鳗弧菌单克隆抗体-胶体金检测方法的建立

以灭活鳗弧菌(SMW5)全菌为抗原,应用杂交瘤技术,制备了鳗弧菌单克隆抗体3株,分别命名为1H9、1C12、6F8,细胞亚类分别为IgG2a、IgM、IgG2b,其中1H9腹水效价为1∶6.4×105。制备鳗弧菌(SMW5)兔多克隆抗体,效价为1∶3.2×105。应用纳米胶体金颗粒标记单克隆抗体1H9并制备金标垫,抗鳗弧菌(SMW5)兔多克隆抗体与羊抗鼠抗体作为捕获抗体包被硝酸纤维素膜,分别作为检测线T和质控线C,建立鳗弧菌的胶体金免疫层析快速检测方法。经过对试纸条的特异性和灵敏度测定,结果表明:试纸条与嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、副溶藻弧菌、迟缓爱德华氏菌,7种水产常见病原菌没有交叉反应,与鳗弧菌特异性反应,检测灵敏度为6.3×104cfu·mL~(-1),检测所需时间低于10min。所制备的鳗弧菌胶体金免疫层析检测试纸条具有快速、简便、特异性高和适应基层生产推广应用等优点。     

伏马菌素B1胶体金免疫层析试纸条的研制

[目的]建立用于快速检测伏马菌素B1(FB1)的胶体金免疫层析试纸条。[方法]首先制备了FB1单克隆抗体和FB1-OVA偶联抗原,然后将FB1单克隆抗体与胶体金制成金标抗体包被在金标垫上,将FB1-OVA抗原和羊抗鼠Ig G包被在硝酸纤维素膜(NC膜)表面分别作为检测线和质控线。采用间接竞争法检测待检样品中的FB1与NC膜上的FB1-OVA抗原竞争结合金标抗体中的FB1单克隆抗体情况,并以检测线和质控线显示检测结果。[结果]本试验优化了金标抗体、检测抗原及羊抗鼠Ig G的包被量,检测FB1的灵敏度可达到2 ng·m L-1,最佳判定质量浓度为40 ng·m L-1。[结论]本试验制备的检测试纸条具有较高的特异性和稳定性,操作简单,检测时间仅需10 min,且与高效液相色谱法检测结果一致,可作为检测玉米中伏马菌素B1残留的有效手段。     

快速检测联苯菊酯的胶体金层析试纸条研制

[目的]采用免疫胶体金技术,建立一种快速检测联苯菊酯的试纸条方法。[方法]利用有机合成方法制备了联苯菊酯半抗原,并与载体蛋白偶联得到免疫抗原,利用人工免疫的方法获得其单克隆抗体,通过酶联免疫法对制备的单克隆抗体的性能进行了验证。联苯菊酯胶体金层析试纸条是利用单克隆抗体标记胶体金,并将联苯菊酯抗原与羊抗鼠Ig G分别喷制到硝酸纤维膜上,与样品垫、吸水垫组装在PVC衬板上制备而成。[结果]联苯菊酯胶体金层析试纸条检测限为500~800μg/kg,具有速度快、简单等优点。此外,该试纸条与大部分的拟除虫菊酯没有明显的交叉反应,利用该试纸条可实现对苋菜中联苯菊酯添加试验的准确判定。[结论]胶体金试纸条方法具有前处理简单、检测速度快、可以肉眼判断结果等优点,该试纸条有望实现对果蔬中联苯菊酯残留的快速筛查。     

基于单克隆抗体的胶体金试纸条检测水产品中甲霜灵的残留

为了建立检测水产品中抗水霉药物甲霜灵残留的快速初筛方法,采用基于单克隆抗体技术的胶体金标记检测水产品中甲霜灵残留。甲霜灵单克隆抗体为IgG1,Kappa型;重链50 ku,轻链20 ku,分子质量约为150 ku;亲和力常数为2.46×10⁹ L/mol;IC₅₀为59.57 ng/mL。利用甲霜灵单克隆抗体作为金垫,甲霜灵-牛血清白蛋白偶联物及羊抗鼠IgG作为检测线与质控线,制备了甲霜灵胶体金免疫层析试纸条。测定结果显示:胶体金试纸条在甲霜灵质量浓度为5 mg/mL时可检出,与恩诺沙星、磺胺甲恶唑、氟苯尼考、呋喃唑酮、吡喹酮、强力霉素、孔雀石绿和亚甲基蓝等8种药物均无交叉反应。利用试纸条对草鱼(Ctenopharyngodon idella)、花蛤(Ruditapes philippinarum)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)等水产品样品进行测试,在草鱼、凡纳滨对虾样品最低检测限可达2 mg/kg,花蛤样品最低检测限可达1 mg/kg。利用高效液相色谱法验证试纸条检测甲霜灵残留,主要数据验证结果一致。基于单克隆抗体的胶体金免疫条快速、灵敏、特异性强,适合作为水产品组织中甲霜灵残留检测的初筛方法。     

莱克多巴胺胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制

应用胶体金免疫层析技术建立了一种快速检测莱克多巴胺的方法.采用柠檬酸钠还原法制备胶体金颗粒,标记莱克多巴胺单克隆抗体并喷于玻璃纤维上,莱克多巴胺偶联OVA抗原和羊抗鼠IgG分别结合于硝酸纤维膜上,依次将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组装切割成莱兜多巴胺胶体金免疫层析快速检测试纸条.试验结果表明,陔快速检测试纸条的灵敏度为5 ng/mL,检测时间为5 min,批内和批问重复性为100%,假阳性率和假阴性宰均为0.     

抗H9N2 AIV HA单克隆抗体的制备及其在胶体金层析检测中的初步应用

用基因疫苗pcDNA-H9和纯化H9N2亚型AIV免疫Balb/C小鼠,细胞融合后用HI和ELISA方法筛选出5株抗H9亚型AIV HA的特异性单克隆抗体H9-01(2E6),H9-02(3B1),H9-03(3H11),H9-04(1A4),H9-05(2G9)。各株单抗亚型测定的结果为H9-01,H9-02和H9-05均为IgG2b,H9-03为IgG1,H9-04为IgG2a,轻链的亚型均为kappa链。经特异性和与同型病毒的反应谱检测,它们均是HA特异性单克隆抗体。用制备的抗H9亚型AIV HA的单克隆抗体做成胶体金层析检测试纸条,可以检测到200个EID50的H9亚型AIV,为监测该亚型AIV试剂盒的进一步商品化奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒p30二聚体鉴定及胶体金免疫层析方法建立

为建立一种制备简单、灵敏度高的非洲猪瘟病毒(ASFV)抗原快速检测方法,利用双表达载体pIRES在293A细胞上表达带有His标签和Flag标签的p30重组蛋白,裂解细胞后,通过免疫共沉淀发现p30重组蛋白以聚合体形式存在,进一步用质谱方法对原核系统表达纯化的p30重组蛋白进行分子量测定,结果证实,ASFV p30能自发形成二聚体。在此基础上,用抗p30的单克隆抗体6H9A10建立了单一单克隆抗体夹心检测p30二聚体的胶体金免疫层析方法,该方法对p30重组抗原最低检测浓度为2.1 ng·mL^-1,对PRV、CSFV、PRRSV、PCV-2、PEDV、PPV、SVA等抗原检测结果均为阴性;用该胶体金免疫层析方法检测已知的100份临床样品,其中包含20份ASFV阴性血清、20份ASFV阴性组织、10份ASFV阴性血浆、21份ASFV阳性血清、21份ASFV阳性组织、8份ASFV阳性血浆,结果显示,检测出的48份阴性样品和49份阳性样品与已知结果一致。综上,建立的单个单克隆抗体夹心检测p30的胶体金免疫层析方法具有良好的特异性和敏感性,有望用于ASFV抗原的临床快速检测...     

胶体金免疫层析试纸结合RT-PCR法快速检测烟草环斑病毒

利用烟草环斑病毒胶体金免疫层析检测试纸条,对烟草环斑病毒3个分离物进行了快速检测。结果表明,试纸条在10min内,可特异性检出烟草环斑病毒的3个分离物,对番茄环斑病毒、南芥菜花叶病毒、番茄黑环病毒和健康叶片无反应。剪下试纸条上显示的检测带,进行RT—PCR,能扩增到与预期大小相同的DNA条带。试纸条检测烟草环斑病毒粗提纯液,检测灵敏度在1μg·mL^-1,试纸条检测烟草环斑病毒的病汁液,检测灵敏度在10^-3（W／V）,试纸条检测灵敏度与DAS—ELISA方法灵敏度基本相同。     

胶体金免疫层析技术在水产品快速检测中的应用

胶体金免疫层析技术是集胶体金标记技术、免疫检测技术和层析分析技术于一体的免疫检测技术。该技术具有快速方便、灵敏度高、特异性强、无需辅助试剂和仪器、肉眼可观察结果、结果可长期保存等特点,已广泛应用于生物学的各个领域。主要阐述了胶体金免疫层析技术的基本原理、特点及分类,并简要介绍了该方法在水产品药物残留检测中的应用及其发展前景。     

检测牛、羊布鲁菌多重PCR方法的建立与应用研究

根据布鲁菌属特异性基因BCSP31和布鲁菌种间特异性标志IS711插入序列,设计合成3对引物,以牛种布鲁菌A19,羊种M5,猪种S2基因组DNA为模版,建立可同时检测布鲁菌属、牛种布鲁菌和羊种布鲁菌的多重PCR方法,并对方法的扩增效果、特异性、敏感性及适用性进行验证.结果显示,牛种布鲁菌可扩增出222bp和615bp两条带,羊种布鲁菌可扩增出222bp和932bp两条带,该方法对牛种布鲁菌A19和羊种布鲁菌M5混合DNA模板的最小检出量为100pg,对葡萄球菌26001株、大肠杆菌O78等7种参照菌的核酸扩增结果均为阴性.应用该方法对19份布鲁菌血清抗体为阳性牛乳样进行检测,结果均为布鲁菌抗原阳性.     

猪肺炎支原体168株特异性单抗的制备及鉴定

将猪肺炎支原体168株全菌蛋白免疫小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,3次亚克隆后,获得了4株针对168株全菌蛋白的单抗,分别将其命名为2F5、2G7、4F5、5E9。Western-blot检测结果表明,2G7、4F5与猪肺炎支原体具有特异性反应条带,不与猪鼻支原体、大肠杆菌反应。亚型鉴定结果表明,两株特异性单抗(2G7、4F5)的亚型属IgG1,轻链为κ型,2F5、5E9亚型属IgG2a,轻链为κ型。间接免疫荧光结果表明,4株单抗均与猪肺炎支原体168株有特异性荧光反应,特异性单抗的获得为猪肺炎支原体的检测及机理研究奠定基础。     

小尾寒羊骚痒病单抗制备及免疫组化检测方法的初步建立

【目的】通过表达羊PrPc核心片段、单抗制备，最后建立免疫组织化学检测羊痒病方法。【方法】用PCR方法从小尾寒羊基因组DNA中扩增编码PrPc核心片段DNA， 并克隆到硫氧还原蛋白融合表达载体pET-32a（+）上，转化至E.coli BL21，IPTG诱导融合表达。以纯化的重组小尾寒羊PrPc核心片段免疫PrPc基因敲除小鼠，利用淋巴细胞杂交瘤技术，制备羊核心片段单克隆抗体。【结果】通过上述方法，得到相对分子质量约为35 kD的重组小尾寒羊PrPc核心片段，筛选出六株能稳定分泌针对小尾寒羊PrPc核心片段特异单抗的杂交瘤细胞株。免疫组化试验表明,其中4株可特异性识别羊痒病脑组织切片中耐PK酶消化的PrPsc，经5次重复试验表明：所制备单抗与对照单抗F89结果完全一致。【结论】利用原核表达，单抗制备等技术制备出PrP特异性单克隆抗体，用笔者自己研制的单抗作为核心试剂初步建立了羊痒病免疫组化检测方法。     

鸭瘟病毒单抗的制备及胶体金试纸条检测方法的建立

【目的】鸭瘟（DP）是由鸭瘟病毒（DPV）引起的一种急性、败血性传染病,以头颈肿胀、食道黏膜和泄殖腔黏膜出血、黄白色溃疡,头颈部皮下有黄白色胶冻样渗出为特征。该病一旦发生,发病急、死亡快、死亡率高,对养鸭业危害严重。快速诊断是控制鸭瘟的重要措施之一,可以及时确定病原,以便采取有效的防制手段。试验旨在建立鸭瘟病毒（DPV）胶体金快速检测方法。【方法】利用生物学软件Protean分析,选择鸭瘟病毒抗原表位较多的一段序列设计引物,PCR扩增目的基因。连接到载体pMD-18T上,测序正确后再连接到原核表达载体pET-28a上。将获得的重组质粒转化至Rosetta感受态细胞中进行诱导表达。表达的蛋白经纯化后测其浓度并经Western blotting鉴定分析。以表达的DPV-gB蛋白作为抗原,免疫7周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选及亚克隆,获得DPV-gB特异性单克隆抗体。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,以制备的 H6F6单抗作为标记抗体（标记的最适pH为8.0-8.5,最佳标记浓度为15倍原液稀释）,将纯化的A8D7单抗（浓度为2倍原液稀释）和羊抗鼠IgG（浓度为10倍稀释）包被在硝酸纤维素膜（NC）上,分别作为检测线和质控线,经条件优化建立了鸭瘟病毒胶体金试纸条检测方法。【结果】共获得4株能稳定分泌抗DPV-gB蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为A8D7、E6C3、H11F8、H6F6。间接ELISA检测腹水效价分别为1:10³、1:10³、1:10⁵、1:10³。亚类鉴定结果分别为IgG2b、IgG2a、IgG2b、IgG1,轻链均为kappa链。Western blotting结果显示4株单抗均能与DPV-gB蛋白特异性结合。IFA结果显示制备的4株单抗是针对DPV产生的。建立的胶体金试纸条方法能够特异性地检测鸭瘟病毒,与鸭坦布苏病毒、H9N2亚型禽流感病毒、呼肠孤病毒、减蛋综合征病毒无反应。阳性尿囊液稀释50倍后用该试纸条检测依然为阳性;用不同批次的试纸条重复检测,结果无差异。利用制备的胶体金试纸条和PCR方法对38份临床样品进行检测比较,结果显示两者符合率为91.6 % 。【结论】本研究建立的试纸条检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性,可用于DPV的快速检测。     

抗犬瘟热病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

[目的]筛选出稳定分泌抗犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。[方法]用纯化的犬瘟热病毒(CDV)抗原免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA和有限稀释法克隆杂交瘤细胞。研究了杂交瘤细胞的稳定性和染色体数,测定了单克隆抗体的效价并鉴定其特异性和亚型。[结果]经反复筛选和亚克隆后,共获得3株能稳定分泌抗CDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。3株单抗对CDV均有较高的特异性,与犬传染性肝炎病毒、犬细小病毒均不反应。3株杂交瘤细胞的腹水效价为1∶(8 000~128 000),细胞培养上清效价为1∶(256~512),染色体数为80~100。3株单克隆抗体重链均属于IgG1,轻链均属于κ链。[结论]该研究为研制CDV快速检测试剂盒奠定了基础。     

伏马菌素B1单克隆抗体的制备及鉴定

 【目的】真菌毒素可导致严重的食品安全问题。本试验旨在制备可用于检测伏马菌素B1的特异性单克隆抗体。【方法】制备伏马菌素B1人工抗原,杂交瘤细胞法筛选杂交瘤细胞株制备腹水型单克隆抗体,并对其特性进行鉴定。【结果】筛选得到杂交瘤细胞株F3,分泌的单克隆抗体亚类为IgG1,轻链类型为κ链;10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳显示单抗蛋白重链分子质量约为50 kD,轻链分子质量约为25 kD;间接酶联免疫吸附法测定杂交瘤细胞F3细胞培养上清和腹水效价分别为1:3 200和1:51 200;亲和力常数为1.60×10-8 mol•L-1;IC50值可达3.589 ng•mL-1;对其它真菌毒素不存在交叉反应;免疫转印法鉴定抗体具有高特异性。【结论】本试验制备FB1单克隆抗体具有较好亲和力和高特异性,具有良好的应用价值。     

分泌抗苹果茎沟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

 用苹果茎沟病毒（ASGV）免疫的BALB/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞（Sp2/0-Ag14）融合，经3次克隆化培养和ELISA筛选，建立了7株分泌抗ASGV的单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞株。上述细胞株的腹水McAb滴度在1:256000 ～ 1:4096000之间，而且均不与另一种常见的潜隐病毒苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）起交叉反应。腹水McAb经纯化和辣根过氧化物酶（HRP）标记后，用间接ELISA方法检测感染ASGV的昆诺藜汁液，具有特异性强、灵敏度高等特点。     

抗犬瘟热病毒荧光标记单抗的制备和初步鉴定

[目的]建立利用单克隆抗体检测犬瘟热病毒的直接免疫荧光诊断方法。[方法]通过搅拌法,用异硫氰酸荧光素标记G蛋白纯化的抗犬瘟热病毒单抗CE3,对荧光抗体进行纯化、鉴定,并确定其最适工作浓度。对61份临床可疑犬瘟热病料进行直接免疫荧光检测。[结果]吸收试验、阻断试验和特异性试验结果显示,标记抗体具有高度的敏感性和特异性,与犬细小病毒（CPV）、犬副流感病毒（CPIV）、犬腺病毒（CAV）、狂犬病毒（RV）无交叉反应,其最优化工作浓度为1：80。对临床可疑犬瘟热病料的阳性检出率是48％。[结论]该研究建立的直接免疫荧光方法具有快速、特异和简便的优点,对犬瘟热疾病的早期诊断具有重要意义。     

杯伞(Clitocybe sp.)培养条件Box-Behnken法优化研究

 在Plackett-Burman试验设计结果基础上，采用Box-Behnken响应曲面法(response surface methodology, RSM)对影响杯伞(Clitocybe sp.) AS 5.112发酵胞外多糖与生长的关键培养条件(培养温度、时间和装液量)进行了探讨。结果表明，在培养温度为24.3～25.8℃、时间为9.7～10.2 d和装液量为76.0～90.0 ml条件下，每毫升发酵醪可获得 1 253.00 ?g胞外多糖；而在培养温度为23.8～24.8℃、时间为9.6～10.3 d、装液量为71.0～98.0 ml范围内，每毫升发酵醪可获得8.32 mg菌丝生长量。通过对胞外多糖曲面方程和菌丝干重二次多项回归方程解逆矩阵得知，在培养温度、时间和装液量分别为25.0℃、9.9 d和83.4 ml时，杯伞AS 5.112胞外多糖的最大预测值为1265.45 ?g·ml-1发酵醪，在上述自变量分别为24.4℃、9.9 d和87.1 ml时，菌丝浓度可达8.50 mg·ml-1发酵醪；在24.5℃、9.9 d和84.7 ml的条件下，每毫升发酵醪可同时获得1 261.60 ?g胞外多糖和8.47 mg菌丝量。验证试验证实了该方程的预测值与实际值之间具有较好的拟合度。