结核分枝杆菌Mtub-39位点多态性与下游基因表达关系的研究

目的 分析结核分枝杆菌(MTB)北京型菌株及非北京型菌株5个有明显差异的MTB散在分布重复单位(MIRU)位点,研究其多态性与下游基因表达的关系.方法 利用生物信息学方法预测5个MIRU位点(ETR-C、Mtub-30、Mtub-39、MIRU-27、MIRU-40)下游相邻基因启动子区域.通过PCR方法扩增该区域并与分枝杆菌启动子探针载体pMC210连接,重组质粒测序正确后,用电穿孔方法转化耻垢分枝杆菌mc2155.采用Real-Time PCR技术检测报告基因lacZ的转录水平,验证MIRU位点多态性对其下游基因表达的影响.结果 Mtub-39位点核心区域内含有其下游基因的启动子.成功构建了分别带有1、3、5个拷贝重复序列的Mtub-39位点的重组质粒.Real-Time PCR结果显示,有多态性的Mtub-39位点(pMC210-Mtub-39-N158、pMC210-Mtub-39-N139及pMC210-Mtub-39-N146)对报告基因lacZ的转录调控差异有统计学意义(P=0.006 5).结论 Mtub-39位点的多态性能明显影响下游基因启动子的活性进而调节其表达.     

河南省尉氏县结核分枝杆菌的基因型流行特征及耐药性

目的:探讨河南省尉氏县结核分枝杆菌的可变数目串联重复序列(VNTR)基因型流行特征和耐药情况。方法:河南省尉氏县结核病防治机构分离培养的257株结核分枝杆菌,采用比例法药敏试验检测其耐药情况。应用RD105缺失基因检测法鉴定北京家族基因型菌株,7个结核分枝杆菌VNTR基因位点对结核分枝杆菌进行分型,并对其分型结果进行聚类分析。结果:北京家族基因型占90.7%(233/257);VNTR基因型显示明显的多态性。230个基因型聚类分析主要分为4个基因群(Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群和Ⅳ群),其中Ⅲ群包含152基因型(59.1%),为优势基因型;耐多药结核分枝杆菌占8.9%(23/257),任意耐药占24.5%(63/257),北京家族基因型与非北京家族基因型菌株以及主要流行(Ⅲ)群与非主要流行群中耐药株分布比较,差异无统计学意义(χ2=2.412、1.954,P>0.05)。结论:河南省尉氏县北京家族基因型结核分枝杆菌为主导流行型;7位点VNTR基因分型存在4个基因群,主要流行群为Ⅲ群;耐药形势仍不容乐观。     

新基因MTB73与儿童结核病耐药相关性的初步研究

目的 通过检测儿童结核感染临床分离株的耐药表型及其MTB73基因的表达,探讨该基因与结核耐药性的关系.方法 110株儿童结核病临床分离株通过药敏实验分为耐药组和敏感组两个组,应用RT-PCR和基因测序的方法检测并验证结核分离株中新基因MTB73的表达,应用定量PCR检测基因MTB73在菌株中的表达量,比较耐药组菌株和敏感组菌株中MTB73基因阳性表达率和表达量的差异.结果 110例临床结核分离株样本中MTB73基因阳性表达率为11.82％(13株).经比较,耐药结核菌中MTB73阳性表达率及相对表达量均明显高于敏感菌株(x2=6.014,P=0.014;t’=8.075,P＜0.001).根据耐药种数不同,将耐药菌株分为耐单药(32株)、多耐药(12株)和耐多药(14株)3个亚组,其中耐多药组的MTB73阳性表达率(9株,64.29％)明显高于单耐药组(1株,3.13％)、多耐药组(1株,8.33％)及敏感组(2株,3.85％),差异有统计学意义(x2=17.969,P＜0.001;P =0.005;x2=24.823,P＜0.001).单耐药组、多耐药组及敏感组3个组中MTB73基因阳性表达率两两之间比较差异无统计学意义(P ＞0.008).结论 MTB73基因在耐药菌株尤其是耐多药菌株中高表达,提示新基因MTB73可能与儿童耐药结核病的耐药性相关.     

徐州地区结核分枝杆菌基因分型及其与利福平耐药基因突变的关系

目的 探究徐州地区结核分枝杆菌的基因型分布特征及其与利福平耐药基因突变形成的关系.方法 选取徐州市传染病医院结核病实验室基因型毒株500株,其中含有经罗氏比例法鉴定的耐利福平临床分离株300株和利福平敏感200株,采用间隔区寡核苷酸分型(spoligotyping)分析其基因型结构及其与利福平抗性基因的突变关系.结果 徐州地区的结核分枝杆菌的基因分型主要为北京家族基因群(61.2%)和非北京家族基因群(38.8%),利福平耐药和敏感组北京家族基因群的构成比差异无统计学意义(X2=0.09,P>0.05);北京家族531位点、516位点以及531和526位点突变率分别为55.49%、10.99%和7.69%与非北京家族33.90%、21.19%和15.25%相比,差异有统计学意义(P<0.05).结论 徐州地区结核分枝杆菌基因型为北京家族基因群和非北京家族基因群,非北京家族基因群具有基因多态性,两者与利福平耐药率无明显相关,两者在单531、单516以及531和526利福平耐药位点突变率存在差异.     

79株结核分支杆菌基因分型研究及耐药相关分析

目的通过多位点可变数目串联重复序列(MLVA)分型方法,结合流行病学资料,探讨绵阳地区结核分支杆菌的基因型特征,为本地结核病的防治研究提供科学依据。方法收集结核分支杆菌菌株和患者资料,采用国际上推荐的15个可变串联重复序列位点进行基因分型,应用BioNumerics(Version5.0)软件进行聚类分析,药物敏感性试验采用比例法,率的比较采用χ2检验。结果共对79株结核分支杆菌进行了基因检测,结果显示高度的基因多态性。QUB-11b、MIRU26、Mtub 21和MIRU 16分辨能力更高(HGI>0.7),位点MIRU 4、ETR-A和ETR-C显示分辨能力相对较低(HGI<0.4)。79株菌分为7个基因群,以Ⅲ群和Ⅴ群为主,Ⅲ群占46.8%,Ⅴ群占41.8%,其它群所含菌株较少。复治患者在Ⅲ群、Ⅴ群和其他群中所占比例分别为32.43%、21.21%和11.11%,差异无统计学意义(P>0.05)。Ⅴ群中菌株耐药率高达36.36%,明显高于Ⅲ群(10.81%)和其他群(11.11%),差异有统计学意义(P<0.05)。结论初步证实绵阳地区结核分支杆菌具有明显的基因多态性,主要流行型为Ⅲ群和Ⅴ群,主要耐药型为Ⅴ群,应加强Ⅲ群和Ⅴ群菌株的流行监控,加强Ⅴ群菌株的耐药性监测。     

华东部分农村地区结核分枝杆菌的VNTR-MIRU分子特征

 目的  评价VNTR-MIRU分型方法在结核病流行病学中的应用,并描述华东部分农村地区结核分枝杆菌的基因型分布及成簇特征。方法  对浙江省宁波市鄞州区及江苏省盐城市阜宁县从2009年6月1日至2010年11月31日登记的结核病患者的结核分离菌株采用VNTR-MIRU方法进行分型,通过Hunter-Gaston指数(HGI)及遗传差异值(h)对MIRU位点进行分辨力及遗传差异性评价,同时进行问卷调查以收集患者的社会人口学及临床治疗信息。结果  在297株结核杆菌分离株中发现了281种基因型,近期传播比例为5.4%,MIRU位点组合的分辨力(HGI)为0.9995,7个位点的分辨力大小依次为:VNTR3820>Qub18>Qub11a>MIRU26>Qub11b>Mtub21> Qub26,位点的h大小排序与分辨力的大小排序相同,遗传差异性最大的位点为VNTR3820 (h=0.8794),最小的为Qub26 (h=0.6613)。比较两个研究地区的结核枝杆菌成簇特征,阜宁县菌株成簇率为19%,而鄞州区无菌株成簇,均呈现“唯一”基因型,这种差异的产生很可能与当地的人口迁徙有关。结论  7位点VNTR-MIRU分型法对结核枝杆菌进行分型简便快速,而且具有较高的分辨力,适合于结核的大规模快速检测。我国华东农村地区结核的流行以既往感染复燃为主,并存在一定比例的近期传播。     

结核分枝杆菌北京基因型菌株与耐药表型的关系

目的 研究我国结核分枝杆菌北京基因型菌株的分布以及与耐药表型的关系.方法 2008年4～12月从我国6个区域收集痰涂片阳性的结核病患者的临床分离株,每一患者的一份分离株经生化方法鉴定为结核分枝杆菌复合群.收集患者的性别、年龄、病史、菌株耐药谱和菌株来源资料.药物敏感性实验采用比例法.运用间隔区寡核苷酸分型方法或基因dnaA-dnaN之间插入序列136110鉴定北京基因型菌株.结果 在410份结核分枝杆菌分离株中,67.1%(275/410)的分离株属于北京基因型菌株,东北部区域感染北京基因型菌株患者的比例高于中西部区域(χ2=20.50,P=0.000).患者的年龄、性别和治疗史与感染北京基因型菌株无关.在耐多药菌株和耐利福平菌株中,北京基因型菌株的比例显著高于非北京基因型(P=0.002,P=0.005).结论 患者的年龄、性别和治疗史与感染北京基因型菌株无关,东北部区域北京基因型菌株分布比例显著高于中西部区域.北京基因型菌株与利福平耐药和耐多药有关.     

北京市复治结核病患者非北京基因型菌株谱系及耐药分析

目的 了解北京市复治结核病患者非北京基因型菌株谱系及耐药情况,为复治非北京基因型结核病患者有效防治提供科学依据。方法 采用RD105基因缺失法对复治患者所分离的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）进行检测,筛查出非北京基因型菌株,使用可变数目串联重复序列基因分型实验分析非北京基因型菌株的遗传特征,再使用比例法药敏实验及全基因组测序分析其耐药情况。结果 134例复治结核病患者所分离的MTB中,北京基因型为 125例（93.3%）,非北京基因型为9例（6.7%）。9例非北京基因型MTB呈现9种不同的基因型,均不成簇,为独特型。9例非北京基因型MTB均为谱系4,其中,亚谱系L4.4有4株,亚谱系L4.5有5株。耐药预测结果显示,9例非北京基因型中,6例为全敏感菌株（66.7%）,1例单耐异烟肼,耐药突变位点为ahpC_c.-48G>A,1例同时耐异烟肼与乙硫异烟胺, 耐药突变位点为fabG1_c.-15C>T,1例单耐氟喹诺酮,耐药突变位点为gyrA_p.Asp94Asn与gyrA_p.Ala90Val。全基因组测序预测耐药结果与比例法药敏结果完全一致。结论 复治结核病患者非北京基因型菌株主要为谱系4,呈明显的多态性。耐药突变位点均为常见突变位点。     

南昌地区49株结核分枝杆菌的耐药性初探

目的本研究从结核分枝杆菌的药敏情况初探南昌地区49株结核分枝杆菌的耐药分布特征。方法收集2012年9月至2013年7月间江西省胸科医院住院和门诊痰培养阳性病人标本49份,转种后按照《全国结核病细菌学操作规程》采用绝对浓度法对4种一线药物异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)、乙胺丁醇(EMB)和5种二线药物对氨基水杨酸(PAS)、卷曲霉素(CMP)、丙硫异烟肼(TH1312)、丁胺卡那(AMK)、左氧氟沙星(LVFX)进行低/高两个浓度的药物敏感性试验。结果 49株阳性菌株的总耐药率达81.6%,对一线药物全敏的9株,占18.3%;单一耐药的1株,占2.0%;MDR 39株,占79.6%,其中XDR 25株,占51.0%。结论本地区的结核分枝杆菌耐药现象已普遍存在,且趋向于多种耐药,易发展成MDR、XDR,提示临床拟考虑联合用药。二线药物中CMP的耐药性普遍偏高。     

Xpert MTB/RIF试验检测结核分枝杆菌及其耐药性研究

目的 探讨利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术(Xpert MTB/RIF)在检测结核分枝杆菌(M.tubercutosis,MTB)及其利福平耐药性方面的应用价值.方法 收集151例疑似结核患者标本,分别进行液体变色培养基培养、涂片镜检、传统比例法药敏试验以及Xpert MTB/RIF试验检测,分析Xpert MTB/RIF试验检测MTB及其耐药性的敏感度和特异度.结果 以液体变色培养基培养试验作为金标准,Xpert MTB/RIF试验检测MTB的敏感度和特异度分别为75.8％(25/33)和79.7％(94/118),两者一致性好(K=0.472).以传统比例法药敏试验为金标准,Xpert MTB/RIF试验检测利福平耐药的敏感度和特异度分别为80.0％(4/5)和89.3％(25/28),两者一致性好(K=o.595).结论 Xpert MTB/RIF试验检测MTB及其耐药性具有较高的灵敏度和特异度.     

RD105基因缺失法和双重PCR法对125株结核分枝杆菌菌株基因分型检测

目的 为明确比较RD105基因缺失法和双重PCR法对辽宁地区结核分枝杆菌中北京家族菌株的检测能力，同时掌握辽宁地区结核杆菌中北京家族菌株的流行情况而进行该项研究。方法 选取2011—2013年间辽宁省内各地市临床分离菌株，随机抽取经传统方法菌种鉴定为结核分枝杆菌的菌株，共计125株。选用超声破碎法提取菌株DNA，应用RD105基因缺失法和双重PCR法，同时对收集到的125株结核分枝杆菌进行特异性扩增，最后使用琼脂糖凝胶水平电泳对扩增的结果进行判断。结果 两种方法判断标准为：RD105基因缺失法结果中，出现283 bp大小片段的为北京家族菌株，不出现特异性条带的为非北京家族菌株；双重PCR法结果中，只出现393 bp大小片段的为北京家族菌株，而只出现570 bp大小片段为非北京家族菌株。使用上述两种方法鉴定本研究的125株结核分枝杆菌，结果完全相同，其中北京家族菌株有110株（88%），非北京家族菌株有15株（12%）。结论 RD105基因缺失法和双重PCR法对辽宁地区结核分枝杆菌中北京家族菌株的检测能力相当，并且北京家族菌株在辽宁地区流行的结核分枝杆菌中为绝对优势株；两种方法相对于传统的Spoligotyping法更简单、更省时，检测成本也较低，更适合在我国多数实验室推广应用。     

Molecular epidemiology of Mycobacterium tuberculosis in Gansu province of China

Background  Mycobacterial interspersed repetitive units-variable number tandem repeat (MIRU-VNTR) and Beijing family typing based on detecting the deletion of RD105 sequence are two common genotyping methods used to study the molecular epidemiologic characteristics of Mycobacterium (M.) tuberculosis. We collected 218 strains of M. tuberculosis between 2004 and 2006 in the Linxia Hui Autonomous Prefecture of Gansu province in Northwest China.

Methods  MIRU-VNTR analysis and Beijing family typing based on detecting the deletion of RD105 sequence were used to type the 218 strains, and their typing power was evaluated to look for practical and efficient genotyping methods suitable for the region.

Results  The MIRU typing yielded 115 distinct genotypes, including 98 unique isolates and 17 different clusters containing 120 isolates (55.05%); the cluster rate was 47.25%. By detecting the deletion of RD105 sequence, 188 of 218 (86.23%) isolates belonged to Beijing family. Combination of Beijing family typing and MIRU typing yielded 118 distinct patterns, including 101 unique isolates and 17 clusters containing 117 isolates (54.13%). The largest cluster contained 58 strains with MIRU genotype of 223325173533 which contained 50 strains belonging to Beijing family and 8 strains belonging to non-Beijing family.

Conclusions  The Beijing family strains occupied a large proportion and the Beijing family MIRU genotype 223325173533 is a dominant strain in Linxia of Gansu. Combining detecting the deletion of RD105 and MIRU typing together provides a simple, fast, and effective method which is low in cost and might be practical and suitable for M. tuberculosis genotyping in China.

     

海南地区484株结核分枝杆菌菌株基因型特征分析

目的 了解海南地区结核分枝杆菌不同基因型流行特征,探讨基因分型用于评价本地区结核病控制中的应用价值。方法 本研究选取海南医学院第二附属医院自2013-2016年所有培养阳性结核分枝杆菌484株,采用SNP和Gao等推荐的12位点可变数目串联重复序列（variable number tandem repeat, VNTR）进行基因分型。结果 2013-2016年期间,484株结核分枝杆菌菌株中,北京基因型菌株279株,占57.6%,非北京基因型菌株205株,占42.4%,北京基因型菌株中包括91株(32.6%)古代北京基因型和188株(67.4%)现代北京基因型。北京基因型所占比例在四年间无显著变化,从2013年的59.6%到2016年的57.6%。采用3个高变VNTR位点基因分型后,成簇菌株数为0。结论 海南地区结核分枝杆菌存在明显的VNTR基因多态性,主要流行株仍以北京基因型为主,北京基因型所占比例在四年期间无显著性变化,且菌株成簇率较低,提示近期传播率低。     

Evaluation of four candidate VNTR Loci for genotyping 225 Chinese clinical Mycobacterium tuberculosis complex strains

Objective To evaluate four candidate variable number tandem repeat (VNTR) loci for genotyping Mycobacterium tuberculosis complex strains.Methods Genomic sequences for two M.tuberculosis strains (CCDC5079 and CCDC5180) were generated,and using published sequence data,four candidate VNTR loci were identified.The VNTRs were used to genotype 225 Chinese clinical M.tuberculosis complex strains.The discriminatory power of the VNTRs was evaluated using BioNumerics 5.0 software. Results The Hunter-Gaston Index (HGI) for BJ1,BJ2,BJ3,and BJ4 loci was 0.634,0.917,0.697,and 0.910,respectively.Combining all four loci gave an HGI value of 0.995,thus confirming that the genotyping had good discriminatory power.The HGI values for BJ1,BJ2,B J3,and BJ4,obtained from Beijing family strain genotyping,were 0.447,0.878,0.315,and 0.850,respectively.Combining all four loci produced an HGI value of 0.988 for genotyping the Beijing family strains.We observed unique patterns for M.bovis and M.africanum strains from the four loci.Conclusion We have shown that the four VNTR loci can be successfully used for genotyping M.tuberculosis complex strains.Notably,these new loci may provide additional information about Chinese M.tuberculosis isolates than that currently afforded by established VNTR loci typing.     

可变串联重复序列分析在辽宁省结核分枝杆菌基因分型中的应用

目的 了解辽宁省81例结核分枝杆菌多位点数目可变串联重复序列分析（variable number of tandem repeats,VNTR）的基因多态性及近期传播情况。方法 对2018年辽宁省内送至辽宁省疾病预防控制中心实验室的菌株进行传代后采用对硝基苯甲酸（p-nitrobenzoic acid, PNB）培养基进行菌群鉴定,以区分结核分枝杆菌复合体和非结核分枝杆菌。采用固体比例法利用罗氏培养基对4种一线抗结核药物进行药敏实验。以PCR为基础对标准24位点进行检测分析,利用RD105基因缺失法鉴定北京基因型。利用Microsoft Excel软件进行多态性分析,利用https://www.miru-vntrplus.org/MIRU/index网站得到VNTR基因分型结果,同时进行位点多态性和成簇率的计算。采用SPSS 23.0软件进行数据的统计描述,对计数资料或各年度耐药情况进行χ²检验;当理论频数<5时,采用Fisher确切概率法计算双侧P值,检验水准α=0.05。结果 经分析81株菌株可分为3个基因群（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）,菌株数分别为1（1.23%）、4（4.94%）和76（93.83%）,其中最大的基因群为Ⅲ群。成簇率为4.94%（4/81）。近期感染率最小估计值为2.47%（2/81）。24个VNTR位点中有 5个位点的多态性较好,3个位点的多态性尚可,16个位点的多态性较差。结论 初步证实辽宁省耐药结核分枝杆菌菌株存在明显的基因多态性,其主要流行型为北京基因型（Ⅲ群）。     

Genetic Diversity and Drug Susceptibility of Mycobacterium tuberculosis Isolates in a Remote Mountain Area of China

Objective

We determined the genetic diversity of Mycobacterium tuberculosis (MTB) in a remote mountainous area of southwest China and evaluated the resolving ability of single nucleotide polymorphism (SNP) genotyping combined with variable number tandem repeat (VNTR) genotyping for Beijing family strains in association with drug resistance status.

广东省结核病流行菌株研究

目的：从分子流行病学的角度探讨广东省结核分支杆菌菌株流行的分布。方法：构建广东省74株临床分离的以RFLP为基础的结核分支杆菌的IS6110 DNA指纹图谱技术，确诊结核分支杆菌菌株的流行分布。结果：24．3％（18／74）的结核菌株的IS6110 DNA指纹相似值在1－0．65之间，鉴定结果为它们均是“北京家族”结核分支杆菌菌株。结论：广东省结核菌株流行主要存在着遗传关系接近，在基因水平上相关程度较高的“北京家族”结核分支杆菌菌株，且该家族菌株正以一定的比例在我省流行。     

Transmission of extensively drug-resistant and multidrug resistant Mycobacterium tuberculosis in families identified by genotyping

Background Diagnosis and appropriate treatment of multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) remain major challenges.We sought to elucidate that persons who share a household with drug resistance tuberc...