PCR-SSCP方法用于痰标本中结核分支杆菌耐药基因的检测

目的探讨采用直接检测结核病人痰标本中rpoB基因和KatG基因突变。评价该方法检测结核分支杆菌对利福平（RFP）和异烟肼（INH）耐药性。方法用PCR-SSCP技术分析，对35例耐INH（或含耐异烟肼）、63例耐RFP（或含耐RFP）的肺结核病人痰标本和20例非结核性肺部疾病组痰标本进行rpoB和KatG基因突变的检测。结果以结核分支杆菌H37RV为对照，63例耐RFP痰标本中57例PCR扩增阳性，其中46例SSCP图谱与H37Rv标准株有差异。rpoB突变率为65．2％。35例耐INH肺结核病人痰标本有20例扩增阳性。15例SSCP图谱与H37Rv标准株有差异，突变率为42．8％。20例非结核病人痰标本rpoB基因和KatG基因扩增均为阴性。结论PCR-SSCP技术有望成为结核分支杆菌耐药性检测的重要方法之一。     

结核分支杆菌利福平和链霉素耐药基因的快速检测

目的 :评估采用聚合酶链反应 -单链构象多态性 (PCR SSCP)同时检测rpsL基因、rpoB基因突变在结核分支杆菌耐链霉素 (SM )和利福平 (RFP)耐药性测定中的应用价值。方法 :采用PCR SSCP技术对 86株结核分支杆菌临床分离株rpsL基因、rpoB基因突变同时进行检测。即首先用PCR方法同时扩增RFP、SM的rpoB基因和rp sL基因 ,然后进行SSCP分析。结果 :以结核分支杆菌H3 7RV为对照 ,41株药物敏感株的rpsL基因、rpoB基因均未见SSCP图谱异常。特异性为 10 0 %。 45株同时耐链霉素和利福平的耐药株中 ,3 4株 (75 6% )有rpsL基因图谱异常 ;41株 (90 1% )有rpoB基因图谱异常。结论 :rpoB基因突变和rpsL基因突变与结核分支杆菌耐利福平和链霉素密切相关 ,应用PCR SSCP技术可同时快速检测结核分支杆菌对链霉素和利福平耐药性。     

痰耐药结核分支杆菌rpsL基因的快速检测及链霉素耐药机制研究

[目的]快速检测痰耐药结核分支杆菌rpsL基因及了解链霉素（SM）耐药的分子机制。[ 方法]用PCR方法直接从耐药肺结核患者痰及临床分离菌株扩增rpsL基因片段,对扩增获得的rpsL基因片段进行序列测定,比较分析全耐、对SM耐药的耐多药、对SM敏感的耐多药、全敏感或标准结核分支杆菌株之间的基因序列差异。[结果]于6h内从耐药肺结核痰中快速检测到rpsL基因。从所有临床分离菌珠均扩增获得267bp片段,序列测定比较发现,全耐菌和对SM耐药的MDR—TB菌株均检测有rpsL基因点突变,突变密码子为CCT突变为CTT,而全敏感株和标准菌株均未检测到基因突变。其中从一株对SM敏感的MDR-TB中也检测到突变。[结果]PCR及序列分析方法可快速、准确检测结核分支杆菌rpsL基因及其突变,结核分支杆菌对EMB的耐药性与rpsL基因点突变有关。     

结核分支杆菌链霉素耐药基因的杂交检测

目的 探讨耐链霉素（Sm）结核分支杆菌的编码基因rpsL和ms的扩增以及突变情况。方法 采用PCR扩增技术对23株敏感株，32株耐药株，25例临床结核病人痰标本进行rpsL、ms基因扩增；并利用寡核苷酸探针反相斑点杂交技术对23株敏感株，32株耐药株，25例临床结核病人痰标本进行rpsL、ms基因突变检测。结果 23株敏感株、32株耐药株rpsL、ms基因扩增均阳性，阳性率100％；25例临床结核病人痰标本中rpsL基因扩增阳性率为72％，ms基因扩增阳性率为56％；rpsL基因突变率依次分别为4．3％、65．6％，50％；ms基因突变率依次分别为0、12．5％、7．2％。结论 耐链霉素（Sm）菌株的基因突变率明显高于药物敏感株；PER．寡核苷酸探针反相斑点杂交技术以其简便、快速、灵敏的特性能够为临床检测结核分支杆菌对链霉素（Sm）的耐药性提供初步依据。     

快速检测结核分支杆菌对异烟肼的耐药性的临床应用

目的建立快速检测结核分支杆菌耐药基因的分子药敏方法。方法要聚合酶链反应——单链构象多态性（PCR—SSCP）分析40株结核分支杆菌KatG基因突变。其中20株为异烟肼（INH）敏感株,20株为INH耐药株,用PCR—SSCP图谱鉴定扩增产物有无突变,H37RV标准株作对照．结果所有INH敏感株SSCP带普与对照相同;19株INH耐药株中8株与对照相同,11株有不同程度的差异,INH耐存KatG基因突变或缺失的阴性率为60％。结论多数结核分支杆菌INH是由于其KatGj基因突变所致,用PCR—SSCP筛选突变株可达到快速检测结核分支杆菌INH耐药的目的。     

结核分支杆菌耐异烟肼分子机制的研究

目的探讨耐异烟肼结核分支杆菌KatG基因突变在结核分支杆菌耐异烟肼耐药性测定中的应用价值。方法采用聚合酶链反应——单链构象多态性(PCR-SSCP)分析72株结核分支杆菌KatG基因突变。其中32株为异烟肼(INH)敏感株,40株为INH耐药株,用PCR-SSCP图谱鉴定扩增产物有无突变,H37RV标准株作对照。结果所有INH敏感株SSCP带谱与对照相同;40株INH耐药株中15株与对照相同,25株有不同程度的差异,INH耐药KatG基因突变或缺失的阳性率为62.5%。结论多数结核分支杆菌耐INH是由于其KatG基因突变所致,用PCR-SSCP筛选突变株可达到快速检测结核分支杆菌INH耐药的目的。     

结核分支杆菌rpoB基因突变与对利福平耐药的关系

目的:研究结核分支杆菌耐利福平(RFP)分离株rpoB基因突变情况并评价英应用价值.方法:采用多聚合酶链式反应-单链构象多态性分析法(PCR-SSCP法)对60株结核分支杆菌rpoB基因进行检测.结果:以结核分支杆菌标准株H37Rv为对照,60株PCR扩增阳性的结核分支杆菌中,共有32株发生突变,总突变率为53.3%(32/60);24株药物敏感株有4株rpoB基因有突变,突变率为16.7%;36株耐药株中,28株rpoB基因有突变,突变率为77.8%.耐药菌株突变率明显高于敏感菌株的突变率(P<0.05).结论:rpoB基因突变是耐RFP结核分支杆菌耐药性的主要分子机制;应用PCR-SSCP可快速检测结核分支杆菌对RFP的耐药性.     

中国部分地区结核分支杆菌耐利福平、异烟肼和链酶素耐药基因的检测

目的研究我国部分地区耐利福平（RFP）、异烟肼（硼）和链酶素（SM）结核分支杆菌临床分离株rpoB基因、KatG、rpsL基因突变情况，评价其耐药分子机制。方法采用PCR和聚合酶链反应．单链构象多态性（PCR-SSCP）对373株结核分支杆菌临床分离株（其中敏感株148株，耐RFP、INH、SM株共225株）rpoB基因、KatG和砒基因进行检测。并对其中19株SSCP阴性的耐RFP株用双脱氧末端终止法进行测序分析。结果安徽省、北京市、上海市、河北省、河南省、辽宁省、吉林省结核分支杆菌耐RFP临床分离株rpoB基因突变率分别为90％、91％、90％、91％、90％、93％、91％；KatG基因突变率分别为69％、63％、71％、68％、67％、68％、65％，rpsL基因突变率71％、69％、74％、68％、70％、61％、76％，分别为经统计学处理不同地区间无显著性差异（X^2=0．46，P＞0．05）。同时rpoB基因敏感株均无突变，特异性为100％；KatG基因有3株发生突变，特异性为98％。19株SSCP阴性耐药株中经测序6株在531位密码子TCG→TIE，1株526位密码子CAC→TAC，7株发生在516位密码子GAC→GTC，5株未改变。结论我国不同地区耐利福平、异烟肼和链霉素的rpoB、KatG、rpsL耐药基因突变率大致相同，rpoB基因、KatG和rpsL基因突变分别是耐RFP、INH和SM结核分支杆菌耐药性产生的主要分子机制，PCR-SSCP可快速检测结核分支杆菌RFP、INH和SM耐药性。     

结核分支杆菌喹诺酮耐药基因的研究

[目的]了解结核分支杆菌耐喹诺酮耐药基因突变情况,建立快速分子药敏实验方法。[方法]通过PCR—SSCP和直接测序技术(PCR～DS)分析结核分支杆菌的gyrA基因突变的情况。[结果]以结核分支杆菌标准菌株H37Rv和卡介苗做对照,30株喹诺酮敏感株的gyrA基因的SSCP图谱均泳动正常,测序分析与对照株相同。45株喹诺酮耐药株中,34株(75．6％)gyrA基因SSCP图谱泳动异常;测序证实10株为90位密码子的突变,24株为94位密码子突变,符合率100％。[结论]gyrA基因突变是结核分支杆菌耐喹诺酮的主要分子机制,PCR—SSCP可能成为测定部分结核分支杆菌耐喹诺酮株的简便、快速的方法．并有望直接用于临床标本喹诺酮敏感性试验。     

PCR-SSCP 法检测结核分支杆菌耐药基因

近年来，全球结核病呈现死灰复燃的趋势，其主要原因是耐药（DR-TB）和耐多药（MDR-TB）结核病的广泛分布和迅速传播。作为一线抗结核药物，INH、SM和RFP结核病的预防、治疗方面起着重要作用。但由于单药化疗和不规则化疗，其耐药情况越来越严重。国内外已有报道RFP、INH、SM耐药性的产生是由于rpoB基因、KatG基因和rrsP基因突变所致。而用PCR—SSCP方法直接检测临床标本则少有报道。我们采用PCR—SSCP银染法直接检测临床分离株和临床痰标本中结核分支杆菌rpsL基因、rpoB基因和KatG基因突变，现将结果报告如下。     

链霉素耐药结核分枝杆菌rpsL、rrs基因突变分析

目的：探讨链霉素耐药相关基因rpsL、的突变与链霉素耐药性的关系。方法：采用PCR和PCR～DS技术对66株临床分离株进行rpsL、rrs基因检测和序列分析。结果：常规药敏实验显示20株为链霉素敏感株，46株为链霉素耐药株。20例敏感株中未发现2个基因突变，46株耐多药临床分离株中rpsL 67％，rrs基因突变率为37％，两种基因同时突变率为2％。结论：PCR—DS对耐链霉素结核分枝杆菌的检出率较高，与传统药敏试验互补，对临床耐药性检测和用药有指导意义。     

聚合酶链反应-单链构象多态性技术快速筛选结核杆菌的利福平耐药性

目的：探讨利用分子生物学方法直接快速检测结核分枝杆菌利福平（RFP）药物敏感性的可行性。方法：应用聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）技术分别检测了40株RFP药物敏感及耐药的结核分枝杆菌临床分离株。先用PCR扩增rpoB基因，随后用SSCP方法鉴定其扩增产物有无突变，并与药敏试验结果作对照分析。结果：所有临床分离株均观察到rpoB基因PCR扩增产物。40株RFP敏感的临床分离株SSCP带谱与结核分枝杆菌H37RV标准株相同，40株RFP耐药株中37株检测到突变图谱。与Bactec结果对照，用PCR-SSCP技术检测结核分枝杆菌RFP耐药性的敏感性为93％，特异性为100％。结论：结核分枝杆菌耐RFP是其rpoB基因突变所致。PCR-SSCP技术可用于结核分枝杆菌RFP药物敏感性的直接快速检测。     

临床分离结核分枝杆菌耐药性质与rpoB、rpsL基因变异的研究

目的:对从疑似结核病患者痰液中分离的结核分枝杆菌的rpoB和rpsL基因突变情况进行研究,分别探讨其与耐利福平(RFP)和耐链霉素(SM)之间的关系.方法:采用PCR和DNA测序法对结核分枝杆菌临床分离株和1株卡介苗株(BCG)的rpoB和rpsL基因进行序列分析.结果:分离得到耐利福平27株,耐链霉素25株,经测序分析,所有利福平、链霉素敏感株rpoB、rpsL基因均未发生氨基酸突变;RFP和SM耐药株rpoB和rpsL基因的突变率各为81.5％(22/27)和76％(19/25);耐利福平以Ser531Leu突变最为常见,突变频率为55.6％(15/27),耐链霉素以Lys43Arg位突变最为常见,突变频率为72.0％(18/25).结论:rpoB和rpsL基因突变分别是结核分枝杆菌RFP和SM耐药性产生的主要分子机制,PCR-DNA测序法可快速检测结核分枝杆菌RFP和SM耐药性.     

结核分支杆菌耐异烟肼分子机制的研究

异烟肼（INH）作为最主要的一线抗结核药物之一,对其耐药性的研究日益受到重视。国外也有报道认为结核分支杆菌耐异烟肼的产生是过氧化氢酶一过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关,与inhA基因突变也有相关性。我们采用PCR-单链构象多态性分析（PCR—SSCP）方法检测了95株肺结核病人痰标本临床分离株,并对47例结核病人痰标本直接进行KatG基因、inhA基因突变检测,现将结果报告如下。     

结核杆菌耐药性调查与基因突变分析

目的了解结核分支杆菌耐药性与基因突变情况,分析耐药表型与基因突变的相关性。方法从临床标本中分离培养、鉴定结核分支杆菌;应用药敏试验、单链探针反向杂交试验技术(LiPA)和基因测序分析结核分支杆菌耐药性与基因突变情况。结果50株结核分支杆菌中,12株耐异烟肼(INH),7株耐利福平(RFP),15株耐链霉素(SM),2株耐乙胺丁醇(EMB)。LiPA检测耐RFP菌株,4株rpoB基因531位TCG→TTG突变;耐INH菌株中5株KatG基因315位AGC→ACC突变;耐SM菌株中6株、SM敏感株1株rpsl基因43位AAG→AGG突变,1株耐SM菌株rpsl基因88位AAG→AGG突变;rrs基因未检测到突变;1株耐EMB菌株与1株EMB敏感株的embB基因306位发生ATG→GTG突变。结论本市结核分支杆菌的耐药性增加的趋势显著,加强监测与综合干预非常必要。     

PCR-SSCP法检测结核分枝杆菌L型rpsL耐药基因

目的 探索尘肺结核患者感染的结核分枝杆菌（MT）L型的耐药基因rpsL突变与耐受链霉素（SM）的关系。方法 用PCR—SSCP方法检测rpsL基因,与采用常规SM药敏试验（AST法）的结果进行对比分析。结果 采用AST法检测,52株结核分枝杆菌L型临床分离株中共有26株（50．0％）耐SM;PCR-SSCP法检出rpsL基因突变率为40．4％（21／52）,2种方法检测耐药株的符合率为80．8％。结论 结核杆菌L型对SM的耐药与rpsL基因突变有关。     

PCR—SSCP直接检测临床标本中的结核杆菌rpoB基因突变—附50例报告

目的：探讨聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）直接检测痰标本中的结核杆菌核糖核酸聚合酶亚单位基因（ropB基因,该基因突变便形成结核杆菌利福平耐药株）突变在评价结核杆菌对利福平的耐药性方面的应用价值。方法：以结构杆菌H37Rv株（标准菌株）为对照,应用PCR－SSCP技术直接检测50例痰标本中结核杆菌及培养分离的结核杆菌的rpoB基因突变,并将PCR－SSCP和细菌培养的结果进行比较分析,结果：以细菌培养作为参考方法,PR－SSCP直接检测50例痰标本中的结核杆菌ropB基因突变的敏感性和特异性分别是92％（23／25）和100％（10／10）,用于检测培养分离得到的35株结核杆菌,PCR－SSCP的敏感性和特异性分别为96％（24／25）和100％（10／10）。结论：PCR－SSCP操作简单,快速,准确,可望用于直接检测临床标本中的结核杆菌ropB基因突变,以评价结核杆菌是否对利福平产生耐药性。     

耐多药结核分枝杆菌KatG及rpoB基因变异的研究

目的用聚合酶链反应（PCR）一直接测序法检测肺结核患者临床痰分离株结核分枝杆菌KatG及rpoB基因突变：了解耐药分子机制及探索痰标本结核分枝杆菌耐异烟肼（INH）、利福平（RFP）直接检测的可行性。方法对47例耐INH、RFP的结核分枝杆菌临床痰分离株行PCR一直接测序法检测KatG及rpoB基因突变。结果47例耐INH、RFP分离株结核分枝杆菌KatG及rpoB基因突变阳性分别为29／47（61．7％）、43／47（91．5％），两者同时突变26例（55．3％）。结论PCR一直接测序法敏感、特异，可快速检测结核分枝杆菌KatG及rpoB基因突变，适合于临床肺结核患者痰标本耐药性的快速检测。     

结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药的分子机制及其快速鉴定

目的：了解结核分枝杆菌乙胺丁醇(EMB)耐药的临床分离株embB基因突变的情况，并探索快速检测结核分枝杆菌EMB耐药性的实验方法。方法：应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术和PCR扩增产物测序方法。分析结核分枝杆菌EMB耐药和敏感各30株的embB基因。结果：以结核分枝杆菌H37RV标准株为对照。发现30株EMB耐药株中有11株(36．7％)embB基因扩增产物SSCP泳动异常，部分耐药菌株测序分析证实为306位密码子突变；而30株敏感株的embB基因扩增产物SSCP泳动均无异常。结论：embB基因突变是结核分枝杆菌EMB耐药的重要机制之一；PCR-SSCP技术可能成为一种检测结核分枝杆菌EMB耐药性的准确和快速的实验方法。     

PCR-DNA测序技术检测结核分支杆菌耐多药基因突变的研究

目的应用PCR—DNA测序技术快速检测同时耐利福平和异烟肼结核分支杆菌分离株rpoB、KatG基因突变，评价其在检测结核分支杆菌耐多药性方面的价值。方法47株耐利福平和异烟肼结核分支杆菌临床分离株及30株结核分支杆菌敏感分离株用PCR—DNA测序技术分别检测rpoB、KatG基因突变。结果47株耐多药结核分支杆菌分离株中，检出43株rpoB基因突变，突变检出率为91．5％（43／47）；31株KatG基因突变，突变检出率为66．0％（31／47）；rpoB和KatG基因同时突变者31株，突变检出率为66．0％（31／47）。30株结核分支杆菌敏感株检出1株KatG基因突变。结论PCR—DNA测序技术方法敏感、准确、特异，可快速检测结核分支杆菌rpoB、KatG耐药基因突变，有利于耐多药结核分支杆菌耐药性的快速检测。