF165-IRES-hBMP7 was verified by PCR of the exogenous interest genes. Results:Recombinant pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP7 was verified by double digestion. GFP expression in AAV-293 could be observed under fluorescent microscope 72 h after transfection and the system provided a high packing ratio of 95%. The recombinant adeno-associated virus has a high titer of 5.5×1011vp/ml,and AAV-HT 1080 was infected at a ratio of 90%. The recombinant virus was confirmed by PCR of exogenous hBMP7 and hVEGF165 gene. Conclusion:Recombinant rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP7 was successfully constructed with a high virus titer,which may offer foundation for in vitro and in vivo experiments of hVEGF165 and hBMP7 co-expression and provide a new method for gene therapy of bone regeneration.     

MicroRNA-29b-3p重组腺相关病毒制备及在大鼠前额叶皮质中的表达研究

目的获得表达microRNA-29b-3p 的重组腺相关病毒（rAAV-miR-29b-3p）,并检测其在大鼠前额叶皮质中的感染效果和表达水平。方法将前体miR-29b-3p 基因片段置入AAV 表达质粒中构建重组AAV质粒,将重组AAV 质粒、包装质粒和辅助质粒通过脂质体LipaFiterTM共转染HEK293 细胞包装rAAVmiR-29b-3p。从转染的HEK293 细胞中收集并通过树脂柱纯化rAAV-miR-29b-3p,通过实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）测定rAAV-miR-29b-3p滴度。通过脑立体定位仪注射rAAV-miR-29b-3p 至大鼠前额叶皮质,免疫荧光显微镜观察rAAV-miR-29b-3p的感染效果,qRT-PCR检测rAAV-miR-29b-3p表达水平。结果成功包装的rAAV-miR-29b-3p 经纯化后获得了高纯度的rAAV-miR-29b-3p,qRT-PCR检测rAAV-miR-29b-3p 的病毒滴度达到1.0×1012 vg/ml,经感染21 d后,脑组织前额叶皮质荧光表达明显,miR-29b-3p 表达水平明显提高。结论构建的rAAV-miR-29b-3p 可使大鼠前脑皮层miR-29b-3p 高表达,为进一步研究miR-29b-3p的生物学功能提供了有效工具。     

Construction of Adeno-associated Virus System for Human Bone Morphogenetic Protein 7 Gene

To construct the recombinant adeno-associated virus （rAAV） vector with human bone morphogenetic protein 7 （BMP7） and observe the BMP7 mRNA expression in vitro, BMP7 CDS sequence was cloned into expression plasmid pAAV-MCS of AAV Helper Free System. The recombinant plasmid was identified with enzyme digestion and sequencing. The recombinant plasmid, pAAV-RC, pHelper were co-transfected into AAV-293 cells according to the calcium phosphate-based protocol. The viral stock was collected by 4 rounds of freeze/thaw. After purified and concentrated, the recombinant virus titer was determined by dot-blot assay. HEK293 cells were transfected with the recombinant virus at different MOI, and the expression of BMP7 mRNA was detected by RT-PCR. The results showed rAAV-BMP7 was constructed and packaged successfully. The physical particle titer was 2.5×10^11 vector genomes/mL. There was different expression level of BMP7 mRNA after transfecton. These data suggested that recombinant AAV mediated a stable expression of hBMP7 mRNA in 293 cells. The AAV production method may pave the way of an effective strategy for the jaw bone defection around dental implants.     

Packaging and Functional Identification of Recombinant Adeno-associated Virus Encoding cdc2-siRNA

Cyclin dependent kinases （cdks） play an important role in the pathogenesis of multiple neurodegenerative diseases. To explore the possibility of cdks-related gene therapy for neurodegen-erative diseases, we packed recombinant adeno-associated virus （rAAV） encoding cdc2-siRNA. The expressing plasmid pAAV-MCS-EGFP-U6-cdc2-siRNA was constructed by using molecular biological techniques. The rAAV encoding cdc2-siRNA （rAAV-EGFP-U6-cdc2-siRNA） was packed by calcium phosphate mediated co-transfection of the plasmid pAAV-MCS-EGFP-U6-cdc2-siRNA, p-RC and p-Helper into AAV-293 cells. DNA sequencing proved the successful construction of U6-cdc2-siRNA in pAAV-MCS-EGFP. Seventy-two h after packaging, the expression of EGFP could be detected in AAV-293 cells. Western blotting revealed that cdc2 gene expression in AAV-293 cells was down-regulated markedly after transfection with rAAV-EGFP-U6-cdc2-siRNA, which evidenced the satisfactory silencing effect of this virus. It was concluded that the packaging of rAAV encoding cdc2-siRNA was successful. rAAV encoding cdc2-siRNA could silence cdc2 gene effectively, which might offer a novel means for the treatment of neurodegenerative diseases.     

细菌内同源重组快速构建和制备表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒

目的 :利用细菌内同源重组快速构建重组腺病毒质粒和制备重组腺病毒。方法 :制备感受态BJ5 183,将pAdEasy - 1转化BJ5 183,制备含 pAdEasy - 1的BJ5 183感受态 ,将线性化的 pShuttle -CMV -LacZ转化含 pAdEasy- 1的BJ5 183感受态菌。采用细菌中同源重组法构建重组腺病毒质粒 pAdEasy - 1-LacZ。pAdEasy - 1-LacZ用PacⅠ线性化后 ,再用LipoVec介导其转染至AD2 93细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒 ,采用CsCl密度梯度离心法纯化重组腺病毒AdEasy - 1-LacZ。采用X - gal染色观察LipoVec介导的重组腺病毒质粒的转染效果及病毒包装情况。将纯化的AdEasy - 1-LacZ转染HVSMC ,X -gal染色观察基因转染效率及基因表达情况。 结果 :pShuttle -CMV -LacZ成功地转化了含 pAdEasy - 1的BJ5 183,并在其内发生了同源重组。X - gal染色证实了 pAdEasy - 1-LacZ转染AD2 93后 ,产生了重组腺病毒AdEasy - 1-LacZ。病毒滴度为 3.9× 10 12 pfu/ml。AdEasy - 1-LacZ转染HVSMC后 ,β -gal在HVSMC中得到了有效表达。 结论 :细菌内同源重组法是一种快速构建重组腺病毒质粒的方法 ,AdEasy - 1-LacZ的制备为基因治疗研究提供了一良好对照载体。     

大肠杆菌内同源重组法构建含mIκBα基因的重组腺病毒及其在Hep G2细胞中的表达

OBJECTIVE: To develop a rapid and efficient method for preparing recombinant adenovirus containing human mIkappaBalpha gene by homogenous recombination in E.coli. and detect its expression in Hep G2 cells. METHODS: The mIkappaBalpha gene was cloned into the shuttle plasmid pAdTrack-CMV containing green fluorescent protein (GFP) reporter gene, followed by linearization of the resultant plasmid pAdTrack-CMV- mIkappaBalpha by Pme I digestion and subsequent cotransformation into E.coli BJ5183 cells along with an adenoviral backbone plasmid pAdEasy-1. The recombinant plasmid pAd- mIkappaBalpha was selected for kanamycin resistance and confirmed by multiple restriction endonuclease analyses. Finally, the linearized recombinant plasmid was transfected into 293 cells, in which Ad- mIkappaBalpha were generated within 7 to 10 days. The virus titer in 293 cells and its infection efficiency in Hep G2 cells were detected and calculated with the aid of GFP expression. RESULTS: PCR indicated that the recombinant adenovirus contained mIkappaBalpha gene and the titer of Ad- mIkappaBalpha was 2.7x10(9) PFU/ml. With a multiplicity of infection (MOI) of 10, Ad- mIkappaBalpha could be expressed stably and efficiently in Hep G2 cells and the infection efficiency was 57% at 24 h and 100% at 48 h after transfection. CONCLUSIONS: Homogenous recombination in E.coli can efficiently and conveniently construct recombinant adenovirus containing mIkappaBalpha gene capable of amplification in 293 cells and efficient infection of Hep G2 cells. The recombinant adenovirus may serve as a good gene transfer vector for study the function of mIkappaBalpha gene and therapy for hepatocarcinoma.     

重组腺相关病毒介导的TIMP-1载体的构建及鉴定

目的：构建及鉴定载入金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)的重组腺相关病毒载体。方法：应用基因重组的方法构建含全长TIMP-1的重组腺相关病毒骨架质粒(pAAV—TIMP-1)，利用磷酸钙沉淀法将腺相关病毒载体质粒共转染入HEK293细胞中，分别装配成rAAV—TIMP-1和rAAV—hrGFP，将rAAV-hrGFP转导HT1080细胞测定重组病毒的滴度，Westernblot方法检测rAAV—TIMP-1在HT1080细胞中的表达情况。结果：成功构建rAAV—TIMP-1，病毒滴度达到10^9 TU／ml，转导细胞后，转导组TIMP-1的表达水平高于对照组。结论：构建的rAAV—TIMP-1，为基因修饰胰岛移植提供了新的手段。