重组人胰腺α-淀粉酶在毕赤酵母菌中的分泌性表达

目的:构建人胰腺!-淀粉酶(HPA)真核表达载体并在毕赤酵母中进行表达。方法:从人胰腺组织中提取总RNA,逆转录为cDNA,RT-PCR法扩增HPA基因,将其插入到酵母分泌性表达质粒pPIC9中,筛选得到正确序列的重组质粒pPIC9-HPA,用该质粒转化毕赤酵母菌GS115,PCR方法筛选阳性克隆,摇瓶培养、0.5%甲醇诱导重组HPA分泌性表达,测定培养上清中的淀粉酶活力;重组HPA用冷乙醇-糖原亲和沉淀、疏水层析纯化并以SDS-PAGE电泳和Westernblot方法鉴定。结果:成功构建了重组HPA真核酵母表达载体,重组质粒酶切和核酸测序结果与预期一致,显示HPA基因正确插入质粒pPIC9中;以pPIC9-HPA转化毕赤酵母菌GS115,实现了重组HPA在毕赤酵母菌分泌性表达;重组HPA经纯化后鉴定具天然HPA相同的免疫原性,其对可溶性淀粉酶的水解产物和酶动力学分析与天然HPA相近。结论:成功实现了HPA在毕赤酵母真核表达系统中的分泌性表达,重组HPA与天然HPA具有相似的催化和酶动力学性质。本实验为下一步作为临床HPA测定标准品的研制准备了实验基础。     

人降钙素原的原核表达、纯化和鉴定

目的构建人降钙素原(procalcitonin,PCT)原核表达载体,获得高纯度PCT重组蛋白。方法根据NCBI上PCT基因序列设计引物,利用PCR技术扩增PCT基因,构建PCT/p ET-22b(+)重组表达载体,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21中诱导表达;采用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白,用western blot和胶体金法对其进行鉴定。结果琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR扩增产物约为350 bp。同源性比对分析结果表明,PCT基因片段(348 bp)成功插入p TG19-T载体,未出现碱基突变。用Bam HⅠ和HindⅢ对重组表达载体双酶切,得到约为350 bp和5 500 bp片段。SDS-PAGE电泳显示PCT重组蛋白以可溶性形式存在,Mr约14 000,经镍柱亲和层析法纯化后即可获得。western blot和PCT胶体金法结果呈阳性,显示融合蛋白含组氨酸标签(His-tag),成功表达出PCT重组蛋白。结论应用重组DNA技术成功构建PCT基因融合重组表达载体,通过蛋白质表达纯化技术获得PCT融合蛋白。     

人regucalcin cDNA高表达重组质粒的构建及其在原核细胞中的表达

目的 原核表达获得大量人regucalcin（RGN）蛋白。方法 用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术从人。肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2）中扩增RGN全长cDNA，将扩增的产物连接于测序载体pMD18-T，测序鉴定准确后，进行酶切，将正确的RGN全长cDNA与原核表达载体pET42b（＋）构建成重组质粒pET42b（＋）-RGN。将pET42b（＋）-RGN先转化入大肠杆菌DH5α，提取质粒经双酶切鉴定正确后，再转化入表达宿主大肠杆菌DE3菌株。对转化菌株进行诱导、破菌，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）与免疫印迹分析，鉴定RGN融合蛋白质表达的正确性。RGN重组融合蛋白经Ni^2＋亲和层析纯化，达电泳纯。结果 构建了重组质粒pET42b（＋）-RGN并获得高效表达，RGN重组融合蛋白经异丙基硫化-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导后以包涵体形式存在，表达的蛋白质相对分子质量为34000。结论 人RGN蛋白在pET42b（＋）原核表达载体可获得高效表达，为进一步了解RGN蛋白质的结构、功能及其抗体的制备等奠定了基础。     

人regucalcin cDNA高表达重组质粒的构建及其在原核细胞中的表达

目的原核表达获得大量人regucalc in(RGN)蛋白。方法用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2)中扩增RGN全长cDNA,将扩增的产物连接于测序载体pMD18-T,测序鉴定准确后,进行酶切,将正确的RGN全长cDNA与原核表达载体pET42b( )构建成重组质粒pET42b( )-RGN。将pET42b( )-RGN先转化入大肠杆菌DH5α,提取质粒经双酶切鉴定正确后,再转化入表达宿主大肠杆菌DE3菌株。对转化菌株进行诱导、破菌,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹分析,鉴定RGN融合蛋白质表达的正确性。RGN重组融合蛋白经N i2 亲和层析纯化,达电泳纯。结果构建了重组质粒pET42b( )-RGN并获得高效表达,RGN重组融合蛋白经异丙基硫化-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后以包涵体形式存在,表达的蛋白质相对分子质量为34 000。结论人RGN蛋白在pET42b( )原核表达载体可获得高效表达,为进一步了解RGN蛋白质的结构、功能及其抗体的制备等奠定了基础。     

TEM-105编码基因的克隆与原核表达

由于一种细菌可同时产生多种 β内酰胺酶 ,因此为了避免多种 β内酰胺酶的相互干扰 ,我们应用肉汤稀释法[1] 对产超广谱 β内酰胺酶 (ESBLs)的 4株肺炎克雷伯菌 (Kpn)的TEM型编码基因进行了原核表达。一、材料和方法1 菌株来源和表型鉴定 :4株临床菌株№ 95、№ 96、№ 10 2和№ 10 6为浙江省台州第一医院内科患者痰标本分离的Kpn。经抑制剂增强的肉汤稀释法[1] 证实为阳性。2 细菌质粒DNA提取与PCR扩增 :采用碱裂解法提取质粒DNA。根据TEM 1D编码基因序列设计的TEM引物序列为 5′ TTAGACGTCAGGTGGCACTT 3′ (76～ 95 )…     

α-淀粉酶同工酶的分离测定方法研究进展

本文对目前分离测定α-淀粉酶同工酶的新方法进行了综述,主要介绍了单克隆抗体法及酶动力学分析法测定α-淀粉酶同工酶的原理,并对它们的优、缺点及应用前景进行了评价。     

α-淀粉酶连续监测法的建立

[目的]建立以亚乙基封闭的4-硝基酚-1，4-α-D-麦芽七糖苷（EPS-G7）为底物的一种新的α-淀粉酶的测定方法。[方法]在SPS-100全自动分析仪上，研究连续监测法，建立实验参数。[结果]本法测定α-Amy的Km=0．179mmol／L；4-硝基酚（4-NP）在405nm时的摩尔吸光系数1200．9mol／L选取HEPES缓冲液为缓冲体系；延迟时间2min，测量时间2min；线性反应期11min，线性范围0-1400U／L；最适温度37℃；最适pH7．15；精密度实验，批内CVs为1．4％～2．6％，批间CVs为1．9％-2．8％；平均回收率为96．3％；与Boehringer方法比较，相关系数为0．994；血红蛋白、胆红素、葡萄糖、蛋白质对测定结果无影响；本法参考值范围血33．9-96．2U／L，尿65．4～187．6U／L。[结论]此方法重复性好，线性范围广，准确度好，灵敏度高，干扰因素少，适用于常规自动化分析。     

去乙酰化酶SIRT5的原核表达及多克隆抗体的制备

目的克隆小鼠的Sirt5基因,及制备SIRT5多克隆抗体。方法提取小鼠肝细胞总RNA进行RT-PCR,PCR法扩增Sirt5基因,将此基因克隆至pET-28a载体,转化E.coli BL21（DE3）,经异丙-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达后,利用Ni 2＋-NTA亲和层析柱纯化;纯化的目的蛋白免疫Bal/c小鼠后,收获血清并鉴定。结果成功构建了Sirt5原核表达载体,并能在宿主菌E.coli BL21（DE3）中高效表达;利用纯化的蛋白制备了理想的多克隆抗体。结论利用分子克隆技术,获得了高纯度的SIRT5蛋白并制备了多克隆抗体,为进一步研究奠定了基础。     

人β防御素-2基因的克隆及原核表达载体的构建

目的构建人β-防御素2的融合性原核表达载体，为今后基因工程手段表达纯化及生产人β-防御素-2奠定基础。方法体外基因合成人β-防御素2（HBD-2）的基因片段，并克隆人pMD18T中间载体中，经酶切鉴定后再克隆人pET32a原核表达载体中，与载体中所固有的TrX—A形成融合基因。结果构建的融合性原核表达载体经酶切鉴定无突变发生。结论成功地构建了pET-32a-（HBD-2）。     

McAb免疫抑制法检测α-淀粉酶同工酶及其临床意义

目的使用免疫抑制法检测α-淀粉酶同工酶胰腺淀粉酶（P-AMY），以评价其诊断急性胰腺炎的临床价值。方法对55例急性胰腺炎，81例急性胆囊炎的血清和尿液α-AMY总活性及P-AMY活性和P／α比值进行了对比研究。结果血清和尿液P-AMY的参考范围为6-46U／L和58-398U／L，急性胰腺炎组血清α.P-AMY.P／α及尿液α.P-AMY均较急性胆囊炎组病人有高度显著性差异（P＜0.01），但两组病人尿液P／α比值无显著性差异（P＞0.05）。急性胆囊炎病人血清α.P-AMY，P／α及尿液α.P-AMY校正常健康人无显著性差异（P＞0.05），但两组病人尿液P／α比值有显著性差异（P＜0.05）。在136例病人中，急性胰腺炎病人血清P-AMY的诊断特异性效率最高，分别为92.6％和89％。结论该方法检测P-AMY准确，特异，快速，可作为急性胰腺炎的诊断和鉴别诊断的重要依据。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A基因克隆及表达

目的对金黄色葡萄球菌肠毒素A基因(SEA)进行克隆、鉴定与表达,为制备单抗、诊断试剂及进一步深入研究SEA的功能奠定基础。方法用聚合酶链反应(PCR)扩增SEA基因,将扩增的产物连接于测序载体pMD18-T上,经测序反应确定无误,酶切后将SEA基因与原核表达载体pET42b( )构建表达SEA的重组质粒,将重组质粒先转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒,经双酶切鉴定后,再转化入表达宿主大肠杆菌BL21菌株内,对转化菌株进行诱导后,破菌,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。结果构建了表达载体pET42b( )-SEA,并获得高效表达,表达的蛋白质相对分子质量为27 000,重组蛋白(rSEA)在37℃、25℃经异丙基硫化-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导时均以包涵体形式存在。结论SEA基因成功克隆到表达质粒内并表达,为制备单抗、诊断试剂及其致病机制研究奠定了基础。     

人Smith D1抗原在原核细胞中的表达与纯化及临床应用

目的获得人Smith D1（Sm D1）抗原基因，并进行原核表达及建立斑点免疫金渗虑（dot immunogold filtration assay，DIGFA）检测方法。方法采用基因工程技术，通过PCR从人白血病HL-60细胞cDNA文库中扩增人Sm D1抗原基因，构建pGEX-5T-Sm D1重组表达载体，在大肠杆菌B1221中通过异丙基硫代半乳糖苷酶（IPTG）诱导表达Sm D1蛋白。利用初步纯化的Sm D1抗原建立DIGFA。结果重组质粒测序和酶切结果显示Sm D1抗原基因正确插入pGEX-5T，重组蛋白、复性及纯化产物经12％十二烷基硫酸钠．聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），在相对分子质量为39000处有一明显的蛋白表达条带，免疫印迹法分析表明，重组蛋白具有人Sm D1抗原的抗原性。DIGFA与色疫印迹法检测结果的差异无统计学意义（P〉0．05），二者的符合率为91．7％。DIGFA敏感度为100％，特异度为83．3％结论通过基因工程技术制备获得初步纯化的谷胱苷肽转移酶（GST）-Sm D1融合蛋白，用该抗原建立的DIGFA与免疫印迹法相似，且具有快速、简便和可靠等优点。     

嗜麦芽窄食单胞菌Smqnr耐药基因的序列分析及原核表达

目的:对嗜麦芽窄食单胞菌临床分离株gzch770(SMgzch770)携带的喹诺酮耐药基因Smqnr进行扩增、测序及原核表达,为研究Smqnr蛋白的功能奠定基础。方法:提取SMgzch770基因组染色体,PCR扩增Smqnr全基因并克隆入pMD18-T载体进行核苷酸序列分析;将Smqnr基因克隆至表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21,SDS-PAGE分析融合蛋白表达情况。结果:以染色体DNA为模板,成功扩增660bpSmqnr基因;序列比对分析显示其与相关报道序列核苷酸和氨基酸一致性达98%以上;SMgzch770Smqnr序列已登录GenBank(登录号:HQ315851);SDS-PAGE显示,融合基因表达的蛋白约为50kDa,其中Smqnr蛋白约为24kDa。结论:从SMgzch770中成功克隆及表达了Smqnr基因,为进一步进行Smqnr蛋白高级结构测定的结晶试验提供了必须材料。     

胰腺癌相关自身抗原47原核表达、纯化及其抗体检测胰腺癌的价值初探

目的 验证胰腺癌相关性自身抗原47(PAA47)的质谱鉴定结果，初探抗PAA47检测在诊断胰腺癌中的意义。方法 构建pQE—30—PAA47重组表达载体；在大肠杆菌M15中诱导表达KIAA0111编码蛋白质；经纯化后用点印迹、免疫印证法验证表达产物与相应胰腺癌相关性自身抗体阳性血清的抗原反应性；建立间接酶联免疫吸附实验(ELISA)，检测60名健康体检者、60例胰腺癌、20例慢性胰腺炎及120例其他肿瘤(大肠癌、肝癌、胃癌及肺癌各30例)患者血清中的抗PAA47，并与回顾性糖链抗原19—9(CAl9—9)检测结果相比较。结果 表达产物的序列与KIAA0111编码序列一致；点印迹法和免疫印迹法显示纯化表达产物与抗PAA47血清具有抗原反应性。ELISA结果显示，胰腺癌患者中，该抗体阳性率为31．67％(19／60)，大肠癌、肝癌、胃癌分别为10．00％、3．33％、6．67％，正常人、慢性胰腺炎及肺癌患者中未见阳性。抗PAA47对胰腺癌的灵敏度为31．67％，特异性为95．89％。与慢性胰腺炎患者比较，PAA47的灵敏度为31．67％，特异性为100％，CAl9—9的灵敏度为75．00％，特异性为86．96％。平行法联合检测2项指标，既保持了相同的特异性，又提高了检测的灵敏度(90％，P＜0．05)。采用顺序法联合检测，灵敏度和特异性分别为70％和100％。结论 本研究成功克隆了人KIAA0111编码基因，并将其在大肠杆菌中成功表达；新鉴定的PAA47，其抗体血清学检测与CAl9—9等肿瘤标志物联合，对提高胰腺癌诊断的灵敏度和特异性具有一定的意义。     

人颗粒溶素的克隆、原核表达及其抗体制备

目的构建人颗粒溶素（GNLY）质粒,进行原核表达,纯化得到相对分子质量9 000目的片段,免疫新西兰大白兔得到兔抗GNLY多克隆抗体。方法分离外周血单个核细胞,用卡介苗和白细胞介素-2（IL-2）刺激,培养12 d。抽提细胞RNA,通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）获得含有222 bp的GNLY cDNA,克隆到pMD18-T载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a（＋）中,得到重组质粒pET28a（＋）-GNLY并将其转化大肠杆菌,诱导表达后用镍（Ni）亲和层析纯化,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹试验（Westernblot）进行鉴定。用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,得到抗-GNLY特异性多抗。结果成功构建了pET28a（＋）-GNLY表达质粒。用大肠杆菌表达带6个组氨酸的融合蛋白并进行纯化,最后免疫兔得到抗-GNLY特异性多抗,并经Western blot验证正确。结论获得了纯化的GNLY蛋白和抗-GNLY多抗血清,为今后对疾病中细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和自然杀伤（NK）细胞活性的研究打下了基础。     

人颗粒溶素的克隆、原核表达及其抗体制备

目的构建人颗粒溶素(GNLY)质粒,进行原核表达,纯化得到相对分子质量9 000目的片段,免疫新西兰大白兔得到兔抗GNLY多克隆抗体。方法分离外周血单个核细胞,用卡介苗和白细胞介素-2(IL-2)刺激,培养12 d。抽提细胞RNA,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)获得含有222 bp的GNLY cDNA,克隆到pMD18-T载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a( )中,得到重组质粒pET28a( )-GNLY并将其转化大肠杆菌,诱导表达后用镍(Ni)亲和层析纯化,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹试验(Westernblot)进行鉴定。用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,得到抗-GNLY特异性多抗。结果成功构建了pET28a( )-GNLY表达质粒。用大肠杆菌表达带6个组氨酸的融合蛋白并进行纯化,最后免疫兔得到抗-GNLY特异性多抗,并经Western blot验证正确。结论获得了纯化的GNLY蛋白和抗-GNLY多抗血清,为今后对疾病中细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤(NK)细胞活性的研究打下了基础。     

重组人绒毛膜促性腺激素-β亚基的纯化及生物活性测定

目的 构建人绒毛膜促性腺激素（HCGB）原核表达载体PG5-HCGβ，使HCGβ在大肠杆菌中获得高效表达。建立一条简单、快速、高效的纯化复性路线，获得具有生物活性的高纯度rHCGβ。方法以本室克隆的PCRII／HCGB为模板，构建PG5-HCGβ，转化大肠杆菌BL21表达HCGβ。表达蛋白顺次用凝胶过滤和离子交换层析两步分离纯化。结果酶切及序列结果显示，PG5-HCGβ构建正确，HCGβ表达约占菌体总蛋白的20％。经过凝胶过滤和离子交换层析两步分离纯化，获得rHCGβ纯度达95％以上。复性的rHCGβ具有促进小鼠子宫生长的生物学活性。结论构建的PG5-HCGβ表达载体在大肠杆菌中获得高效表达，纯化复性的rHCGβ蛋白具有较高的生物学活性，为今后的rHCGβ生产打下了良好的基础。     

小鼠分泌型内皮抑素原核表达载体pFLAG—ssEndostatin的构建

目的构建带有小鼠分泌型内皮抑素（ssEndostafin）的原核表达载体pFLAG-ssEndostatin。方法利用分子生物学方法,采用KpnI内切酶将ssEndostatin从pcDNA3．1-Egrl—ssEndostatin质粒上切下,然后连接到pFLAG表达载体上,构建成原核表达载体pFLAG-ssEndostatin,并对其进行PCR、酶切鉴定。结果经酶切、PCR鉴定,所构建的原核表达质粒pFLAG-ssEndostatin与预测的一致。结论成功地构建了带有分泌信号的内皮抑素原核表达载体pFLAG-ssEndo—statin,为进一步研究Endostatin在肿瘤治疗方面的作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌ESAT-6基因的克隆与表达

目的　对结核分枝杆菌的ESAT - 6基因进行克隆、鉴定与表达 ,为结核病的诊断、重组疫苗的应用打下基础。方法 　 以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板 ,用聚合酶链反应 (PCR)对ESAT - 6基因进行扩增 ,将扩增的产物连接于测序载体 pGEM T上 ,经测序反应确定无误后 ,再将PCR产物与原核表达载体pET4 2b(+)构建表达ESAT - 6的重组质粒 ,将重组质粒先转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒 ,经酶切鉴定后 ,再转化入表达宿主大肠杆菌BL2 1菌株内 ,对转化菌株进行诱导后 ,破菌 ,进行SDS -PAGE电泳。结果 　电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白 ,其表达的蛋白质相对分子质量为 990 0。结论 　 目的基因克隆到菌株内 ,重组结核分枝杆菌ESAT - 6的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测等奠定了基础