成人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的体外研究

目的 探索成人骨髓间充质干细胞在体外定向分化为神经元样细胞的条件。方法 采用Ficoll-paque(1．077g／m1)分离液密度梯度离心从人的骨髓分离出骨髓间充质干细胞，体外扩增到第10代，选择4组不同组合的神经分化诱导条件，分别诱导骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化，通过免疫细胞化学鉴定诱导后细胞神经元烯醇化酶、神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白的表达情况。结果各组诱导剂诱导后，骨髓间充质干细胞分化为具有典型的神经元形态的细胞，免疫细胞化学显示、NF-M呈强阳性反应，NSE表达强度提高，在最佳的分化条件下，即加入bFGF、ATRA、BME、BHA、DMSO诱导条件下，大约80％细胞表达NF—M，86％的细胞为NSE强阳性。结论 成人MSCs在体外可定向诱导分化为神经元样细胞，且具有较高的阳性分化率。     

不同比例心肌细胞诱导骨髓间充质干细胞成心肌样分化的实验研究

目的观察不同细胞比例条件下,心肌细胞(CMs)间接接触对骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌样分化的诱导作用,以确定较高的诱导比例。方法分离培养大鼠BMSCs,与CMs分别以1:1、1:2、1:4、1:5、1:10的比例在体外共培养,14d后采用实时荧光定量聚合酶链反应(Q-PCR)检测各个比例下BMSCs中心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达情况。结果各比例组BMSCs中的cTnT均有一定表达,且表达量随着比例的升高而增加。结论在共培养条件下,不同比例条件下的CMs对BMSCs成心肌样分化的诱导作用不同,随着比例的增加而增强。     

骨髓间充质干细胞与髓核细胞共培养的实验研究

目的：建立骨髓间充质干细胞与髓核细胞共培养的模型,研究间充质干细胞对体外培养的髓核细胞活性的影响。方法：通过transwell插入式培养皿构建间充质干细胞-髓核细胞共培养模型,观察共培养条件下髓核细胞形态变化,计数细胞增殖,ELISA方法检测蛋白多糖含量变化。结果：经过8 d共培养,实验组中的髓核细胞计数较对照组增加明显（P〈0.01）,培养上清液中蛋白多糖合成较对照组明显提高（P〈0.01）。结论：成功建立共培养模型,与间充质干细胞共培养后髓核细胞活性上调。     

骨髓间充质干细胞体外定向诱导心肌样细胞的实验研究

目的研究兔骨髓间充质干细胞（mensenchymal stem cell,MSC）经5-氮杂胞苷（5-azacytidine,5-aza）诱导在体外定向分化为心肌样细胞形态学及分子生物学特征,为心肌样细胞鉴定提供依据。方法取兔髂骨骨髓,分离并培养骨髓间充质干细胞,用5-氮杂胞苷定向诱导向心肌样细胞分化。相差显微镜、透射电镜观察心肌样细胞形态学变化及超微结构特征,RT—PCR检测心房利钠肽、受磷蛋白、β-肌球蛋白重链表达。结果5-氮杂胞苷诱导后,部分细胞体积增大,呈“棒状”或“珠状”结构,有肌管样结构形成,透射电镜下有肌丝、心房颗粒及线粒体等心肌样细胞超微结构形成,RT—PCR检测显示有心房利钠肽、受磷蛋白、β-肌球蛋白重链表达。结论经5-氮杂胞苷诱导骨髓间充质干细胞体外可分化为心肌样细胞。     

人骨髓间充质干细胞缝隙连接通讯功能的研究

目的研究人骨随间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)的细胞间缝隙连接通讯(gap junctional intercellular communication,GJIC)功能.方法透射电镜观察细胞缝隙连接结构,应用荧光光漂白恢复(fluorescence redistribution after photobleaching,FRAP)技术,5,6-CFDA荧光负载hMSCs,激光淬灭细胞内荧光,通过激光共聚焦显微镜测定体外培养的hMSCs的GJIC功能.结果细胞内荧光被淬灭后可通过缝隙连接通道恢复,hMSCs平均荧光漂白恢复率为(35.26 0.76)%.结论缝隙连接是间充质干细胞间的重要通讯方式.     

人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为角膜缘干细胞的研究

目的探讨体外诱导人骨髓间充质干细胞（human bone mesenchymal stem cells,HBMSCs）分化为角膜缘干细胞（limbal stem cells,LSCs）的可行性。方法用密度梯度离心法体外分离HBMSCs,用消化后组织块培养法分离培养LSCs,培养传代后用流式细胞仪检测细胞的相关抗原。将第4次传代的HBMSCs分成2组：实验组细胞与第2次传代的LSCs共培养于Transwell培养板,加入条件培养基;对照组不加任何诱导剂,以原HBMSCs培养基培养。培养10d,在相差显微镜下进行形态学观察。结果实验组共同培养72h后,贴壁HBMSCs部分呈椭圆形、圆形改变。在体外微环境中诱导10d后大部分细胞呈多边形、圆形、椭圆形,少部分细胞呈梭形。实验组P63弱阳性（7.16±0.56）%,对照组P63阴性（0.74±0.49）%。结论在体外特殊的微环境下,HBMSCs可被其诱导分化为LSCs细胞。     

人骨髓间充质干细胞体外分化为肝样细胞的实验研究

目的 探索肝细胞生长因子（HGF）联合成纤维细胞生长因子-4（FGF-4）诱导人骨髓间充质干细胞（HMSCs）向肝细胞方向分化的能力,为生物人工肝及肝细胞移植等找到新的种子细胞来源。方法 分别用HGF、FGF-4、HGF＋FGF-4诱导HMSCs分化为肝样细胞：以未加诱导因素的HMSCs、L-02人肝细胞株为阴、阳性对照组。相差显微镜观察细胞形态的变化：在不同诱导分化阶段免疫细胞化学染色检测AFP和CK18,并用图像分析法计算HMSCs的分化比率;免疫荧光细胞化学染色法检测AFP、ALB的表达;RT-PCR检测AFP和ALB mRNA表达的情况。结果 HMSCs经诱导向肝样细胞转化,变成纺锤形、不规则圆形或多角形细胞。免疫细胞化学染色各诱导组均可检测出AFP和CK18表达,图像分析表明HGF＋FGF-4联合诱导分化的AFP、CK18阳性率最高,HGF次之,FGF-4则较弱;免疫荧光细胞化学染色发现各诱导组AFP、ALB均为阳性表达,而阴性对照组则为阴性表达;各诱导组RT-PCR均可检测出AFP和ALB mRNA的表达,而阴性对照组则没有表达。结论 HGF、FGF-4、HGF＋FGF-4均能诱导HMSCs分化为肝样细胞,分化的肝样细胞能分泌肝细胞特异性产物AFP、ALB、CK18等。以HGF＋FGF-4诱导HMSCs分化为肝样细胞的阳性率最高,HGF次之,FGF-4则较弱。     

骨髓间充质干细胞对大鼠胶质瘤细胞的趋化性实验

目的用Transwell细胞迁移实验观察骨髓间充质干细胞是否具有对C6大鼠胶质瘤细胞的趋向性。方法在Transwell培养板的Transwell上室中放置一定量的用B rdU标记的骨髓间充质干细胞,Transwell培养板的培养孔中分别放置:IMDM培养基、C6细胞条件培养液、MRC-5细胞、C6鼠胶质瘤细胞。将以上Transwell培养板在CO2恒温培养箱中培养2h后,然后取胰酶加入培养孔中消化细胞5min,拿掉Transwell上室,取适量细胞悬液滴加在载玻片上,然后将4%多聚甲醛滴加在载玻片上的细胞上将其固定30min,然后对载玻片上的细胞进行B rdU免疫组化染色(S-ABC法)。免疫组化染色处理后,用显微图像分析仪计数载玻片上的阳性细胞数。结果迁移到C6及其条件培养液组的骨髓间充质干细胞明显多于IMDM和MRC-5组,并有统计学意义上的差异,且C6及其条件培养液组之间也有统计学意义上的差异,IMDM和MRC-5组两组之间差异无统计学意义。结论实验表明骨髓间充质干细胞对C6细胞及其分泌的各种因子具有趋向性。     

微环境诱导骨髓间充质干细胞分化为内皮样细胞

目的通过观察人骨髓间充质干细胞（hMSCs）与成熟内皮细胞非接触共培养表达特异性内皮细胞标志物的情况,探讨微环境依赖性的、体外非接触共培养方法对MSCs向内皮样细胞分化的影响。方法密度梯度离心法分离纯化培养的hMSCs与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在Transwell内共培养,通过流式细胞术检测hMSCs表型,RT—PCR鉴定诱导后hMSCs的CD31、VWF、VE—CadherinmRNA的表达,免疫组化鉴定诱导后hMSCs特异性内皮细胞标志物VCAM1和CD31的表达,透射电镜观察诱导后hMSCs的超微结构。结果细胞培养第2周,开始出现形态学改变,胞体回缩,呈多角形改变。细胞培养第3周,细胞增生速度明显加快,形态学上呈卵圆形或“铺路石”样改变;在基因水平上,RT—PCR显示经典内皮细胞标志物CD31、VWF、VE—cadherin mRNA的高表达;在蛋白水平上,免疫荧光染色CD31、和VCAMl表达阳性;透射电镜下诱导后细胞显示内皮细胞特有的Weibel—Palade小体。结论hMSCs在共培养的微环境中,可以分化成内皮细胞表型,其机制是通过内皮细胞的旁分泌作用,而不需要hMSCs与内皮细胞的直接接触。转化的内皮细胞在形态上、基因、蛋白表达、超微结构等方面均显示了内皮细胞的特征。     

当归诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的：研究当归体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化的作用。方法：通过贴壁法分离大鼠MSCs，体外扩增培养。MSC用20μl当归注射液／ml含10％胎牛血清的L—DMEM为预诱导条件，预诱导24h后用当归注射液100μl/ml不含胎牛血清的L—DMEM进行诱导。光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志。结果：大鼠骨髓间充质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。当归诱导3h后大部分MSCs转变为神经元样细胞，出现胞体和突起，免疫细胞化学染色NSE及nestin呈阳性、GFAP性。结论:大鼠骨髓间质干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究

目的探讨用5-氮胞苷(5-aza)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的最佳条件.方法用Percoll密度梯度离心法分离培养、纯化大鼠MSCs,取第3代MSCs随机分为A、B、C 3组,分别加入5、10、20 μmol/L5-aza;每组分别孵育12、24、48 h,继续培养28 d.相差显微镜观察细胞形态变化,免疫组化法检测细胞肌动蛋白(α-actin)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)表达,并通过Western印迹法对细胞cTnT进行定量分析.结果MSCs经5-aza诱导培养28 d后,电镜下见细胞胞浆有散在肌丝样结构,免疫组化检测α-actin和cTnT表达均呈阳性;5 μmol/L的5-aza孵育48 h、10 μmoL/L孵育24 h培养28 d的细胞cTnT表达量与10 μmol/L的5-aza孵育48 h、20 μmol/L 3种孵育时间各组比较无显著性差异,且细胞生物学特性未受到明显影响.结论MSCs在体外经5-aza诱导后可分化为心肌样细胞;5 μmol/L的5-aza孵育48 h和10 μmol/L的5-aza诱导24 h是MSCs体外诱导分化心肌样细胞的理想条件.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞（mMSCs）在体外定向诱导分化为肝细胞及其方法。方法：采用梯度离心法分离纯化雄性SD大鼠的mMSCs。A组原代培养；B组原代培养分别加刺激因子50ng／ml肝细胞生长因子（HGF）和50ng／ml成纤维细胞生长因子4（FGF-4），倒置显微镜连续观察细胞分化过程的形态学变化。于培养的7、14、21、28d，细胞免疫荧光法检测各组细胞甲胎蛋白（AFP）、白蛋白（ALB）、细胞角蛋白18（CK-18）、细胞角蛋白19（CK-19）的表达。采用过碘酸希夫（PAS）染色法检测各组细胞糖原染色情况。结果：分离纯化B组大鼠的mMSCs，应用HGF和FGF-4诱导10d后变为肝细胞样圆形。细胞免疫荧光测定B组显示，培养第7dAFP即出现阳性，第21d表达明显减弱；第7dCK-19染色阳性，以后增强；第14d白蛋白与CK-18染色开始阳性，以后表达逐渐加强。A组在培养过程中不表达AFP、ALB、CK-18和CK-19。糖原染色显示，B组第14d开始阳性，-直持续到第28d；A组未见阳性染色。结论：大鼠mMSCs在较高浓度的HGF及FGF-4诱导下可分化为肝细胞。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化

目的 对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)进行分离培养与鉴定,并使其诱导分化为神经细胞.方法 采用密度梯度离心和贴壁培养相结合的方法分离培养BMSCs,观察细胞形态变化及生长、增殖情况;对细胞进行表面标志物CD14、CD34、CD44、CD29免疫荧光染色及向骨、软骨和脂肪分化能力的鉴定;选用第3代细胞,经全反式维甲酸(retinoic acid,RA)和脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophy factor,BDNF)联合诱导后,免疫荧光染色检测神经前体细胞标记物Nestin及神经细胞标记物NSE的表达情况.结果 体外培养的BMSCs呈成纤维细胞样,CD44和CD29的阳性率在90%以上,具有明显的向骨、软骨和脂肪分化的能力,经诱导后可分化为神经细胞.结论 成功建立了体外分离扩增BMSCs的培养体系,所获得的细胞纯度高、生物学特征稳定,并可在体外诱导分化为神经细胞,从而为下一步细胞移植治疗脑缺血动物模型提供种子细胞.     

骨髓间充质干细胞体外可定向诱导为内皮细胞

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养方法和向血管内皮细胞分化的能力。方法:利用淋巴细胞分离液分离出MSCs,体外扩增,激光共聚焦显微镜检测表面抗原表达,以含VEGF、bFGF的诱导分化培养液定向诱导传代使细胞向血管内皮细胞分化,免疫荧光及免疫组化检测内皮细胞特异性标志物鉴定。结果:MSCs在体外传代扩增后激光共聚焦显微镜检测结果显示CD44、CD90表达阳性,CD31、CD45为阴性,分化后的细胞具有内皮细胞的形态学特征可表达CD31及Ⅷ因子。结论:骨髓间充质干细胞可在体外诱导向内皮细胞方向分化。     

姜黄素促进炎症微环境下大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化

目的 研究姜黄素对炎症微环境下大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响。方法 分离、培养大鼠BMSCs,以10 ng/mL的肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱发细胞炎症反应,用不同浓度姜黄素处理细胞,CCK-8检测细胞增殖以便筛选出实验所需姜黄素适宜浓度;实验分组为正常组、炎症组和炎症+姜黄素组;碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色检测成骨分化,实时荧光定量PCR检测骨涎蛋白(BSP)、Runt相关转录因子2(Runx2)的表达。结果 成功分离培养BMSCs;低浓度的姜黄素无细胞毒性,1μmol/L为适宜浓度;炎症降低大鼠BMSCs成骨相关基因BSP、Runx2表达,且ALP染色变浅、矿化结节减少;而姜黄素则可以逆转这种趋势,促进炎症状态下成骨相关基因 BSP、Runx2的表达(P＜0.05),较炎症组ALP染色加深,矿化结节增多。结论 姜黄素可以促进炎症微环境下BMSCs成骨分化。     

DMOG促进骨髓间充质干细胞血管新生作用的研究

目的探讨在缺氧缺血清环境下,脯氨酸羟化酶抑制剂———二甲基乙二酰甘氨酸（DMOG）促进骨髓间充质干细胞（MSCs）血管新生的作用及其机制。方法MSCs从大鼠骨髓中分离得到,分为：常氧条件下溶剂对照组（N-DMSO）、缺氧条件下溶剂对照组（H-DMSO）、20μMDMOG加药组（D-20滋M）、100滋MDMOG加药组（D-100滋M）及500μMDMOG加药组（D-500滋M）,观察以下指标：（1）通过缺氧条件下CCK-8检测DMOG在20μM、100μM及500滋M剂量下对MSCs的保护作用,确定DMOG的最佳剂量;（2）通过Matrigel实验观察DMOG促进MSCs血管新生的作用;（3）通过Westernblot法检测血管新生通路相关蛋白表达。结果（1）不同浓度组DMOG对缺氧损伤MSCs的影响：N-DMSO组OD值3.25±0.05,H-DMSO组2.23±0.14,D-20滋M组2.68±0.43,D-100滋M组3.11±0.25,D-500滋M组3.23±0.04。与N-DMSO组比较,H-DMSO组OD值降低（P＜0.01）,与H-DMSO组比较,D-20滋M组、D-100滋M组、D-500滋MOD值均升高（P＜0.05或0.01）。（2）不同浓度组DMOG对正常MSCs的影响：D-20滋M组3.19±0.02,D-100滋M组3.15±0.06,D-500滋M组2.51±0.08。与N-DMSO组比较,D-500滋M组OD值降低（P＜0.01）,D-20滋M组、D-100滋M组与N-DMSO组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）,提示DMOG在20滋M及100滋M对细胞无毒性。（3）血管新生相关蛋白的表达：与H-DMSO组相比,D-100μM组缺氧3、6及24hHIF-1α均增加（1.44±0.32vs7.79±0.23,2.4±0.28vs3.51±0.79,0.93±0.37vs2.46±0.07,P＜0.05或0.01）,pAKT则在缺氧6h增加（0.47±0.15vs0.71±0.03,P＜0.05）,VEGF在缺氧6、24h均增加（0.63±0.10vs0.87±0.14,0.42±0.06vs0.70±0.06,P＜0.05或0.01）,以缺氧24h最为显著。pmTOR/mTOR及pERK/ERK蛋白两组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。结论DMOG通过抑制HIF-1α降解及促进AKT磷酸化提高缺氧环境下MSCs的血管新生能力。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外CFSE染色标记的实验研究

目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞（ BMSCs ）体外分离、培养、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）荧光标记的实验方法。方法差速贴壁离心法分离纯化大鼠BMSCs,并进行表面标志物流式检测鉴定和成脂、成骨分化鉴定。 CFSE标记BMSCs ,荧光显微镜下观察BMSCs 形态和标记率,台盼蓝染色检测CFSE对BM-SCs存活率的影响,以筛选CFSE标记BMSCs的最佳条件。结果第5代BMSCs的特异性表面标志物： CD29阳性,阳性率为90．10％;CD90阳性,阳性率为96．61％;CD45阴性,仅0．40％表达。且BMSCs具有成脂和成骨分化能力。10μmol/L CFSE作用15 min时,BMSCs的CFSE标记率几乎达到100％,且对BMSCs 的活性没有影响（P＞0．05）。结论利用差速贴壁法可获得纯度高、未分化性能强的BMSCs,BMSCs标记CFSE的最佳条件为10μmol/L CFSE作用15 min。     

骨形态发生蛋白-7在雷奈酸锶促进骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用

目的探讨骨形态发生蛋白-7(BMP-7)在雷奈酸锶(Strontium ranelate,Sr)促进大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化中的作用。方法体外分离培养4周龄大鼠BMSCs,取第3~4代,用细胞碱性磷酸酶标法检测不同浓度Sr作用下碱性磷酸酶(ALP)活性的表达;用茜素红染色法检测钙结节的表达;用Western blot测定BMP-7的表达水平。结果在0.1~3.0 mmol/L的浓度范围内,Sr呈浓度依赖性地增加ALP活性,其浓度为3 mmol/L时,ALP活性表达最高,并明显促进钙结节的表达;Sr(0.1~3.0 mmol/L)呈浓度依赖性地上调BMP-7表达,其中浓度为3 mmol/L时,BMP-7表达最高;BMP-7阻断剂(noggin)(100 ng/ml)不仅抑制Sr诱导的BMP-7表达,而且使ALP活性及钙结节的表达明显下降。结论 Sr可通过上调BMP-7表达促进BMSCs向成骨细胞分化。     

大鼠骨髓间充质干细胞诱导为胰岛样细胞体外实验

目的：探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）在不同葡萄糖浓度培养基中诱导效果的差异.方法：采用电镜观察细胞形态学变化、双硫腙（DTZ）染色鉴定胰岛素分泌细胞的存在;放射免疫分析法观察诱导后BMSCs细胞对葡萄糖刺激试验的反应;免疫细胞化学分析鉴定细胞内胰岛素分泌以及Real-timePCR鉴定胰岛β细胞相关基因mRNA表达水平.结果：电镜观察可见诱导后的细胞具备典型分泌细胞特点,DTZ染色显示各诱导组细胞团为棕红色,细胞浆中富含锌离子,而对照组则无染色,表明胰岛素分泌样细胞的存在.经不同浓度葡萄糖诱导后其吸光度值A值：低糖5.5mmol/L诱导组（4.75±1.87）,中糖11.1mmol/L诱导组（10.96±2.06）,高糖25mmol/L诱导组（12.53±2.04）,且各诱导组吸光度值A值随着培养基葡萄糖浓度的不断增加,A值也在不断增高.Real-timePCR定量分析结果显示,诱导后胰岛β细胞相关基因GK,PDX-1,ngn3,GLP-1mRNA的表达水平变化显著,差异具有统计学意义（P〈0.01）.胰岛素分泌量高糖25mmol/L诱导组（6.64±0.46）IU/L高于其他各组,差异具显著性（P〈0.01）.结论：培养基葡萄糖浓度对大鼠BMSCs诱导为胰岛样细胞具有一定影响,以高糖培养基的诱导效果较好.     

Deltex-1对骨髓间充质干细胞增殖及其向平滑肌细胞分化的影响

目的 探讨Deltex-1对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,bMSCs)增殖及其向平滑肌细胞(smooth muscle cells,SMCs)分化的影响.方法 分离培养大鼠骨髓bMSCs,采用流式细胞仪检测鉴定.通过Deltex-1过表达腺病毒载体pAd/Deltex-1感染bMSCs后,采用CCK-8(cell count kit-8)法检测Deltex-1过表达对bMSCs增殖的影响;将未感染、经Deltex-1病毒感染及经空病毒感染的bMSCs与SMCs共培养,采用免疫荧光细胞化学、RT-PCR及Western blot分别检测其bMSCs中SMCs标志物平滑肌肌球蛋白重链(smooth muscle myosin heavy chain,SM-MHC)及Notch信号通路相关因子Notch-1的表达,单纯培养的bMSCs、SMCs的相同检测作正常对照.结果 成功分离、培养大鼠bMSCs.CCK-8检测证实:与对照比较,经Deltex-1病毒感染的bMSCs生长减慢,48 h开始显得更为明显(P＜0.05,P＜0.01);免疫荧光细胞化学、RT-PCR及Western blot检测显示:与对照比较,经Deltex-1病毒感染的bMSCs与SMCs共培养后显著表达SMCs的标志物SM-MHC,较弱表达Notch信号通路相关因子Notch-1 (P ＜0.01).结论 Deltex-1过表达可抑制bMSCs的增殖,并促进其向SMCs分化.