Renalase基因的克隆及表达

目的：克隆与表达人Renalase基因。方法：提取总RNA,RT-PCR获得Renalase cDNA片段,克隆到表达载体pET42b（＋）中,转染大肠杆菌BL21,采用异丙基硫代半乳糖苷诱导,获取融合蛋白,亲和层析纯化后,将产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳与蛋白质印迹分析。结果：克隆到大小为1 029 bp的Renalase cDNA片段,表达载体pET42b（＋）-Renalase经测序证实为所需质粒。获得的融合蛋白经鉴定证实为重组Renalase蛋白。结论：成功对Renalase基因进行克隆与表达,为进一步研究奠定了基础。     

氧化还原酶基因对甲状腺乳头状癌细胞凋亡的影响及其机制

目的 探讨氧化还原酶基因(WWOX)对甲状腺癌细胞凋亡的影响及其作用机制.方法 将携有WWOX基因的真核表达载体体外转染甲状腺乳头状癌细胞株K1(重组质粒组),筛选稳定转染的细胞并扩增培养,以转染空载质粒(空质粒组)及未经转染(空白对照组)的K1细胞作为对照.合成针对WWOX的靶向小干扰RNA(WWOX siRNA组)转染甲状腺乳头状癌细胞株TPC-1,以空白细胞(空白对照组)和转染脂质体试剂(脂质体对照组)作为对照组.采用实时定量反转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测转染前后WWOX基因mRNA水平.采用Western blot法分析WWOX基因对甲状腺乳头状癌凋亡相关蛋白的影响.结果 重组质粒组细胞中WWOX mRNA能稳定表达,是空质粒组及空白对照组细胞WWOX mRNA表达的4.5倍(P＜0.05).WWOX siRNA组WWOX mRNA表达明显下降,是对照组的0.2倍(P＜0.05).重组质粒组较空质粒组及空白对照组凋亡相关蛋白表达明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05).相反,WWOX siRNA组与对照组比较,细胞凋亡相关蛋白表达明显下降(P＜0.05).结论 WWOX基因能促进甲状腺癌细胞的凋亡,其机制可能与激活线粒体凋亡信号通路有关.     

膀胱移行细胞癌差异表达基因的克隆与鉴定

应用抑制消减杂交(ssH)构建膀胱移行细胞癌差异表达的消减文库，再应用Dot blot方法筛选出差异表达的基因，为研究膀胱癌发生、发展提供实验依据。现报告如下。     

人白细胞介素-10基因的克隆与逆转录病毒载体的构建

目的克隆、测序人白细胞介素(hIL)-10基因片段,构建逆转录病毒载体(MSCV- hIL-10)。方法采用刀豆蛋白A活化的人外周血单个核细胞培养提取总RNA,设计随机引物并逆转录反应合成hIL-10 cDNA第1链,并以hIL-10特异性引物行PCR扩增,获得hIL-10克隆基因片段,将hIL-10克隆基因片段,经双酶切后定向插入到逆转录病毒载体(MSCV)中,用脂质体法转染PT67包装细胞,以G418筛选阳性克隆。结果聚合酶链反应(PCR)扩增出534 bp特异性片段,测序结果表明同源性与GenBank报道完全一致,hIL-10基因片段插入MSCV载体中经转染包装后得到2×10~7 CFU／ml的分泌hIL-10的病毒悬液,hIL-10的分泌量为1220ng／10~6细胞·d~(-1)。结论成功克隆hIL-10开放阅读框架,成功构建MSCV-hIL-10重组质粒,获得高滴度的分泌hIL- 10的病毒悬液,hIL-10的表达可以应用于移植排斥的基因治疗。     

中国人Uroplakin Ⅱ基因的克隆及其真核表达载体构建

目的 克隆中国人UroplakinⅡ基因并构建其真核表达载体。方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法从1例GⅢ/T_3N_0M_0膀胱移行上皮癌(TCC)标本中扩增UroplakinⅡ全长cDNA后进行核酸序列分析,并构建其真核表达载体;重组子瞬时转染UroplakinⅡ基因缺陷型TCC EJ细胞株72h后,RT-PCR法检测癌细胞UroplakinⅡ表达水平。结果 成功克隆了中国人UroplakinⅡ全长cDNA(555 bp),与国外报道的序列同源性高达100％。真核表达载体pcDNA-UPⅡ转染EJ细胞后,癌细胞UroplakinⅡmRNA水平显著增高(P<0.01)。结论 从中国人TCC组织中克隆出UroplakinⅡ基因,为深入研究UroplakinⅡ基因在TCC生物学行为中的作用及其靶向生物治疗策略奠定了基础。     

荧光素酶编码基因luc在大肠杆菌中的克隆、表达及纯化

以荧光虫荧光素酶报告载体pXP2 DNA为模板,扩增得到编码萤火虫荧光素酶(LUC)的基因(luc),构建了诱导型表达载体pQE30-luc.将载体导入 E.coli M15获得高效诱导表达萤火虫荧光素酶基因的重组菌M15/pQE30-luc.SDS-PAGE电泳分析显示:重组蛋白的相对分子质量为 60 000 ,表达量占全菌胞内可溶性蛋白质的50.9 %. 利用表达载体pQE30上的His*Tag标记选用Ni柱纯化表达具有活性的萤火虫荧光素酶(LUC),纯化后比酶活达到1.43×10 9 RFU/ mg,纯化倍数达10.6倍,回收率为25.3%.     

丙肝病毒核心基因的克隆及其在胆管癌细胞中的表达

我们采用基因重组技术克隆丙型肝炎病毒 (ｈｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓ,ＨＣＶ)核心基因并导入胆管癌细胞株 ,为进一步探讨ＨＣＶ感染在胆管癌中的致癌机理提供实验基础。材料和方法一、材料1.质粒和菌种 :ＰＢＫ ＨＣＶ质粒由浙江大学传染病研究所陈智教授构建并惠赠 ,为ＰＢＫ ＣＭＶ载体插入ＨＣＶ结构区基因片段 16 90ｂｐ(330 2 0 2 0ｎｔ) ,酶切位点为ＰｓｔⅠ和ＥｃｏＲⅠ ,基因型为ＨＣＶⅡ型。真核表达载体ＰＢＫ ＣＭＶ(含有新霉素、卡那霉素抗性基因 ) ,购自Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ公司 (美国 )。宿主菌ＪＭ10 9,为本室保存。2…     

产1,3-丙二醇菌株的筛选、改良及发酵

从自然界筛选得到了9株可发酵甘油生产1,3 丙二醇的肠道细菌,经鉴定均为肺炎克雷伯氏菌.经化学诱变,菌株的1,3 丙二醇产量有所提高,其最终产量达到2%左右.     

醛糖还原酶相似基因-1与人肝癌细胞耐药性关系的实验研究

目的探讨醛糖还原酶相似基因-1（ARL-1基因）与人肝癌细胞耐药性的关系。方法线性化的ARL-1表达载体DNA转染至人肝癌细胞系（HepG-2细胞）作为实验组。含有活性醛基的表阿霉素、丝裂霉素作为实验用药，不含活性醛基的氟尿嘧啶作为阳性对照。通过乳酸脱氢酶（LDH）的测定、MTT法和流式细胞仪研究ARL-1基因在肝癌细胞耐药性形成中的作用。结果ARL-1基因成功转染至人肝癌细胞HepG-2，加入表阿霉素和丝裂霉素后，实验组的细胞毒性水平和细胞凋亡率明显低于对照组（P〈0．05），耐药水平明显上升。加入氟尿嘧啶后，实验组及对照组的耐药水平无明显差异。结论高表达的ARL-1基因明显降低含有活性醛基化疗药物的细胞毒性和抑制其所诱导的细胞凋亡，增强人肝癌细胞的耐药性。     

不同分化胆管癌差异表达基因的分离、克隆和功能研究

从分子水平研究胆管癌发病机理及病理过程 ,对认识及防治胆管癌都具有重要的理论和实际意义。基于临床研究的结果[1] ,我们采用Ｌｉａｎｇ 1992年建立的差异显示法 (ＤＤＲＴ ＰＣＲ) [2 ] ,来寻找高、低分化胆管癌间差异表达基因的ｃＤＮＡ。1 材料和方法 :(1)采用ＴＲＩｚｏｌ总ＲＮＡ提取试剂盒 ,分别提取高分化、低分化胆管癌新鲜组织总ＲＮＡ ,逆转录合成单链ｃＤＮＡ。 (2 )ＤＤＲＴ ＰＣＲ :在 2 0 μＬ体系中对 2 μＬ逆转录产物进行扩增 ,加入2 μｍｏｌ/Ｌ 4ｄＮＴＰｓ,5 μｍｏｌ/Ｌ锚定引物Ｔ15Ｍ ,1μｍｏｌ/Ｌ随机引物 ,37Ｂ…     

圆弧青霉脂肪酶基因的克隆和表达

圆弧青霉PG37总RNA甲醛变性电泳呈现真核生物所特有的 2 8SrRNA和 18SrRNA条带 .根据PG37所产碱性脂肪酶 (LipPC)N末端氨基酸残基序列和真核生物mRNA在 3’端具有poly(A)等所提供的生物信息 ,采用RT PCR技术扩增了LipPC成熟肽和 3’非编码区的cDNA片段 ,并将该PCR产物直接克隆至pUCm T载体中 .序列分析表明 ,LipPC含有 2 5 8个氨基酸残基 ,其中保守的五肽序列为Gly His Ser Leu Gly .进一步采用ClonTech公司的SmartTM PCRcDNA文库构建试剂盒 ,扩增、克隆和测定了自转录起始点至编码区的cDNA片段 ,从而完成了LipPC完整cDNA的分析测定 .最后将编码完整脂肪酶蛋白质的cDNA克隆至 pGEX 5X 3表达载体中 ,SDS PAGE检测结果表明 ,大肠杆菌BL2 1所表达的GST LipPC融合蛋白质分子质量约为 5 3ku .     

小鼠睾丸组织Bmi1基因的克隆及原核表达

目的:克隆小鼠Bm i1 cDNA并进行原核表达,为下一步制备BM I1多克隆抗体奠定基础。方法:从小鼠睾丸组织中克隆Bm i1 cDNA,测序并利用BLAST程序比对证明该基因序列正确后,构建原核表达载体pET-28 c-Bm i1,将其转入大肠埃希菌BL21中,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并通过免疫印迹检测重组目的蛋白。结果:成功克隆了小鼠Bm i1 cDNA,原核表达的融合蛋白可与H is标签抗体和BM I1单克隆抗体特异性结合。结论:小鼠睾丸组织中Bm i1基因有表达;成功克隆了小鼠Bm i1 cDNA并在大肠埃希菌BL21中正确表达了重组蛋白rBM I1。     

小鼠乳酸脱氢酶C亚基在大肠埃希菌中的表达与鉴定

目的 :构建小鼠特异性乳酸脱氢酶 (LDH)C亚基的原核重组载体并进行表达和鉴定。　方法 :提取小鼠睾丸总RNA ,逆转录合成cDNA ,自行设计引物 ,PCR扩增小鼠LDH C亚基编码序列 ,PCR产物经BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ 双酶切后 ,克隆至谷胱甘肽S转移酶 (GST)融合表达载体pGEX 2T中 ,在E .coliBL2 1中诱导GST融合蛋白的表达。　结果 :在异丙基 β 硫代半乳糖苷 (IPTG)的诱导下 ,重组菌高效表达出一个相对分子质量约为6 0 0 0 0的产物。对重组质粒的序列分析表明 ,插入片段的序列与GenBank登录的编码序列完全一致。　结论 :小鼠LDH C亚基的全长编码序列已被克隆至GST融合表达载体pGEX 2T ,并在E .coliBL2 1中获得高表达     

Expression and characterization of mouse lactate dehydrogenase subunit C in Escherichia coli.

Objective: To construct a prokaryotic recombinant vector for mouse lactate dehydrogenase-C and to detect its expression in BL21. Methods: The coding sequence of mouse lactate dehydrogenase subunit C was amplified from mouse testis RNA with specific primers and cloned into pGEX-2T after restriction digestion with BamH I and EcoR I. GST fusion protein was expressed after induction with IPTG. Results: Sequencing and restriction digestion of the recombinant plasmid revealed the coding sequence for mouse lactate dehydrogenase subunit C. A protein band of about 60 000 could be induced by IPTG in the recombinant plasmid. Conclusion: The coding sequence of mouse lactate dehydrogenase subunit C was introduced into the pGEX-2T plasmid and a GST-fused protein could be induced at a high level.     

DNA聚合酶基因pfu的克隆及初步表达

通过分子克隆技术从嗜热极端微生物Pyrococcus furiosus中克隆出高热稳定性的pfuDNA聚合酶基因，琼脂糖凝胶电泳显示基因片段的长度为2.3kb，将其转化入大肠杆菌中并获得初步表达.重组酶成功地扩增了800bp的DNA片段.     

Cloning and Expression of a Urate Oxidase and Creatinine Hydrolase Fusion Gene in Escherichia coli

Objective: To construct a plasmid containing a urate oxidase and creatinine hydrolase fusion gene and transform the plasmid into Escherichia coli to decompose uric acid and creatinine. Methods: According to the GenBank data for the urate oxidase gene, specific primers were designed to amplify and remove the stop codon for the urate oxidase gene. The gene was then ligated into the plasmid pMG36e to construct pMG36e-U. Then, using the GenBank database for the creatinine hydrolase gene, primers were designed to amplify the creatinine hydrolase gene. This gene was ligated into pMG36e-U to form pMG36e-U/C. Next, this construct was transformed into E. coli, which was confirmed by screening the recombinant E. coli and sodium dodecylsulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis. The engineered bacteria were cultured with a specific concentration of creatinine and uric acid for 24 h. Then, the concentrations of creatinine and uric acid in the culture fluid were measured. Results: The recombinant gene fragment was approximately 1.68 kb, and it contained the urate oxidase and creatinine hydrolase genes. The transformed E. coli expressed creatinine hydrolase and uric acid oxidase. The creatinine decomposition rate increased by 43.5%, and the uric acid decomposition rate increased by 42.32%. Conclusion: The constructed recombinant plasmid containing a fusion gene of creatinine hydrolase and uric acid oxidase was transformed into E. coli, and the enzymatic activities were expressed.     

耻垢分枝杆菌海藻糖合成酶基因TreS的克隆及其在大肠杆菌中的表达

耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)在环境胁迫下具有合成海藻糖的能力[1-2].实验采用PCR的方法,克隆了来源于耻垢分枝杆菌的一段核苷酸序列,与已报道的海藻糖合成酶有60%以上同源性,推测该基因的编码产物具有海藻糖合成酶的活性,为进行其功能验证而在大肠杆菌中进行了表达.目的蛋白以可溶性蛋白为主,约占细胞可溶性总蛋白48%.为目前相关报道的最高值.经活性测定,表达的重组酶无需复性,能够催化麦芽糖生成海藻糖,在20℃反应20 h对麦芽糖的转化率可达61%,具有较高的应用价值.     

木聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达及表达蛋白的纯化

热海栖热袍菌Thermotogamaritima是一个嗜极端高温的厌氧细菌,其产生的耐高温和热稳定性的木聚糖酶B具有很好的工业应用前景.利用PCR技术将嗜热产乙醇菌T.maritima编码高度热稳定性木聚糖酶的基因克隆至原核表达载体pET-20b,使之与组氨酸标签融合,并在大肠杆菌JM109(DE3)中得到了高效表达.最后采用金属Ni2+螯和层析柱对基因表达产物进行了纯化.     

人Smad4克隆及真核表达载体的构建与鉴定

目的：克隆人抑癌基因Homo sapiens SMAD family member 4（NM_005359 1659 bp）mRNA构建人Smad4的真核表达载体。方法：从膀胱癌患者膀胱组织中提取总RNA,经RT-PCR得到Smad4基因开放阅读框架eDNA序列,并将其定向克隆到真核表达载体pcDNA3．0,构建含目的基因的pCDNA3．0-Smad4重组质粒。结果：经基因序列测定、PCR和酶切分析,证实插入载体pCDNA3．0的片段为目的基因开放阅读框的核苷酸序列。结论：重组质粒pCDNA3．0 Smad4构建成功,为该基因的蛋白表达及其相关功能研究奠定了基础。     

黑色素瘤抗原基因-3在直肠癌的表达及意义

目的检测黑色素瘤抗原基因3(MAGE3)在直肠癌中的表达,探索其与直肠癌临床病理的关系及其在直肠癌免疫治疗中的应用价值。方法采用RT PCR法,对33例直肠癌患者的癌组织及其相应距肿瘤边缘(5±1)cm的癌旁组织和手术切缘(乙状结肠端)以及3例直肠息肉标本(无瘤)的MAGE3的表达情况进行检测,并对RT PCR扩增产物中的目的基因片段进行DNA测序验证。结果33例直肠癌组织中,MAGE3基因的表达阳性率为42.42%(14/33),在癌旁组织和手术切缘组织中,MAGE3基因的表达阳性率分别为18.18%(6/33)和15.15%(5/33),3例直肠息肉标本未见MAGE3表达。肿瘤组织MAGE3基因表达阳性率均显著高于癌旁组织和手术切缘组织(P<0.05);而与患者年龄、性别、肿瘤组织学类型、Dukes分期及淋巴结转移无关(P>0.05)。结论基于MAGE3基因在直肠癌中的高表达率,MAGE3表达的蛋白可以作为一种有前途的靶点用于免疫治疗,同时有望成为一种筛查和随访指标。