地方品系鸡中一株A亚群鸡白血病病毒的分离和鉴定

将种蛋孵化到9～11 d,分别制备成鸡胚成纤维细胞(chicken fibroblast cells,CEF)培养,再将其细胞上清接种对内源性白血病病毒(avian leukosis virus,ALV)有抵抗力的DF1细胞,从山东某地方品系种蛋中分离到一株外源性ALV,SDAU09E1.用PCR扩增其囊膜蛋白基因(env)并隆测序后,将其gp85序列与已发表的各亚群ALV比较分析表明,该毒株与A亚群6个毒株同源性最高,为89.1%～90.9%,而与已发表的鸡的A、C、D、E亚群ALV的gp85的同源性仅在73.2%～87.9%之间,与目前国内最常见的J亚群的gp85的同源性更是低至30.3%～32.4%.这是我国地方品系鸡群中第一次分离和鉴定出ALV-A及其gp85基因.     

地方特色蛋鸡母本群禽白血病病毒感染的鉴定

研究采用ELISA、病毒分离和PCR方法对地方特色蛋鸡配套系母本鸡群的ALV抗体、抗原和核酸等进行了检测,结果显示受检种鸡群泄殖腔棉拭p27抗原阳性率为47.8％,A/B抗体阳性率为4.3％,未检测到J亚群抗体阳性个体,表明鸡群感染ALV-A/B,同时分离出两株外源性禽白血病病毒并命名为JS12JD01和JS12JD02.PCR扩增其囊膜蛋白基因并测序分析,结果显示JS12JD01株与A亚群参考株的gp85氨基酸序列同源性较高,与B、C、D、E和J亚群参考株同源性仅为32.5％～82.8％;JS12JD02分离株与B亚群参考株的gp85氨基酸序列同源性较高,而与A、C、D、E和J亚群参考株的同源性仅为34.6％～88.7％.表明这两株分离株分属于A、B两个不同亚群,该鸡群存在A、B亚群ALV的混合感染.     

广西凭祥斗鸡禽白血病病毒检测及分离株env基因分析

为了解广西凭祥市特有家禽品种斗鸡禽白血病病毒(ALV)的感染情况,采集了该市3个鸡场斗鸡的肛拭子、血清、血浆样品共344份,用禽白血病ELISA检测试剂盒进行检测。结果显示,斗鸡ALV感染情况严重,其中肛拭样品ALV-p27抗原阳性率高达39.13%,血清样品病毒分离阳性率为12.97%,ALV-J和ALV-A/B抗体阳性率分别为22.39%和7.46%;对从2只斗鸡获得的病毒分离株DJ-3-18和DJ-45进行病毒囊膜蛋白基因env的扩增、序列测定及比较分析,结果显示2株病毒的gp85基因与ALV-A亚群参考株之间氨基酸的同源性为88.2%~96.5%,gp37基因与ALV-A亚群参考株之间氨基酸的同源性为91.4%~98.0%,其中与台湾A亚群蛋鸡源分离株TW-3577的亲缘关系最近,而与ALV其他亚群毒株的同源性则较低。结果表明,首次获得的2株斗鸡源ALV分离株属A亚群。     

K亚群禽白血病病毒细胞受体的鉴定

禽白血病病毒(ALV)进入细胞启动感染依赖于其囊膜表面蛋白gp85与细胞受体的结合。K亚群ALV(ALV-K)是2012年从我国本地芦花鸡中分离到的一个ALV新亚群。为了鉴定ALV-K的细胞受体,本研究利用真核细胞表达了A和K亚群ALV gp85蛋白,并利用实验室前期拯救的重组病毒RCAS-A-GFP和RCAS-K-GFP进行病毒受体的交叉干扰试验,结果显示A亚群ALV(ALV-A)gp85蛋白能够抑制ALV-K的感染,同样ALV-Kgp85蛋白也能够抑制ALV-A的感染,存在受体交叉干扰现象,因而推测二者可能共用细胞受体。已有研究表明Tva是ALV-A的细胞受体,本研究利用Co-IP和Pull-down试验检测了ALV-Kgp85与Tva的互作,结果显示ALV-Kgp85蛋白能与可溶性的Tva(sTva)相互作用。进一步的流式细胞术结果显示ALV-Kgp85能够高效结合Tva,结合率在90%以上。为进一步验证Tva是否能介导ALV-K进入细胞,利用ALV的非易感细胞HEK293T进行了Tva受体重建试验,结果显示RCAS-K-GFP能够进入表达Tva的293T细胞并复制产生较强的绿色荧光。以上结果充分表明Tva也是ALV-K的细胞受体,能够介导ALV-K进入宿主细胞,启动其感染。该研究为阐明ALV-K侵入宿主细胞机制及抗病毒靶点筛选奠定了基础。     

华东地区蛋鸡群中禽白血病的分子流行病学调查

为了解华东地区蛋鸡群中禽白血病的流行情况,2011年3月至2012年10月,从江苏、山东、安徽、上海等省市的蛋鸡养殖场中采集疑似禽白血病病例样品105份,经DF-1细胞分离培养、间接免疫荧光试验鉴定,从中分离禽白血病病毒(ALV)15株,继而对分离毒株gp85基因进行了序列测定和遗传进化分析。结果表明,在所获得的ALV分离株中,有A亚群ALV(ALV-A)3株,B亚群ALV(ALV-B)4株,剩余8株则均为J亚群ALV(ALV-J)。ALV-A、ALVB分离株遗传进化较为稳定,与其原型株(RAV-1、RAV-2)gp85基因核苷酸序列同源性均在98%以上,与我国近年来的地方分离株亲缘关系较远。ALV-J分离株与其原型株(HPRS-103)gp85基因核苷酸序列的同源性在92.8%~94.5%之间。8株ALV-J分离株中,只有1株与蛋鸡ALV-J分离株有较高的亲缘关系,其余均较远,反而与早期的肉鸡分离株有较高的亲缘关系,表明目前于华东地区蛋鸡群中流行的ALV-J可能来源于早期肉鸡分离株的感染。4株ALV-J分离株与我国地方品系HR土鸡的ALV-J分离株HR332J具有很高的亲缘关系,表明ALV-J的感染范围进一步扩大,对地方品系鸡也造成了很大的危害。     

山东不同品系蛋鸡禽白血病流行病学调查

为了解山东不同品系蛋鸡白血病流行情况,作者采集了山东各地区主要引进品系及地方品种鸡的血清3882份、棉拭子2428份和疑似病例41例,对采集样品分别进行了血清学、病理学及病原学检测.结果表明:包括祖代鸡在内的各品系蛋鸡群P27抗原阳性率为19.36%;ALV-A/B亚型抗体阳性率9.29%、ALV-J亚型抗体阳性率5.18%、REV抗体阳性率13.77%;发病鸡群主要是商品鸡群和父母代鸡群,海兰褐祖代鸡群也有发病;病理学诊断证明肿瘤类型主要为髓细胞瘤(27/41)、血管瘤或血管内皮细胞瘤(7/41)、纤维肉瘤(2/41)、平滑肌肉瘤(2/41)及马立克氏病(5/41);PCR检测结果显示,41份病料中有33份为ALV-J阳性(80.49%);22份为MDV阳性(53.66%);两者共感染率高达43.9%;从疑似病例分离到的17株ALV-J病毒gp85基因的同源性为94.0%～100%,与ALV-J原型株HPRS-103 gp85基因同源性为94.3%～98.7%;与其它已发表的分离毒株ALV-J gp85基因的同源性较低(84.4%～96.8%).调查结果表明,目前山东各品系蛋鸡群均存在ALV感染,其中以ALV-J为主,ALV-A和ALV-B同时存在,且存在与MDV、REV的混合感染,病鸡主要表现髓细胞瘤和血管瘤.     

J、K亚群禽白血病病毒的分离和囊膜蛋白(gp85)基因序列分析

为了解现阶段我国禽白血病病毒(ALV)的流行特征和演化趋势,本试验于2021—2022年从国内某鸡场采集蛋清ALV衣壳蛋白(p27)抗原阳性的鸡血浆,接种鸡胚成纤维细胞(DF-1)分离病毒并进行亚群鉴定;采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增分离株的囊膜蛋白(gp85)基因片段,并对其进行测序,将基因序列与ALV不同亚群毒株进行比对和遗传进化分析;选取氨基酸变化差异较大的分离毒株进行间接免疫荧光鉴定。结果显示,共分离到7株ALV毒株(3株J亚群,4株K亚群),ALV-J分离毒株CAU4932、CAU4860和CAU2259的gp85基因片段长度为918 bp,编码306个氨基酸,分离毒株之间gp85基因核苷酸同源性为90.5%～95.2%,gp85蛋白氨基酸同源性为95.1%～99.3%;ALV-K分离毒株CAU7049、CAU5006、CAU7176和CAU7168的gp85基因片段长度为1 008 bp,编码336个氨基酸,分离毒株之间gp85基因核苷酸同源性为89.4%～92.3%,gp85蛋白氨基酸同源性为94.0%～99.7%。gp85蛋白氨基酸序列同源性比对发现,分离株gp8...     

三重PCR和双重荧光探针法检测ALV-A/J亚群方法的建立与应用

为快速检测禽白血病病毒（avian leukemia virus,ALV）并同时鉴别A亚群（ALV-A）和J亚群（ALV-J）,根据ALV不同亚群基因设计特异性引物和Taq Man荧光探针,经优化反应条件,建立通用型、A亚群与J亚群三重PCR以及A亚群与J亚群双重荧光探针检测方法。结果显示：三重PCR检测方法能特异性扩增ALV所有亚群以及A亚群和J亚群,检测灵敏度达1×103拷贝/μL;建立的ALV-A/J双重荧光探针检测方法特异性强,可检测的最低拷贝浓度为40拷贝/μL。本研究建立的三重PCR方法与商品化ALV实时荧光PCR检测试剂盒均有较高的符合率（Kappa系数> 0.75）;针对24份发病鸡精液,ALV-A/J双重荧光探针检测方法与商品化ALV实时荧光PCR检测试剂盒检测结果一致;本研究建立的两种检测方法均能同时鉴别出ALV A亚群和J亚群。利用本研究建立方法对安徽省394份临床样本进行检测,发现ALV总阳性率为38.58%,以J亚群单一感染为主,同时伴有A亚群单一感染以及A/J亚群混合感染。结果表明,本研究建立的ALV-通用型/A亚群/J亚群三重PCR方法和ALV-A/...     

我国进口种鸡群禽白血病及禽网状内皮组织增生症的血清学检测

为了解河北进口种鸡群禽白血病病毒(ALV)及禽网状内皮组织增生症病毒(REV)的感染情况,对实验室留存的2011—2013年间来自美国、加拿大和法国的15批进口种鸡的血清样品450份,通过ELISA方法进行ALV-A、B亚群和REV的抗体检测。结果共有8批28份样品为ALV-A、B亚群抗体阳性,群体阳性率和个体阳性率分别为53.3%和6.2%;未检出REV抗体阳性样品。结果表明目前我国进口种鸡群中存在一定比例的禽白血病病毒A、B亚群抗体阳性个体。     

通过公鸡血液和精液禽白血病病毒分离净化禽白血病的研究

在对种鸡群实施禽白血病净化过程中,检测并淘汰感染公鸡对推进净化极其重要,然而对于以血液病毒分离为准还是以精液病毒分离为准还缺乏准确的参考数据。为此,本研究对中国正在实施禽白血病净化的4个不同品系的种公鸡群同时采集血液和精液分别实施病毒分离,并对其中某蛋鸡场公鸡通过这两种方式分离的病毒进行了gp85基因扩增并分析其同源性与遗传进化关系。病毒分离结果显示,4个鸡群采用血液分离禽白血病病毒(ALV)的阳性率分别为15.51%(188/1212)、3.25%(13/400)、4%(4/100)和2.5%(5/200);采用精液分离ALV的阳性率分别为3.71%(45/1212)、2.75%(11/400)、2%(2/100)和1.5%(3/200);而两种病毒分离结果同时为阳性的公鸡分别有16只、8只、1只和2只。结果表明,血液病毒分离和精液病毒分离结果不完全一致,后者较前者ALV分离的阳性率总体要低。序列同源性分析结果显示,该蛋鸡场阳性公鸡经血液和精液两种方式分离ALV的gp85基因序列(分别为11与9条基因序列)的同源性高达99.0%~100%,所有分离株均与ALV-A亚群参考株同源性为88.6%~99.2%,而与其他各亚群参考株的同源性仅为50.0%~89.6%。遗传进化分析也表明分离株均属于A亚群,表明该蛋鸡场主要以ALV-A亚群感染为主。上述结果提示在禽白血病净化过程中,应对公鸡分别采用血液和精液两种病毒分离方法,任何一种病毒分离结果为阳性的公鸡均应被淘汰。本研究为完善现有禽白血病净化技术方案提供了数据支持,有助于加速种公鸡禽白血病的净化进程。