重组酪氨酸酚裂解酶全细胞酶法合成L-酪氨酸

利用基因工程手段重组表达了弗氏柠檬酸杆菌来源的酪氨酸酚裂解酶（TPL）,以丙酮酸和L-丝氨酸为底物酶法合成L-酪氨酸,考察了pH、温度、表面活性剂、金属离子、铵盐种类和氯化铵浓度等因素对L-酪氨酸合成的影响,并比较了两种底物合成L-酪氨酸的转化率。结果表明,TPL的最适反应条件是45℃,pH 8.0,4 mmol/l PLP,氯化铵浓度350 mmol/l。1 mmol/l triton-x 100对TPL酶活有促进作用,金属离子无明显影响。质量浓度1%丙酮酸的转化率约是L-丝氨酸的1.8倍。     

重组酪氨酸酚裂解酶全细胞催化合成L-酪氨酸

利用基因工程手段重组表达了弗氏柠檬酸杆菌来源的酪氨酸酚裂解酶(TPL),以丙酮酸和L-丝氨酸为底物全细胞催化合成L-酪氨酸,考察了pH、温度、表面活性剂、金属离子、铵盐种类和氯化铵浓度等因素对L-酪氨酸合成的影响,并比较了两种底物合成L-酪氨酸的转化率。结果表明,TPL的最适反应条件是45℃,pH=8.0,4mmol/L PLP,氯化铵浓度350 mmol/L。1 mmol/L triton-x 100对TPL酶活有促进作用,金属离子对TPL酶活都有明显的抑制作用。0.1 mol/L丙酮酸的转化率约是L-丝氨酸的1.8倍。     

草生欧文氏菌中酪氨酸酚裂解酶的体外定向进化及结构模拟

以来源于草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)的酪氨酸酚裂解酶(Eh-TPL)为目的基因,通过易错PCR定向进化技术构建突变体文库,利用高通量筛选方法获得了比酶活提高的突变体S20C和E202R,再通过定点突变得到突变体S20C/E202R/N161S。经摇瓶发酵培养发现,突变体S20C/E202R/N161S比野生型Eh-TPL的比酶活提高了30.61%;酶学性质研究结果表明,突变体S20C/E202R/N161S的最适温度仍为37℃,最适pH值从8.2升至8.5,热稳定性、pH稳定性均得到明显提高;结构模拟结果表明,突变体S20C/E202R/N161S的三维结构无明显变化,突变位点附近氢键和表面电势有所变化。体外定向进化技术能有效提高Eh-TPL的催化效率,对酶法生产L-酪氨酸具有重要应用价值。     

大肠杆菌E.coli HB101(pBR322) 高密度培养过程质粒的稳定性

通过正交实验考察了大肠杆菌E.coli HB101(pBR322)高密度培养过程中,不同培养条件对质粒的稳定性和β-内酰胺酶活力的影响. 结果表明,当温度在33~39℃、pH为6.4~7.2、DO为 40%~80%、 补料速率在5.4~10.8 g/h范围内变化,以及细胞密度达到27.3 g/L、比生长速率达到0.73 h-1时,质粒没有发生丢失现象,但在培养过程中β-内酰胺酶的活力降低.     

耐甲醇汽油(M15)氟橡胶胶料的研制

主要介绍了甲醇含量为15%、汽油含量为85%的甲醇汽油混合燃料(M15)对氟橡胶性能的影响。研究发现,提高氟橡胶的氟含量可以显著改善硫化胶耐甲醇汽油的老化性能;采用氟含量为71%的氟橡胶,经过适当的配方调整,可获得耐甲醇汽油混合燃料(M15)等综合性能优异的氟橡胶胶料。     

漆酚-(8-羟基)喹啉-Cu(Ⅱ)高分子配合物固定化漆树酶的研究

介绍了漆酚-(8-羟基)喹啉-Cu(Ⅱ)高分子配合物的制备和固定化漆树酶的方法,测定了固定化漆树酶的活性和米氏常数,研究了酸度和温度对固定化漆树酶催化活性的影响及固定化漆树酶的重复催化活性。结果表明,漆酚-(8-羟基)喹啉-Cu(Ⅱ)高分子配合物是漆树酶的良好固定化载体,固定化漆树酶的米氏常数Km=4·85×10-3mol·L-1,小于天然漆树酶的米氏常数,固定化漆树酶的耐热性和耐酸碱性均优于天然漆树酶,并有一定的重复使用性。对漆树酶的固定化方式和固定化漆树酶的催化反应机理也进行了初步讨论。     

M(0.1)Mn(15)/Hβ催化剂的低温NH3选择还原NO性能

NH₃选择性催化还原（NH₃-SCR）氮氧化物可有效减少固定源NOx的排放,目前,工业上应用的钒钛体系催化剂活性窗口温度为(300~400) ℃,不能用于低温脱硝,开发低温NH₃-SCR烟气脱硝催化剂成为研究热点之一。采用浸渍法制备M(0.1)Mn(15)/Hβ（M=Ni、Fe、Mg、Ca、Sr,0.1为M与Mn物质的量比）系列催化剂。通过X射线衍射、扫描电子显微镜和H2-程序升温还原反应等方法对催化剂进行表征,在固定床微型反应器上考察催化剂NH3选择还原NO的催化性能。结果表明,加入金属助剂Ni,催化剂活性得到改善,反应温度降低,T85和T95分别为157 ℃和 171 ℃。     

重组大肠杆菌苯丙氨酸解氨酶稳定性研究

考察了甘油、Mg2+和二硫苏糖醇(DTT)对重组大肠杆菌苯丙氨酸解氨酶(PAL)稳定性的影响,并用响应面法优化筛选了最佳稳定剂组合。结果表明,φ(甘油)=10%和c(Mg2+)=0.05mol/L组合可以显著提高酶稳定性,在连续三轮转化后,PAL比酶活仍然能达到62.43U/g,是对照的1.53倍,明显好于单独使用φ(甘油)=10%或Mg2+。响应面分析结果表明,甘油在提高稳定重组PAL稳定性过程中起的作用最显著,最佳稳定剂组合条件是:c(Mg2+)=0.115mol/L,ρ(DTT)=0.52g/L,φ(甘油)=10.03%。在该条件下,在连续三轮转化后,PAL比酶活基本维持在82.53U/g,是对照的2倍;5L发酵罐PAL可以达到876U/g,酶活力是对照的近4倍。     

分泌型重组人生长激素工程菌的高密度发酵

目的　研究葡萄糖剂补加策略 ,以获得大肠杆菌的高密度发酵和人生长激素 (HGH)的高表达。方法　采用批式发酵和补料批式发酵方式 ,葡萄糖的补加采用逐渐增加的方式 ,包括pH、DO和浓度控制。结果　获得HGH的表达量为 30 0mg/L ,光密度达到 12 4(A60 0 )。结论　在大肠杆菌中表达异源蛋白时 ,葡萄糖的补加方式是关键因素 ,补料批式发酵要优于批式发酵     

基因工程菌株BLG8900的遗传稳定性

目的研究基因工程菌株BLG8900的遗传稳定性。方法在有选择压力(加氨苄西林)的条件下,测定pYC2质粒在大肠杆菌BLG8900株[含有质粒pYC2的BL21(DE3)]中的遗传稳定性。结果工程菌连续传10、25、50和100代后质粒具有良好的稳定性,而且经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切,酶切图谱相同。第100代菌株重组质粒的GnRH/TRS序列与原代菌株相同。原代与第10、25、50和100代菌株经IPTG诱导表达,GST-GnRH/TRS融合蛋白表达水平、菌体蛋白的SDS-PAGE图谱鉴定无明显差异。Western blot表明各代菌株表达产物均具有GnRH抗原特异性。结论质粒pYC2在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中有较好的遗传稳定性。     

产肠毒素大肠杆菌基因工程疫苗在SD大鼠中的免疫原性

目的观察产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli,ETEC)基因工程疫苗在SD大鼠中的免疫原性。方法将含ETEC抗原成分热不稳定肠毒素B亚单位(Heat-labile enterotoxin Bsubunit,LTB)的双歧杆菌疫苗给SD大鼠灌胃4次,同时设对照组,以PBS平行灌胃。采用ELISA法检测大鼠粪便上清液IgA及血清IgG抗体水平;免疫组化法检测大鼠空肠中sIgA抗体的表达;肠绊试验检测肠毒素的活性。结果免疫疫苗的SD大鼠粪便上清液中产生了IgA抗体,血清中产生了特异性的IgG抗体,肠道内产生了特异性分泌型sIgA抗体;免疫组化结果显示,随着免疫次数的增加,抗体分泌量明显增加;双歧杆菌疫苗免疫的大鼠能够抵抗LT抗原的侵袭,而对照组大鼠则出现明显的肠道积液现象。结论构建的双歧杆菌疫苗具有良好的免疫效果,可保护SD大鼠免受ETEC的感染。     

不同培养基对肠毒素大肠杆菌疫苗株产生菌毛的影响

目的　通过比较不同培养基对疫苗株产生菌毛的影响 ,获得一种有利于细菌生长和菌毛产生 ,而且费用低廉的培养基。方法　通过测定培养物的密度 ,观察疫苗菌株的生长规律 ,用斑点ELISA和全菌ELISA检测菌毛抗原的表达情况。结果　LB培养基既有利于疫苗株的生长 ,又有利于细菌菌毛的表达。结论　LB培养基可以用于疫苗株中试和大规模培养     

大肠杆菌重组人成骨蛋白-1的非诱导表达特性

目的　研究大肠杆菌重组人成骨蛋白 1的非诱导表达特性。方法　通过水质、起始pH、接种量、葡萄糖添加量、甘油添加量、装液量、转速等实验研究不同营养条件和培养条件对OP 1非诱导表达的影响。通过传代实验 ,考察该系统OP 1表达的稳定性。结果　水质对OP 1的表达没有明显影响 ,2 %～ 4 %的接种量有利于OP 1的表达 ,起始pH以 6 0为宜。葡萄糖对OP 1的表达有较大影响 ,2 %～ 4 %的葡萄糖添加量可以获得较高表达。甘油的添加能明显促进OP 1的表达 ,最适添加量为 0 3% ,较对照提高表达 81 7%。该表达系统对溶氧的需求不大 ,装液量和转速分别以 12 5～ 15 0ml和 15 0r min为宜。在优化条件下 ,最适表达时间为 2 4～ 2 6h ,OP 1的表达量可达到菌体蛋白的 4 0 %。优化的营养条件和培养条件对本系统OP 1的表达和质粒的稳定有利 ,10次传代可保持 90 %表达。结论　建立了非诱导表达的摇瓶发酵工艺 ,对其非诱导表达特性有了较为深入的了解 ,为进一步放大研究奠定了基础。     

重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵及表达产物的纯化

目的建立重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵和目的蛋白纯化工艺。方法在三角烧瓶中,探讨不同的诱导剂浓度和培养基对菌体密度和目的蛋白表达量的影响;在10L发酵罐中,探讨诱导时间、补料方式、溶氧量对菌体密度和目的蛋白表达量的影响。根据目的蛋白的理化特性建立纯化工艺。结果重组HEV抗原工程菌在10L发酵罐分批补料培养中,采用0·1mmol/L的IPTG诱导4h,目的蛋白表达量约为25%,目的蛋白产率约为2·88g/L,且以包涵体形式存在。经过对包涵体粗纯、复性、纯化,SDS-PAGE分析,纯度可达95%以上。结论建立了周期短、产率高且稳定可靠的发酵及纯化工艺,为重组HEV抗原的大规模生产奠定了基础。     

Mg~(2+)和氨基酸对重组大肠杆菌BL21(DE3)生长及羧肽酶原B表达的影响

目的研究Mg2+和氨基酸对重组菌株生长及表达pCPB的影响。方法通过摇瓶和发酵罐培养,观察不同Mg2+浓度和氨基酸对重组菌的生长和羧肽酶原B表达的影响。结果添加1g/L Mg2+能提高质粒的稳定性;添加氨基酸能使羧肽酶原B表达量由18·7g/L提高到24g/L。结论添加适量的Mg2+和氨基酸能促进重组菌的生长和提高目的蛋白的表达量。     

产肠毒素大肠杆菌K88菌毛蛋白与大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位的原核表达及其鼻腔免疫效果

目的原核表达产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)K88菌毛蛋白与大肠杆菌不耐热肠毒素(Heat-labile enterotoxin,LT)b亚单位(LTb),并评价其鼻腔免疫效果。方法采用PCR技术分别扩增不含信号肽的K88和LTb基因,克隆至表达载体pQE30中,构建重组表达质粒pQE30-K88和pQE30-LTb,转化大肠杆菌M15,IPTG诱导表达。表达的重组K88和LTb蛋白纯化、复性后,进行SDS-PAGE分析。分别用K88单独、K88联合LTb滴鼻免疫BALB/c小鼠,以生理盐水作为对照,每次间隔1周,共4次,末次免疫后10 d,分离血清,并收集鼻腔和小肠黏膜冲洗液,间接ELISA法检测各组血清特异性IgG和黏膜sIgA抗体水平。结果重组表达质粒pQE30-K88和pQE30-LTb经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组K88和LTb蛋白相对分子质量分别为28 100和12 500,表达量分别约占菌体总蛋白的35%和40%,主要以包涵体形式存在;纯化复性后的重组蛋白纯度均可达95%以上。K88联合LTb滴鼻免疫组血清特异性IgG及鼻腔、小肠黏膜冲洗液中特异性SIgA水平均较K88单独免疫组和对照组明显增高,且差异有统计学意义(P<0.01)。结论在大肠杆菌中高效表达并纯化了重组K88和LTb蛋白,K88联合LTb滴鼻免疫BALB/c小鼠后,可增强特异性血清抗体反应,且诱导了黏膜免疫应答,为将来开发新型的ETEC基因工程疫苗奠定了基础。     

Application of a Recombinant Escherichia coli Whole‐Cell Catalyst Expressing Hydroxynitrile Lyase and Nitrilase Activities in Ionic Liquids for the Production of (S)‐Mandelic Acid and (S)‐Mandeloamide

The conversion of benzaldehyde and cyanide into mandelic acid and mandeloamide by a recombinant Escherichia coli strain which simultaneously expressed an (S)‐hydroxynitrile lyase (oxynitrilase) from cassava (Manihot esculenta) and an arylacetonitrilase from Pseudomonas fluorescens EBC191 was studied. Benzaldehyde exhibited a pronounced inhibitory effect on the nitrilase activity in concentrations ≥25 mM. Therefore, it was tested if two‐phase systems consisting of a buffered aqueous phase and the ionic liquid 1‐butyl‐1‐pyrrolidinium bis(trifluoromethanesulfonyl)imide (BMpl NTf₂) or 1‐butyl‐3‐methylimidazolium hexafluorophosphate (BMim PF₆) could be used for the intended biotransformation. The distribution coefficients of the substrates, intermediates and products of the reaction were determined and it was found that BMpl NTf₂ and BMim PF₆ were highly efficient as substrate reservoirs for benzaldehyde. The recombinant E. coli strain was active in the presence of BMpl NTf₂ or BMim PF₆ phases and converted benzaldehyde and cyanide into mandelic acid and mandeloamide. The two‐phase systems allowed the conversion of benzaldehyde dissolved in the ionic liquids to a concentration of 700 mM with product yields (=sum of mandelic acid and mandeloamide) of 87–100%. The cells were slightly more effective in the presence of BMpl NTf₂ than in the presence of BMim PF₆. In both two‐phase systems benzaldehyde and cyanide were converted into (S)‐mandeloamide and (S)‐mandelic acid with enantiomeric excesses ≥94%. The recombinant E. coli cells formed, in the two‐phase systems with ionic liquids and increased substrate concentrations, higher relative amounts of mandeloamide than in a purely aqueous system with lower substrate concentrations.