人NOD8基因启动子绿色荧光蛋白表达载体的构建与鉴定

目的:构建人NOD8基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体.方法:用特定的限制性内切酶位点,以人基因组DNA为模板,PCR扩增含有人NOD8基因启动子不同长度2段序列,并进行酶切以切除启动子的pEGFP-C2作框架结构,插入表达载体pEGFP-C2中,构建含有人NOD8基因启动子驱动的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2-NOD8(520 bp)、pEGFP-C2-NOD8(760 bp),用Vsp Ⅰ和Nhe Ⅰ双酶切和PCR鉴定重组质粒,再将重组质粒进行DNA序列分析.构建的重组质粒经脂质体(lipofectamine)TM2000介导转染HEK293、K562和HeLa细胞,转染48 h后在倒置荧光显微镜下观察.结果:pEGFP-C2-NOD8(520 bp)、pEGFP-C2-NOD8(760 bp)分别经酶切鉴定和序列测定证实目的基因已插入重组质粒;细胞转染结果表明,构建的2段重组质粒转染HEK293、K562及HeLa细胞均能表达绿色荧光,其中构建的pEGFP-C2-NOD8(760 bp)重组质粒绿色荧光表达强于pEGFP-C2-NOD8(520 bp).结论:成功构建2段不同长度的人NOD8基因启动子绿色荧光蛋白表达载体.     

Sry基因的克隆及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建真核表达重组质粒pCR3.1-Sry.并检验其在真核细胞内的表达.方法:用PCR法从小鼠基因组中扩增出Sty全长基因,重组入pMD18-T载体,酶切鉴定重组质粒,对酶切正确的重组质粒测序.双酶切测序验证的重组质粒.将切下的片段与真核表达质粒pCR3.1相连构建pCR3.1-Sty重组质粒.将其转染HeLa细胞后,RT-PCR法检测重组质粒在细胞中mRNA的转录;免疫荧光法检测重组质粒在细胞中蛋白质的表达.结果:PCR法扩增得到了1.2 kb的特异性Sry基因片段;成功地构建了真核表达重组质粒pCR3.1-Sry;重组质粒pCR3.1-Sry在HeLa细胞中mRNA及蛋白水平均可检测到表达.结论:重组质粒构建成功并可以在体外真核细胞中表达,为进一步研究其作为核酸疫茁的免疫作用提供了可控的实验材料.     

人RIP2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体的构建与鉴定

目的:构建人RIP2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体。方法:根据特定限制性内切酶位点,以人基因组DNA为模板,PCR扩增含人RIP2基因启动子不同长度2段序列,构建含人RIP2基因启动子驱动的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2-RIP2(750 bp)wt、pEGFP-C2-RIP2(941 bp)wt,用VspⅠ和NheⅠ双酶切鉴定重组质粒,进行DNA序列分析,重组质粒经阳离子聚合物JetPeiTM介导转染HEK293细胞48 h后观察。结果:酶切鉴定和序列测定证实目的基因已插入重组质粒;细胞转染结果表明,重组质粒转染HEK293细胞均能表达绿色荧光,其中构建的pEGFP-C2-RIP2(750 bp)wt重组质粒绿色荧光表达强于pEGFP-C2-RIP2(941 bp)wt。结论:成功构建2段不同长度的人RIP2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体。     

重组人细胞色素P450 2C9在毕赤酵母中的胞内表达

以含有CYP2C9基因完全编码框的克隆载体质粒DNA为模板,并在人细胞色素P4502C9的5’端插入kozak序列及3’端6×His标签进行PCR扩增,克隆至真核表达载体pPIC3.5K,利用电激法将经Sal I线性化的重组质粒pPIC3.5K-2C9转化至毕赤酵母GS115中,通过抗性、表型和PCR筛选多拷贝整合株,甲醇诱导毕赤酵母GS115/pPIC3.5K-2C9的表达,SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定表达产物.结果表明:含有重组质粒的重组pPIC3.5K-2C9表达了大小为55KD的目的蛋白,与预期大小相符,说明人细胞色素CYP2C9可在毕赤酵母的胞内表达.     

低表达长非编码RNA MALAT1对人宫颈癌HeLa细胞体外生长和迁移的影响

设计3个针对MALAT1不同靶序列的小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA), 筛选出有效的siRNA序列, 设计并构建短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)干扰质粒, 转染到HeLa细胞中, 构建低表达MALAT1的稳定细胞株.通过细胞的生长曲线和细胞划痕实验验证降低MALAT1对HeLa细胞增殖和迁移的影响.结果显示MALAT1表达水平在HeLa细胞中得到有效地降低, 低表达MALAT1的HeLa细胞生长速度和迁移速度减小.表明MALAT1在HeLa细胞中具有调控细胞增殖和迁移的能力     

GGPPS基因干扰腺病毒载体的构建及鉴定

构建GGPPS基因干扰腺病毒质粒载体并加以鉴定.根据GGPPS基因序列设计GGPPS干扰序列引物,定向克隆至穿梭载体pshuttle-H1的BglⅡ和HindⅢ位点,PmeⅠ酶切线性化的pShuttle-H1-SiGGPPS干扰质粒,并与腺病毒载体(pAdEasy-1质粒)共同转化E.coli BJ5183感受态细菌,产生重组腺病毒载体.用PacⅠ酶切线性化的回收质粒,转染293A细胞包装腺病毒颗粒,在倒置显微镜下观察细胞CPE,用TCID50法测定病毒颗粒的浓度,并初步观察病毒感染PC12细胞对目的基因的干扰效率.经酶切鉴定、测序证实成功构建GGPPS基因干扰腺病毒载体.包装的腺病毒浓缩悬液滴度为1.995×107PFU/mL.GGPPS在人中具有保守性,该病毒能在人源的WRL-68细胞中成功表达,并且对GGPPS基因干扰效率达70%以上.     

人细胞周期蛋白cyclin E基因的克隆与真核表达载体的构建

目的:为研究细胞周期蛋白在肿瘤形成过程的分子机制,构建带FLAG标签的细胞周期蛋白E的真核表达载体,并检测其在瞬时转染HeLa细胞株中的蛋白表达。方法:通过RT-PCR扩增cyclinE基因编码cDNA,并将扩增的cDNA片段插入p3XFLAG-CMVTM-14真核表达载体,重组子经酶切分析和测序鉴定后,用脂质体介导的基因瞬时转染法,将重组正确的表达载体转染HeLa细胞,用Western-blot技术检测其在HeLa细胞中融合蛋白的表达。结果:经酶切鉴定和测序分析证实人cyclin E的真核表达载体构建成功,并能在瞬时转染的HeLa细胞中表达。结论:成功构建了人cyclin E的真核表达载体,为进一步研究细胞周期蛋白的功能奠定了基础。     

cnksr2基因干扰腺病毒的构建及鉴定

构建小鼠cnksr2基因干扰腺病毒质粒载体并加以鉴定.根据小鼠cnksr2基因序列设计cnksr2干扰序列引物,定向克隆至穿梭载体pshuttle-H1的BglⅡ和HindⅢ位点,PmeⅠ酶切线性化的pShuttle-H1-Sicnksr2干扰质粒,并与腺病毒载体(pAdEasy-1质粒)共同转化E.coli BJ5183感受态细菌,产生重组腺病毒载体.用PacⅠ酶切线性化的回收质粒,转染293A细胞,包装腺病毒颗粒,在倒置显微镜下观察细胞病理性变化(Cell pathological effect,CPE),用TCID50法测定病毒颗粒的浓度,并初步观察病毒感染PC12细胞对目的基因的干扰效率.经酶切鉴定、测序证实成功构建小鼠cnksr2基因干扰腺病毒载体.包装的腺病毒浓缩悬液滴度为3.98×107PFU/mL.cnksr2在大鼠及小鼠中具有保守性,该病毒能在大鼠来源的PC12细胞中成功表达,并且对cnksr2基因干扰效率达50%以上.结论:成功构建了小鼠cnksr2基因的干扰腺病毒载体.     

人RACK1基因的克隆及原核表达

克隆人RACK1基因,构建原核表达载体pET-30a(+)-RACK1,诱导表达重组蛋白,纯化后Western blot鉴定目的蛋白.根据GeneBank提供的RACK1基因序列及pET-30a(+)载体上的多克隆位点设计引物,以人胎肝cDNA文库为模板,钓取RACK1cDNA全长序列.将目的片段与原核表达载体pET-30a(+)连接,转入E.coli DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆.将测序正确的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)细胞,IPTG诱导表达,利用镍柱对表达的蛋白进行纯化,Western blot法检测纯化的蛋白.结果显示,克隆得到的目的基因序列与GeneBank中已报道的序列完全一致,成功构建了pET-30a(+)-RACK1原核表达载体.重组蛋白主要以包涵体形式存在,经镍离子亲和层析柱纯化后,Western blot检测证实纯化的蛋白能与特异性的抗体发生反应.本研究获得了人RACK1蛋白,为深入研究RACK1的功能奠定基础.     

分泌型Survivin真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建含6个组氨酸标签(His6)的小鼠存活素(Survivin)融合蛋白的真核表达载体,及其在真核细胞中的表达。方法:根据小鼠Survivin序列设计引物,经过RT-PCR克隆Survivin的cDNA并进一步构建分泌型Sur-vivin的真核表达载体,经测序鉴定后在大肠杆菌中扩增在HeLa细胞中表达;以金属离子螯合层析富集,再用免疫印迹法鉴定。结果:克隆到Survivin编码区全长序列,经DNA测序后证明与已报道序列相同。构建氨基端融合小鼠IL-2信号肽,羧基端带有His6标签的Survivin融合蛋白的真核表达载体,在HeLa细胞中转染成功并且表达;细胞上清经HisTrap HP柱层析富集后,进行免疫印迹分析,表明该融合蛋白以分泌型方式在HeLa细胞中表达。结论:成功克隆Survivin的cDNA,并构建其分泌型真核表达载体。     

NS特异性干扰载体pGenesil-1-NS的构建及鉴定

目的核干细胞因子(nucleostemin,NS)是维持干细胞和癌细胞增殖所必需的蛋白质,可能成为肿瘤基因治疗的潜在靶点.本文旨在构建靶向NS干扰载体p Genesil-1-NS,为后续实验奠定基础.方法基于已发布的NS mRNA序列(NM_206825),选取5'-AAGCCTA GGAAAGACCCAGG-3'(397-416)作为候选靶序列,按shRNA载体设计原则,设计合成两条互补DNA链,退火后插入载体,并以酶切和测序鉴定重组转化子.结果经酶切及测序鉴定证实合成序列正确插入载体.结论成功构建NS特异性干扰载体p Genesil-1-NS,可用于NS在肿瘤中的功能研究.     

重组人神经生长因子昆虫表达载体的构建及表达

目的:构建重组人神经生长因子(rh-NGF)杆状病毒表达载体,转染昆虫细胞从而获得目的蛋白的大量表达.方法:从人胎盘组织中提取细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增-NGF基因片段,经BamHI、HindⅢ双酶切后插入杆状病毒表达载体pFastBacTMDual的多克隆位点处,构建出重组载体pFastBacTM-Dual+[rh-NGF].对构建的载体进行PCR和酶切鉴定并测序.采用脂质体转染方法将表达载体转入昆虫细胞系Sf9中,通过双抗夹心ELISA对rh-NGF的表达进行检测.结果:构建的rh-NGF基因插入正确且序列与GenBank一致.ELISA检测结果显示病毒感染的Sf9细胞可表达rh-NGF.结论:成功构建出杆状病毒表达载体pFastBacTMDual+[rh-NGF],并在昆虫细胞系Sf9中得到表达,为大量制备重组人神经生长因子奠定了基础.     

人annexin A2基因真核表达的构建及活性

为了构建人Annexin A2基因真核表达载体。通过TRIzol法提取Hela宫颈癌细胞中总RNA,采用RT-PCR技术(逆转录-聚合酶链反应)扩增Annexin A2的基因片段,并成功构建成VR1012-Annexin A2-HA重组质粒。经酶切、测序检测其构建的正确性,将质粒瞬时转染到293T人胚肾细胞,使用免疫荧光和蛋白印迹(Western blot)法检测基因表达,使用流式细胞术检测转染后细胞凋亡率。结果表明实验成功构建了具有表达活性的Annexin A2真核表达质粒,为进一步研究Annexin A2的抗凋亡作用奠定了基础。     

MiR-218慢病毒表达载体的构建及鉴定

摘要:构建人mir-218-2, pre-miRNA慢病毒表达载体,为研究miR-218在人体的功能及作用机制打下基础。以人hsa-mir-218-2前体序列,设计部分互补的正反向引物,进行引物退火,形成引物二聚体,PCR扩增引物二聚体,酶切后插入到线性化pGCSIL-GFP慢病毒表达载体中,对重组质粒进行双酶切鉴定,并进行慢病毒的包装与滴度检测。用构建好的慢病毒表达载体感染人胃癌细胞MKN-28,qPCR检测细胞内miR-218表达。结果显示,重组质粒经双酶切分析及转化菌液测序,插入序列正确,慢病毒表达载体感染人胃癌细胞后qPCR检测显示能显著增高miR-218的表达。说明本实验成功构建了hsa-mir-218-2慢病毒表达载体,感染人胃癌细胞后能有效提高miR-218的表达。为进一步研究miR-218在人体的功能及作用机制建立了实验基础。     

人PSF真核表达载体构建及其在CHO细胞中的表达

目的是构建人PSF基因真核表达载体pEGFP-N1-PSF,并在检测其在CHO细胞株中的表达情况。应用DNA重组技术和PCR方法从人宫颈癌Hela细胞中扩增PSF基因,插入pEGFP-N1真核表达载体,构建重组质粒pEGFP-N1-PSF并测序鉴定。将pEGFP-N1-PSF瞬时转染CHO细胞,通过Western blot和RT-PCR方法检测PSF的表达,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。结果 CHO细胞转染pEGFP-N1-PSF真核表达载体后,RT-PCR和Western blot实验发现,在RNA和蛋白水平有PSF的表达,在荧光显微镜下可以观察到融合蛋白EGFP/PSF的表达。成功构建pEGFP-N1-PSF真核表达载体,证实其在CHO细胞中可以表达。     

真核生物多顺反子表达载体的构建及在Hela细胞中的表达

利用DNA重组技术将抗肿瘤血管生成的内皮抑素基因endostatin插入含有FHIT(抗肿瘤人脆性组氨酸三联体基因)和EGFP的pIRES2-FHIT-EGFP载体中构建了真核多顺反子表达载体pES-IRES-FHIT-IRES-EGFP,用脂质体法转染Hela细胞后,用G418筛选出稳定转染的细胞.经RT-PCR、RT-PCR southern blot、northern blot和免疫细胞化学分析,结果证明单顺反子和三顺反子在RNA水平都得到表达.在蛋白表达水平上,荧光观察和免疫细胞化学分析结果显示Endostatin、FHIT和EGFP在Hela细胞中均得到表达,为基因药物和肿瘤多基因治疗奠定了基础.     

pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293 细胞系中的表达

目的:构建pEGFP-C1-MCH真核表达载体,并将其转染入HEK293细胞中,筛选阳性细胞克隆,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及机制提供细胞模型.方法:提取脑组织总RNA,反转录为cDNA,参照Genbank中提供的序列设计引物扩增MCH基因全长.再将该基因全长cDNA克隆至质粒pEGFP-C1,经菌落PCR筛选及双酶切和DNA测序鉴定,成功构建了含有目的基因MCH的重组质粒pEGFP-C1-MCH.并利用脂质体2000介导其转染HEK293细胞,用荧光显微镜和RT-PCR检测EGFP和MCH在细胞中的表达.结果:克隆的pEGFP-C1-MCH质粒序列中的MCH与Gen Bank相符;细胞转染72 h后,转染成功的细胞在荧光显微镜下表达较强的绿色荧光,MCH基因稳定表达.结论:pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的稳定表达,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及作用机制提供了实验模型.     

人白介素-3乳腺表达载体的构建

人白介素-3是一种造血系统和免疫系统调节剂,在治疗造血系统疾病、肿瘤、先天或获得性免疫功能缺陷等方面发挥着重要作用.应用牛乳腺生物反应器生产人白介素-3的研究具有重要的临床应用和经济价值.研究选用具有红色荧光蛋白报告基因(R ed2)和新霉素抗性基因(neor)表达框架的pD sR ed2-1质粒为骨架构建人白介素-3乳腺表达载体.通过PCR方法分别扩增牛β-酪蛋白基因5′端上游调控序列、人IL-3基因以及CM V启动子序列,将它们按先后顺序分别定向克隆于质粒pD sR ed2-1的多克隆位点内,使牛β-酪蛋白基因调控序列位于人IL-3基因的上游,指导人IL-3基因在乳腺组织中特异性表达,而CM V启动子位于红荧光蛋白基因的上游,指导红荧光蛋白基因在所有的组织中非特异性表达.限制性酶切片段分析及部分DNA序列鉴定结果表明,所构建载体结构正确.     

Fractalkine基因真核表达质粒的构建及其在小鼠肝癌细胞中的表达

为克隆小鼠趋化因子Fractalkine(．FK)基因，构建真核表达质粒，并在小鼠肝癌细胞中表达，用以进行肿瘤的基因治疗，用RT-PCR法，从小鼠乳腺癌细胞D2F2扩增FK的cDNA，插入pCR2．1 TOPO载体，测序证实后，将其亚克隆至质粒pIRES中构建FK真核表达载体；用脂质体将重组质粒转染小鼠肝癌MM45 T．Li细胞，经G418筛选获得抗性细胞克隆，用RT-PCR和免疫化学方法鉴定转染细胞中FK基因的表达．结果表明：经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒，RT-PCR和免疫化学方法证明转基因MM45T．Li细胞克隆中存在小鼠FK基因的表达。