黄瓜籽总皂苷对MC3T3-E1细胞分化及SPARC、OPG/RANKL表达的影响

目的观察黄瓜籽总皂苷提取物(cucumber seed saponins,CSS)对小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化和矿化的影响,以及与骨质疏松相关的SPARC、OPG/RANKL/RANK信号通路的作用。方法通过MTT实验、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性检测、茜素红染色,考察不同浓度CSS对MC3T3-E1细胞增殖、分化及矿化的影响;采用RT-PCR方法检测SPARC、OPG/RANKL mRNA表达水平; Western blot检测SPARC、OPG/RANKL的蛋白表达量。结果与阳性对照组相比,CSS能明显促进MC3T3-E1细胞增殖(P0.05),CSS高、中剂量组能明显提高MC3T3-E1细胞ALP活性及钙化结节数量(P0.05);与空白组相比,CSS不同剂量组均明显上调SPARC、OPG/RANKL mRNA及蛋白表达水平(P0.05)。结论黄瓜籽总皂苷能够促进成骨细胞MC3T3-E1的增殖、分化及矿化能力,并通过上调SPARC、OPG/RANKL的表达水平提高MC3T3-E1细胞的成骨能力。     

续苓健骨汤含药血清对MC3T3-E1细胞分化及增殖的影响

目的探讨续苓健骨汤含药血清对MC3T3-E1成骨细胞分化及增殖的影响。方法制备续苓健骨汤含药血清,实验分为空白对照组、含药血清低剂量组、中剂量组和高剂量组。采用CCK-8法和流式细胞术检测续苓健骨汤含药血清对MC3T3-E1细胞增殖和细胞周期的影响;碱性磷酸酶(ALP)活性测定MC3T3-E1细胞的成骨分化能力;茜素红染色检测MC3T3-E1细胞的矿化能力;实时荧光定量PCR检测成骨分化基因Runx2、OC、Bmp2、Col1a1mRNA水平。结果与空白对照组比较,中、高剂量续苓健骨汤含药血清能促进MC3T3-E1细胞增殖、S期细胞比率和细胞增殖指数,并且呈现一定的剂量依赖性;同时中高剂量续苓健骨汤含药血清组能明显提高MC3T3-E1细胞ALP活性(P0.01)和钙化能力(P0.01),促进Runx2、OC、Bmp2、Col1a1 mRNA的表达(P0.05)。结论续苓健骨汤含药血清能促进成骨细胞MC3T3-E1的增殖,并通过上调骨形成相关基因Runx2、OC、BMP2、Col1a1的表达水平,提高MC3T3-E1细胞的成骨能力。     

芍药苷促进小鼠成骨分化抗骨质疏松作用的实验研究

目的 探讨芍药苷对MC3T3-E1成骨细胞分化以及小鼠骨质疏松模型的影响。 方法 体外细胞实验分为对照组、不同剂量芍药苷干预组。通过CCK-8法检测芍药苷对MC3T3-E1成骨细胞活力的影响;采用碱性磷酸酶（ALP）染色以及活性检测芍药苷促进MC3T3-E1成骨分化能力;通过茜素红染色检测芍药苷促矿化能力;运用荧光定量PCR、Western blot检测Runx2、OPG、RANKL、Col1α1的mRNA以及蛋白表达情况。选取8周龄C57BL/6小鼠24只,分为假手术组、骨质疏松模型组、药物干预组。选取各小鼠左侧股骨远端以及胫骨近端的区域进行苏木素-伊红（HE）染色、Runx2免疫组织化学以及micro-CT扫描。 结果 中、高剂量芍药苷干预组可以促进MC3T3-E1细胞ALP的活性（P<0.05）;高剂量芍药苷能够促进MC3T3-E1细胞的矿化能力（P<0.01）;同时中、高剂量能够促进OPG、Runx2蛋白的表达（P<0.05）,抑制RANKL的表达（P<0.05）。与假手术组比较,OVX组骨微结构破坏明显,Runx2蛋白表达显著减少（P<0.01）;芍药苷干预后骨质疏松模型小鼠骨小梁数量以及厚度显著增加（P<0.01）,骨小梁间隔减少明显（P<0.01）,Runx2蛋白提升明显（P<0.01）。 结论 芍药苷能够促进成骨细胞的分化,上调成骨分化基因,改善骨质疏松模型小鼠的骨微结构,具有抗骨质疏松治疗的潜在价值。     

蓇密钙片与马鹿角多肽对成骨细胞增殖分化的研究

目的观察蓇密钙片及马鹿角多肽对鼠胚成骨细胞MC3T3-E1的增殖分化作用及细胞内OPG、RANKL mRNA的表达。方法采用MEM(10%FBS)培养液培养细胞,细胞计数法描绘成骨细胞生长曲线;MTT法检测蓇密钙片(0、50、100、500、1000μg/ml)、马鹿角多肽(0、5、50、500μg/ml)和钙尔奇D对照组对鼠胚成骨细胞MC3T3-E1增殖的作用;蓇密钙片(0、50、100、500、1000μg/ml)、马鹿角多肽(0、5、50、500μg/ml)和钙尔奇D对照组干预鼠胚成骨细胞MC3T3-E1 72 h后,比色法检测细胞内碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的含量,RT-PCR法检测骨保护蛋白(osteoprotegerin,OPG)、核因子КB激活受体配体(receptor activator of NK-КB ligand,RANKL)mRNA的表达。结果蓇密钙片及马鹿角多肽作用于MC3T3-E1成骨细胞72 h后,可促进其增殖,OD值增加(P0.05),增加ALP的含量,促进OPG mRNA表达,同时抑制RANKL mRNA表达。结论蓇密钙片及马鹿角多肽促进MC3T3-E1成骨细胞增殖分化,可能与促进成骨细胞OPG mRNA表达、抑制RANKL mRNA表达有关,从而促进骨形成,抑制骨吸收。     

健骨胶囊对成骨样细胞MC3T3-E1增殖及分化作用机制

目的 探讨国医大师刘柏龄“健骨胶囊”对MC3T3-E1成骨细胞分化及增殖的影响。方法 制备健骨胶囊水提物,采用CCK-8法和细胞迁移实验检测健骨胶囊提取物对MC3T3-E1细胞增殖和细胞迁移的影响;茜素红染色检测MC3T3-E1细胞的矿化能力;实时荧光定量PCR检测成骨分化基因Runx2、OCN、OPN、Col1a1、ALP、Bcl2、RASSF1A等mRNA表达水平;蛋白质印迹法Western blot检测Col1a1、Bcl2的蛋白表达水平。结果 通过实验结果比对得出,健骨胶囊提取物能促进MC3T3-E1细胞增殖、使细胞迁移率提高;同时健骨胶囊提取物组能明显提高MC3T3-E1细胞钙化能力(P＜0.01),促进Runx2、OCN、OPN、Col1a1、ALP、Bcl2的mRNA表达(P＜0.05),上调Col1a1、Bcl2蛋白量的表达。结论 健骨胶囊能促进成骨细胞MC3T3-E1的增殖及细胞迁移能力,并通过上调成骨基因的表达水平如Runx2、OCN、OPN、Col1a1、ALP、Bcl2等,提高MC3T3-E1细胞的成骨能力。     

替诺福韦酯对小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖、凋亡及矿化的影响

目的探讨富马酸替诺福韦酯(Tenofovir disoproxil fumarate,TDF)对体外培养小鼠胚胎前体成骨样细胞MC3T3-E1增殖、凋亡及矿化的影响。方法体外培养MC3T3-E1细胞,分为正常细胞对照组、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)对照组、TDF处理组(50 nM、500 nM、5000 nM、50000 nM、250000 nM、500000 nM),干预24 h、48 h。cell counting kit-8(CCK8)试剂盒检测细胞增殖抑制率,ANNEXIN V/7AAD凋亡试剂盒检测细胞凋亡率,茜红素染色检测钙结节形成。结果TDF对MC3T3-E1成骨细胞的增殖和凋亡的影响受TDF浓度和干扰时间的影响,即低浓度对增殖和凋亡无影响,高浓度抑制增殖并促进凋亡,并随干扰时间增加,增殖抑制率和促凋亡率增大,并抑制MC3T3-E1成骨细胞钙结节形成;结论在血药浓度(约500 nM)时,TDF对MC3T3-E1成骨细胞增殖和凋亡无影响,但抑制钙结节形成,进而影响成骨,可能是导致TDF相关性骨量减少和骨质疏松的因素之一。     

Transwell小室内建立小鼠成骨-破骨细胞共培养体系

目的 :Transwell小室内建立体外小鼠成骨-破骨细胞共培养体系,并检测体系对成骨及破骨细胞活性的影响。方法:体外培育小鼠成骨细胞MC3T3-E1和小鼠单核巨噬细胞RAW264.7,RANKL诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7分化为成熟破骨细胞后,于Transwell小室内建立成骨-破骨细胞共培养体系。通过CCK-8实验、茜素红染色、TRAP染色检测细胞的成骨、破骨活性。采用PCR、Western Blot方法检测成骨细胞MC3T3-E1中OPG、ALP、RANKL、TGF-b1的基因表达以及RANKL的蛋白表达,检测破骨细胞RANK、NF-κB的基因表达和蛋白表达。结果 :小鼠成骨细胞MC3T3-E1和小鼠破骨细胞可在Transwell小室内建立共培养体系;共培养体系影响小鼠成骨细胞与破骨细胞的分化活性,镜下可见成骨细胞分化增多,破骨细胞分化稍减少。共培养体系中成骨细胞基因OPG(0.65±0.08)、ALP(0.16±0.01)较单独培养OPG(1.00±0.08)、ALP(1.01±0.16)表达下降,而TGF-b1(4.42±0.21)、RANKL(4.12±1.04)较单独培养组TGF-b1(1.00±0.10)、RANKL(1.00±0.09)表达上升;破骨细胞相关RANK(0.63±0.06)、NF-κB(0.64±0.08)基因表达较单独培养组的RANK(1.00±0.08)、NF-κB(1.00±0.09)下降,差异均有统计学意义。同时共培养组的OPG(0.43±0.05)、NF-κB(0.59±0.05)的蛋白表达较单独培养组的OPG(0.84±0.06)、NF-κb(1.13±0.03)减少;共培养组RANKL(0.54±0.03)的蛋白表达则较单独培养组的RANKL(0.31±0.03)增加,差异有统计学意义,均与基因表达变化趋势一致。结论:小鼠成骨细胞MC3T3-E1和小鼠破骨细胞可在Transwell小室内建立共培养体系,共培养体系中成骨细胞活性高于破骨细胞活性。     

痩素对小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖及OPG/RANKL mRNA表达的影响

目的初步探讨瘦素对小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞增殖及骨保护蛋白、核因子κB激活受体配体mRNA表达的影响。方法以小鼠成骨细胞MC3T3-E1为体外实验模型,用MTT法检测瘦素作用MC3T3-E1细胞后的增殖情况,RT-PCR方法检测OPG、RANKL mRNA表达。结果瘦素（10、20、40、80和160ng.mL-1）作用于MC3T3-E1细胞24h后,可促进其增殖,OD值显著增加（P〈0.01）,增加骨保护蛋白mRNA表达,同时降低核因子κB激活受体配体mRNA表达,且呈浓度依赖性。结论瘦素促进MC3T3-E1细胞增殖,同时通过调节骨保护蛋白mRNA和核因子κB激活受体配体mRNA的表达,从而促进骨形成,抑制骨吸收。     

流体剪切力对MC3T3-E1细胞OPG、RANKL蛋白表达的实验研究

目的探讨流体剪切力(fluid shear stress,FSS)作用下,两种调节骨骼重建的重要分子骨保护素(osteoprotegerin,OPG)和细胞核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)的蛋白表达情况。方法采用体外模型对MC3T3-E1细胞加载流体剪切力,细胞经不同时间加力后(0,30,60,90,120min),对细胞分别进行染色和裂解,运用免疫荧光和蛋白印迹法对OPG和RANKL的蛋白表达水平进行定量分析。结果 FSS作用30,60,90,120min后能够显著增加OPG的蛋白表达(P0.05),减少RANKL的蛋白表达(P0.05)。两者共同作用使得OPG/RANKL值显著增高(P0.05)。结论流体剪切力刺激提示OPG/RANKL的比值可能在成骨细胞和破骨细胞联合调节骨骼形成和吸收的过程中起着重要的调节作用。     

高铁培养环境对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化的影响

目的 观察高铁培养环境下小鼠前成骨样细胞MC3T3-E1增殖、分化指标的变化趋势,探讨铁离子对 成骨细胞增殖、分化的影响。方法 小鼠前成骨样细胞MC3T3-E1在37℃条件下体外培养,在10mmol/Lβ-甘 油磷酸和50μg /mL抗坏血酸的诱导分化的作用下,分化为成骨细胞,同时用不同浓度(50、100、 200μmol/L)枸橼酸铁铵(FAC)干预,用MTT法检测细胞的增殖活性,RT-PCR法检测成骨细胞分化基因成骨 相关转录因子(Runx2) 、锌指结构转录因子(Osterix) 、骨唾液酸蛋白(BSP)和骨钙素(OC)的表达,碱性 磷酸酶(ALP)活性试剂盒检测细胞碱性磷酸酶活性。结果 MC3T3-E1细胞的增殖活性、成骨分化相关基因的 表达以及ALP水平随FAC干预浓度的增加呈剂量依赖性降低(P<0.05)。结论 高铁培养环境可明显抑制小鼠 前成骨样细胞MC3T3-E1的增殖和分化。     

3-溴丙酮酸对前列腺癌PC-3细胞增殖、迁移及侵袭的影响

目的:观察3-溴丙酮酸(3-BrPA)对前列腺癌细胞PC-3增殖、迁移和侵袭能力的影响,并初步探讨其内在机制。方法:体外培养PC-3细胞,倒置显微镜下观察不同浓度3-BrPA对PC-3细胞形态学的影响;应用MTT法、细胞划痕和Transwell法检测不同浓度3-BrPA在不同时间段(24、48、72 h)对前列腺癌PC-3细胞增殖、迁移和侵袭的影响;应用Western印迹检测3-BrPA作用后各组PC-3细胞葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)和基质金属蛋白酶14、9、2(MMP-14、MMP-9、MMP-2)蛋白表达的变化。结果:在一定浓度范围内,随着3-BrPA浓度的升高,细胞形态的改变愈明显。MTT结果表明,随着3-BrPA浓度的增加、作用时间延长PC-3细胞抑制率增大(P<0.01)。细胞划痕和Transwell细胞侵袭实验显示:与对照组相比,培养24 h后25、50、100μmol/L 3-BrPA浓度组细胞划痕迁移愈合率降低,细胞侵袭数目减少,且培养48 h与24 h相比,各组细胞迁移愈合率和侵袭细胞数目均降低,表明细胞体外迁移率和侵袭细胞数目与3-BrPA作用浓度、作用时间有关,具有剂量和时间依赖性(P<0.01)。Western印迹检测结果表明:与对照组相比,25、50、100μmol/L 3-BrPA浓度组中GLUT1、MMP-14、MMP-9、MMP-2蛋白表达量明显降低(P<0.01)。结论:糖酵解抑制剂3-BrPA降低PC-3增殖、迁移和侵袭能力,可能与下调GLUT1、MMP-14、MMP-9及MMP-2蛋白表达有关。     

Effects of triiodothyronine on morphology, growth behavior, and the actin cytoskeleton in mouse osteoblastic cells (MC3T3-E1)

We investigated the effects of thyroid hormone treatment on morphology, growth behavior, and cytoskeletal structures of long-term cultured MC3T3-El cells. Morphological investigations were carried out on native cells by phase contrast microscopy and on epon-embedded semithin sections. The area covered by the cell and matrix layers (tissue-like area), percent extracellular matrix, average height of tissue-like area, and length and height of single cells were measured histomorphometrically on the cross sections. F-actin was analyzed histochemically and quantitated after fluorochrome-labeled phalloidin staining using confocal microscopy and fluorometry. Significant differences between control and T₃-treated cells were found after confluency, but not in subconfluent cultures. Control cells continued to proliferate forming multilayers, and produced increasing amounts of extracellular matrix. In contrast, T₃-treated cells stopped to proliferate forming two cell layers at the maximum. These cells were flattened, distinctly enlarged, and polygonal in shape. Histochemical staining for F-actin revealed three different staining patterns, depending on the position of the cell within the multilayer of control cultures. Basal cells contained a large number of thick stress fibers in parallel arrangement. Intermediate cells exhibited only a few thick actin filament bundles located at the outermost periphery. The superficial cells were characterized by a large number of thin, parallel-oriented microfllament bundles extending across the entire cytoplasm. The actin pattern of T₃-treated cells resembled that of the basal cell layer of the control cells. The amount of F-actin increased with the prolonged T₃ treatment. We conclude from these data that the known specific cellular responses to T₃ treatment are accompanied by significant morphological alterations indicating pivotal effects of thyroid hormones on osteoblastic differentiation.     

Actin and microtubule cytoskeletons of the processes of 3D-cultured MC3T3-E1 cells and osteocytes

Cell shape is the most critical determinant of cell function and is potentially influenced by the organization of a cell's cytoskeletal components. It has been reported that three-dimensionally cultured osteoblasts have a morphology that closely resembles that of osteocytes, most notably including formation of processes. We have previously shown the critical differences between cytoskeletal components in osteoblasts and osteocytes in two-dimensional culture. We have now extended that investigation to the cytoskeletal components of 3D-cultured osteoblasts and osteocytes using 3D cultures of the osteoblast cell line, MC3T3-E1, and primary osteocytes grown in collagen gel. Three-dimensional fluorescent image reconstructions for actin, fimbrin, alpha-actinin, myosin, tropomyosin, and microtubules were made using IMARIS software. Actin, fimbrin, alpha-actinin, myosin, and tropomyosin all appeared in the processes of both cell types, but fimbrin and myosin showed differences in their distribution patterns between cell types. Microtubules were limited in distribution to the proximal region of osteocyte processes but extended the entire length of MC3T3-E1 cell processes. Microtubules were essential for the integrity and formation of MC3T3-E1 cell processes, but osteocyte processes were dependent on actin. These results showed that there are significant differences between the actin and microtubule cytoskeletons in the processes of 3D-cultured MC3T3-E1 cells and in the processes of 3D-cultured primary osteocytes. These differences in the cytoskeleton of the processes of 3D-cultured osteoblasts and of osteocyte dendrites suggest that osteoblast processes may have a different functional role than the osteocyte dendritic network. An erratum to this article is available at .     

新型接头蛋白CARMA3在肝癌HepG2细胞中的表达与意义

目的观察新型接头蛋白CARMA3在肝癌HepG2细胞中的表达,以及CARMA3在G蛋白偶联受体诱导核转录因子κB(NF-κB)激活中的作用。方法提取肝细胞肝癌的总mRNA和蛋白,用逆转录PCR、免疫沉淀和免疫印迹方法检测肝脏肿瘤细胞中CARMA3基因和蛋白的表达水平。负显性CARMA3质粒转染肝脏肿瘤细胞24 h后用溶血磷脂酸(LPA)诱导NF-κB的激活,提取胞浆蛋白和核蛋白,用免疫印迹和电泳迁移试验检测负显性CARMA3的表达和IKK及NF-κB的活化。结果肝细胞肝癌表达CARMA3。在肝脏肿瘤细胞中转染负显性CARMA3后,LPA所诱导IKK和NF-κB的激活被显著抑制。结论肝细胞肝癌表达CARMA3。GPCR(LPA)-CARMA3-NF-κB信号传导通路存在于肝细胞肝癌中。抑制CARMA3的功能可以阻遏GPCR(LPA)所诱导的NF-κB的激活,由此为肝细胞肝癌的治疗提供了新的思路。     

phCMV1和pcDNA3表达人绒毛膜促性腺激素β-C3d3融合蛋白的表达效率比较

目的　比较真核表达载体 phCMV1和pcDNA3在中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞中表达人绒毛膜促性腺激素 β(hCGβ) C3d3融合蛋白的表达效率 ,以获得hCGβ C3d3融合蛋白的高效表达。　 方法　利用高效真核表达载体 phCMV1,构建带有 6个组氨酸纯化标签的融合蛋白表达质粒phCMV1 6His hCGβ C3d3;脂质体法介导phCMV1 6His hCGβ C3d3和pcDNA3 hCGβ C3d3转染CHO细胞 ,G4 18(80 0 μg/ml)筛选抗性克隆 ,G4 18(30 0 μg/ml)维持培养、扩增 ,待阳性克隆 95 % 汇片时换用无血清培养基培养。放射免疫法检测hCGβ表达量 ,Westernblot鉴定表达产物 ,Raji细胞免疫化学染色法鉴定hCGβ与C3d分子的成功融合。反复冻存和复苏高效表达hCGβ C3d3融合蛋白的阳性克隆 ,比较表达效率的变化。用镍柱和凝胶过滤层析纯化表达产物。　结果　酶切鉴定及测序证实 phCMV1 6His hCGβ C3d3构建正确 ,并成功地在CHO细胞中获得了 6His hCGβ C3d3融合蛋白的表达。无血清培液中 2 4、4 8、72h融合蛋白的表达量分别为 4 96、5 2 7、6 33mIU/ml/ 1× 10 6细胞 (以hCGβ含量计算 ) ,phCMV1比 pcDNA3载体的表达效率高 1.4倍。 3次冻存和复苏高效表达hCGβ C3d3融合蛋白的阳性克隆 ,表达效率无明显变化。表达产物经纯化后获得了所需的hCGβ C3d3?     

不同浓度rhBMP-2对MC3T3-E1细胞增殖、ALP活性及成骨分化的影响

目的研究不同浓度rh BMP-2对MC3T3-E1细胞增殖、ALP活性及成骨分化的影响规律。方法 MC3T3-E1细胞接种到培养板24 h后,试验组分别加入1.25、2.5、5、10μg/ml的rh BMP-2进行药物干预,对照组加入全培。试验组应用CCK-8法检测细胞增殖活性,PNPP法检测细胞ALP活性,RT-PCR法检测成骨标志蛋白m RNA的表达情况。结果rh BMP-2浓度为2.5μg/ml时开始促进细胞的增殖(P0.05),rh BMP-2浓度为5μg/ml时促进作用达到峰值(P0.05)。rh BMP-2浓度为2.5μg/ml时ALP活性显著提高(P0.05);rh BMP-2浓度为5μg/ml和10μg/ml时,ALP活性较浓度为2.5μg/ml时继续升高,但差异无统计学意义(P0.05)。ALP、COL1-α以及转录因子RUNX-2的m RNA含量均在加入浓度5μg/ml rh BMP-2后明显升高(P0.05),继续加大rh BMP-2浓度,m RNA含量没有明显增加。结论在研究范围内,rh BMP-2对MC3T3-E1的影响呈浓度依赖性。     

蓝舌病毒湖北株对人前列腺癌PC-3细胞杀伤效应的研究

目的体外实验研究蓝舌病毒湖北株3（BTV-HbC3）对人前列腺癌PC-3细胞的杀伤效应并且初步探讨BTV-HbC3靶向性溶瘤的机制。方法观察PC-3细胞感染BTV-HbC3后所致的病变效应（CPE）变化;透射电镜观察细胞感染病毒后超微结构的变化;CCK-8法研究病毒致细胞病变效应的特征;DNA Ladder分析病毒诱导细胞凋亡的情况;流式细胞仪检测病毒对PC-3细胞凋亡的影响。结果 BTV-HbC3感染PC-3细胞后可见到明显的细胞效应;透射电镜发现胞浆内有大量病毒颗粒和典型细胞凋亡的形态变化;CCK-8法检测到病毒明显抑制细胞生长;DNA Ladder分析见阶梯状条带;流式细胞仪检测到明显细胞凋亡的存在,可见明显的亚二倍体峰。结论 BTV-HbC3在体外可有效地杀伤PC-3细胞,并能诱导其凋亡。