蛔虫过敏原ABA-1融合基因在大肠杆菌中的表达及鉴定

背景：利用蛔虫基因融合技术,可将过敏原ABA-1的主要基因进行融合。目的：利用大肠杆菌表达系统重组表达蛔虫主要过敏原ABA-1融合蛋白。方法：从Gene Bank和Protein Database中获取蛔虫主要过敏原ABA-1基因和蛋白序列,选定其中的ABA-1B1,ABA-1A2与ABA-1A1基因重组为融合基因BAA,经密码子优化后,全基因合成目的基因BAA并构建于表达载体PET-44a上,经KCM法转化入大肠杆菌JM109中进行克隆,PET-44a/BAA经NdeⅠ和PstⅠ双酶切及DNA测序正确后,转化入大肠杆菌RosettaBlue^ TM中,经IPTG诱导表达。表达蛋白经Ni柱亲和层析纯化后,通过Western blot和氨基酸测序鉴定目的蛋白。结果与结论：大肠杆菌的融合蛋白BAA表达量约占总蛋白的40%,纯化后蛋其白纯度可达90%左右。Western Blot结果显示在相对分子质量45000处可见一特异目的条带,氨基酸测序显示N端15个氨基酸与目的蛋白完全相同。结果证实,融合蛋白BAA在大肠杆菌中得到高效的表达。     

血管性血友病因子A1分子在大肠杆菌中的可溶性表达及功能鉴定

背景：血管性血友病因子A1通过介导随流血小板在受损血管部位的黏附在初始止血中发挥至关重要的作用,但重组A1在原核中多为包涵体表达,不利于纯化及体外的功能研究。目的：在大肠杆菌中稳定高效表达可溶性野生型血管性血友病因子A1以及突变型血管性血友病因子G1324S,并研究其生物学功能。方法：将血管性血友病因子A1（野生型）、血管性血友病因子G1324S（功能失去型突变体）重组质粒分别转化到感受态细胞DH5α中,筛选提取质粒。将提取的质粒分别转化到大肠杆菌（E.coli）BL21、E.coli M15中,筛选挑单克隆菌于LB培养基,扩大培养。比较溶菌酶破碎法和超声波破碎法两种不同的裂菌方法,使目的蛋白血管性血友病因子A1的可溶性表达,经过Ni柱亲和层析纯化蛋白,用SDS-PAGE和Western-blot鉴定纯化的血管性血友病因子A1、血管性血友病因子G1324S纯度和免疫学活性;采用流动腔实验系统分析在不同流体剪应力条件下,血小板在两种目的蛋白上的黏附能力。结果与结论：每100 mL上清液可分别纯化得到5.77 mg血管性血友病因子A1,6.83 mg血管性血友病因子G1324S纯品,并具有较高的纯度和免疫学活性。流动腔结果显示,对每个剪切应力下铺设不同A1分子的底板进行两两比较,随着流体剪应力从0.1 Pa提高1 Pa,G1324S突变组所黏附细胞数下降的幅度（46.8%）要远高于野生型组（20.5%）,说明突变后的A1分子的功能有所减弱。结果表明纯化的蛋白介导血小板黏附的能力与临床特征一致,野生型血管性血友病因子的结合活性明显高于突变型。     

融合基因Tat—HPV16L1的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:构建人乳头瘤病毒16型L1基因和蛋白转导肽基因Tat的融合表达载体,以大肠杆菌作为表达系统,探索制备经济而高效的人乳头瘤病毒疫苗的新方法.方法:以pBR322-HPV16质粒为模板扩增L1基因,与原核表达载体pET28a连接,重组质粒再与自行设计蛋白转导功能片段Tat连接,经测序鉴定后转入大肠杆菌表达菌株DE3进行诱导表达Tat-HPV16L1融合蛋白.结果:融合基因Tat-HPV16L1测序结果与预期完全符合,经过IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE电泳分析,结果诱导表达成功.结论:本研究为制备经济而高效的人乳头瘤病毒疫苗打下了基础.     

构建血红素氧合酶1基因真核表达质粒及在大鼠主动脉平滑肌细胞中的表达

目的：克隆血红素氧合酶1基因并构建其真核表达重组质粒，进一步检测血红素氧合酶1基因转染大鼠主动脉平滑肌细胞及其表达目的蛋白的效果。 方法：实验于2007-02／12在泸州医学院中心试验室完成。取雄性健康成年SD大鼠1只，腹腔注射氯化汞（1mg／kg）24h后，麻醉状态下取肾脏，从大鼠肾组织中提取总RNA，通过反转录-聚合酶链反应扩增大鼠血红素氧合酶1基因片段，并将其克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋）中，运用脂质体将重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1转染主动脉平滑肌细胞，通过反转录-聚合酶链反应和Western blot分析血红素氧合酶1基因细胞转染及表达的效果。 结果：经双酶切及测序鉴定证明，正确克隆了血红素氧合酶1基因并成功构建了真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1。反转录-聚合酶链反应及Western blot分析显示血红素氧合酶1基因能成功转染主动脉平滑肌细胞并在mRNA水平和蛋白水平有效表达。 结论：①成功构建血红素氧合酶1基因真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1。②脂质体包裹重组质粒瞬时成功转染到体外培养的主动脉平滑肌细胞并得到有效表达。     

Beclin1基因慢病毒表达载体的构建和鉴定

背景:Beclin 1基因是哺乳动物的自噬调控基因。目的:实验拟构建Beclin 1基因慢病毒过表达载体。方法:聚合酶链反应扩增目的基因Beclin 1后插入慢病毒表达载体pLenex中,构建重组载体pLenex-Beclin 1。使用聚合酶链反应、双酶切和DNA的测序方法对其进行鉴定,并与辅助包装质粒共感染293T细胞。慢病毒颗粒转染非小细胞肺癌A549细胞后,用蛋白质印迹法检测Beclin 1基因的过表达效率。结果与结论:聚合酶链反应鉴定结果显示扩增的阳性片段已插入pLenex载体,聚合酶链反应、双酶切和DNA测序结果表明,重组慢病毒载体pLenex-Beclin 1的插入序列完全正确,重组慢病毒载体感染A549细胞后,细胞内Beclin 1蛋白高效表达。结果证实,实验成功构建了Beclin 1基因慢病毒过表达载体。     

弓形虫表面抗原SAG1基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 体外扩增弓形虫RH株膜表面抗原SAG1编码基因，构建原核表达质粒，并表达SAG1编码基因序列。方法 收集、纯化RH株速殖子，提取RNA，据已知的SAG1基因序列，在设计合成的1对引物中引入EcoRI和HindⅢ酶切位点。应用RT—PCR技术，扩增SAG1基因片段，插入原核表达质粒pET28a中，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，重组子经EcoRI和HindⅢ双酶切、PCR鉴定，转化宿主菌BL21，并以IPTG诱导表达。结果 从弓形虫RH株RNA中扩增出1011bp的SAG1基因片段，构建重组质粒pET28a／SAG1，酶切和PCR鉴定产物大小均与预期值相符；IPTG诱导，SDS—PAGE显示表达产物的大小约34．8kD．结论 成功地从弓形虫RH株RNA中获取SAG1基因，构建了pET28a／SAG1重组质粒并获得了高效表达，为免疫学诊断和蛋白质疫苗的研究创造了条件。     

Beclin1基因慢病毒表达载体的构建和鉴定

背景：Beclin 1基因是哺乳动物的自噬调控基因。目的：实验拟构建Beclin 1基因慢病毒过表达载体。方法：聚合酶链反应扩增目的基因Beclin 1后插入慢病毒表达载体pLenex中,构建重组载体pLenex-Beclin 1。使用聚合酶链反应、双酶切和DNA的测序方法对其进行鉴定,并与辅助包装质粒共感染293T细胞。慢病毒颗粒转染非小细胞肺癌A549细胞后,用蛋白质印迹法检测Beclin 1基因的过表达效率。结果与结论：聚合酶链反应鉴定结果显示扩增的阳性片段已插入pLenex载体,聚合酶链反应、双酶切和DNA测序结果表明,重组慢病毒载体pLenex-Beclin 1的插入序列完全正确,重组慢病毒载体感染A549细胞后,细胞内Beclin 1蛋白高效表达。结果证实,实验成功构建了Beclin 1基因慢病毒过表达载体。     

EEF1A2嵌合型重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:克隆人类真核翻译延长因子1A2(EEF1A2)基因全长,构建其重组腺病毒载体。方法:应用RT-PCR方法从人胰腺癌组织中扩增人EEF1A2基因全长,经T-A克隆后,亚克隆到腺病毒穿梭质粒pDC316,构建穿梭质粒pDC316-EEF1A2。利用同源重组的方法将腺病毒骨架质粒pBHG35和穿梭质粒pDC316-EEF1A2共转染293细胞,获得腺病毒重组质粒Ad5/F35-EEF1A2,经过在293细胞中包装和扩增之后,获得高滴度的腺病毒重组质粒Ad5/F35-EEF1A2。PCR、WesternBlot检测EEF1A2基因的表达。结果:用RT-PCR方法,从人胰腺癌组织中扩增出1400bp的cDNA片段,经测序证实为人EEF1A2基因。构建及包装出高滴度的重组腺病毒载体Ad5/F35-EEF1A2。结论:成功地克隆了人EEF1A2基因全长,并构建其表达的重组腺病毒载体,为进一步研究人EEF1A2基因在相关疾病中的作用奠定了基础。     

铜绿假单胞菌VgrG1a蛋白的原核表达及其人鼠嵌合型单抗的制备与鉴定

目的：探究铜绿假单胞菌Ⅵ型分泌系统VgrG1a蛋白的原核表达方法，并制备鼠源性和人鼠嵌合型单克隆抗体为抗铜绿假单胞菌感染提供了研究基础。方法：根据NCBI网站上查找到的VgrG1a序列合成重组质粒pET-21a-VgrG1a，转化大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）plysS进行诱导。通过免疫沉淀法和酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）对诱导得到的重组蛋白进行表达、纯化和鉴定。用纯化后的VgrG1a重组蛋白免疫BALB/c小鼠，制备鼠源多克隆抗体，并利用ELISA方法测定小鼠血清抗体的效价和特异性。通过P3X63Ag8.653骨髓瘤细胞融合小鼠脾细胞制备杂交瘤细胞，再通过有限稀释法获得单克隆细胞。经多次ELISA筛选出能够稳定产出特异性抗体的细胞株。在公司测序后获得单克隆抗体的序列信息，并设计出含有此抗体的质粒，转染Expi293细胞，制备人源化单克隆抗体。结果：结果显示，实验成功构建了VgrG1a重组质粒，经探索在最佳表达诱导条件下（温度16℃，IPTG浓度0.5mM，诱导时间16小时），表达得到了重组蛋白VgrG1a，SDS-PAGE显示72kDa处重组蛋白浓度最高。检测制备的鼠源抗体在稀释到1/640000后效价仍较高，并且与目的蛋白能够能特异性的识别并结合。人鼠嵌合型单克隆抗体8A4F5对抗原VgrG1a亲和力高于鼠源单克隆抗体。结论：以上结果表明，该原核表达的重组蛋白具有良好的免疫原性，利用表达的重组蛋白制备的单克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性，为进一步研究蛋白的结构与功能、研制相关的诊断试剂及疫苗提供了生物材料。     

人PIF1全长基因及其截短体真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人PIF1基因5端、3端及全长基因的真核表达载体。方法从pCR2.1-TOPO-PIF1原始质粒中,采用PCR方法扩增目的基因PIF1,PIF1N及PIF1C,将目的基因和目的载体pcDNA3.1（-）分别酶切;纯化酶切产物后定向连接,并将其转化大肠杆菌DH5α,对生长出的克隆行特异限制性内切酶酶切鉴定,鉴定为阳性的克隆送样测序。结果凝胶成像结果显示重组基因pcDNA3.1（-）-PIF1,pcDNA3.1（-）-PIF1N及pcDNA3.1（-）-PIF1C酶切后条带大小分别为1 926,540,1 428bp。结论成功构建hPIF1基因5端、3端及全长基因表达载体,分别为pcDNA3.1（-）-PIF1N,pcDNA3.1（-）-PIF1C及pcDNA3.1（-）-PIF1。     

人PIF1全长基因及其截短体真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人PIF1基因5端、3端及全长基因的真核表达载体。方法从pCR2.1-TOPO-PIF1原始质粒中,采用PCR方法扩增目的基因PIF1,PIF1N及PIF1C,将目的基因和目的载体pcDNA3.1(-)分别酶切;纯化酶切产物后定向连接,并将其转化大肠杆菌DH5α,对生长出的克隆行特异限制性内切酶酶切鉴定,鉴定为阳性的克隆送样测序。结果凝胶成像结果显示重组基因pcDNA3.1(-)-PIF1,pcDNA3.1(-)-PIF1N及pcDNA3.1(-)-PIF1C酶切后条带大小分别为1 926,540,1 428bp。结论成功构建hPIF1基因5端、3端及全长基因表达载体,分别为pcDNA3.1(-)-PIF1N,pcDNA3.1(-)-PIF1C及pcDNA3.1(-)-PIF1。     

PAI-1蛋白在子宫内膜异位症组织的表达及意义

目的：探讨PAI-1蛋白在异位内膜、在位内膜厦对照组内膜的表达及意义。方法：应用免疫组化方法检测PAI-1蛋白在40例内异症组异位内膜及在位内膜，30例对照组子宫内膜的表达。结果：①PAI-1蛋白表达于异位内膜、在位内膜、对照组内膜的腺上皮细胞及间质细胞胞浆；②PAI-1蛋白在异位内膜厦对照组内膜间质细胞表达均高于腺上皮细胞（P〈0．05），而于在位内膜腺上皮细胞与间质细胞表达比较无统计学意义（P〉0．05）；③PAI-1蛋白在间质细胞表达异位内膜高于在位内膜及对照组内膜（P〈0．05），而在腺上皮细胞表达异住内膜、在位内膜、对照组内膜三者之间比较无统计学意义（P〉0．05）；④PAI-1蛋白在血管内皮细胞呈阳性表达。结论：PAI-1蛋白在异位内膜间质细胞高表达可能促使其转移、黏附、侵袭、生长，导致子宫内膜异住症的发生发展。     

乳腺癌组织中BRMS1和VEGF-C蛋白的表达及意义

目的:探讨BRMS1、VEGF-C蛋白在乳腺癌组织中的表达及意义。方法:采用免疫组织化学方法检测乳腺癌组织、癌旁组织及乳腺良性病变标本BRMS1、VEGF-C蛋白的表达,结合临床病理资料进行统计学分析。结果:(1)乳腺癌组织、癌旁组织和乳腺良性病变组织中BRMS1阳性率分别为57.1%、90.6%、100%(P<0.01)。BRMS1的表达在有淋巴结转移组、临床病理分期Ⅲ+Ⅳ组、及ER阳性组,BRMS1的表达显著降低(均P<0.01)。(2)乳腺癌组、癌旁组织和乳腺良性病变组织中VEGF-C的阳性率分别为58.7%、18.8%、17.2%(P<0.01)。VEGF-C的表达在有淋巴结转移组、临床病理分期Ⅲ+Ⅳ组,VEGF-C的表达显著增强(P均<0.01)。(3)乳腺癌中BRMS1与VEGF-C表达呈负相关。结论:BRMS1与VEGF-C在乳腺癌的转移过程中可能存在相互作用,联合检测乳腺癌组织中BRMS1与VEGF-C蛋白的表达,有助于判断其转移及预后。     

HIV-1 CN54 Gag P55和P24蛋白的高效表达、纯化和鉴定

目的　探讨HIV 1中国株CN5 4GagP5 5和P2 4重组蛋白的高效表达并纯化 ,为研究HIV疫苗和诊断试剂创造条件。方法　分别将CN5 4GagP5 5和P2 4基因克隆至 pBV2 2 0和 pThioHisC载体 ,构建非融合表达载体 ;将重组质粒转化大肠杆菌BL2 1codonplus RIL ,对工程菌进行诱导表达。Western Blot检测目的蛋白 ,用DEAE SeparoseFF阴离子交换层析柱纯化目的蛋白 ;纯化的P5 5和P2 4抗原蛋白分别包被酶标板作ELISA检测。结果　P5 5以包涵体的形式表达 ,表达量占菌体总蛋白的 30 % ,P2 4实现了可溶性表达 ,表达量占总菌体总蛋白的4 0 % ;纯化后P5 5纯度达到 80 % ,P2 4纯度超过 90 %。Western Blot和ELISA检测均显示了良好的的灵敏度和特异性。结论　HIV 1CN5 4GagP5 5和P2 4抗原蛋白可在大肠杆菌中高效表达 ,纯化的抗原蛋白具有良好抗原性 ,可用于HIV基础研究和临床检验     

细胞质膜微囊蛋白Caveolin-1在乳腺癌中的表达及意义

目的:探讨细胞质膜微囊蛋白Caveolin-1在乳腺癌中的表达及意义。方法:采用免疫组织化学Envision法检测60例乳腺癌患者的肿瘤组织、癌旁正常乳腺组织和乳腺良性肿瘤内Caveolin-1的表达,结合临床病理资料进行统计学分析。结果:乳腺癌、乳腺非典型增生、乳腺良性肿瘤和正常乳腺组织中Caveolin-1的阳性表达率分别为10%、12%、30%和40%,其中浸润性乳癌10%,原位癌20%,淋巴结转移20%,无淋巴结转移组30%。乳腺良恶性病变、正常乳腺组织之间差异有统计学意义。结论:Caveolin-1的表达与乳腺癌的浸润和转移密切相关,有可能作为乳腺癌的抑癌基因,其表达对于乳腺癌癌细胞转移的诊断、分级以及乳腺癌的预后有一定的指导作用。     

Y-盒结合蛋白1在乳腺癌组织中的表达及临床意义

目的：检测Y-盒结合蛋白1（YB-1）在乳腺癌及癌旁正常乳腺组织中的表达,探讨其与乳腺癌发生、发展的关系。方法收集河北大学附属医院2012年9月至11月期间手术切除的乳腺癌组织（均为术后石蜡病理确诊为浸润性导管癌）标本30例,癌旁正常乳腺组织标本10例。应用免疫组织化学染色的方法检测组织中 YB-1的表达。结果免疫组化结果显示,YB-1在癌旁正常乳腺组织细胞中无表达或低表达;在乳腺癌组织中高表达,阳性表达率为80%,与癌旁正常乳腺组织相比差异有统计学意义（P＜0.05）。YB-1在Ⅰ期乳腺癌组织中的免疫组化评分显著低于Ⅱ期乳腺癌组织（2.6±1.511 vs.4.2±1.182, P＜0.05）。YB-1在无腋窝淋巴结转移的乳腺癌组织中的表达显著低于伴腋窝淋巴结转移的乳腺癌组织（2.8±1.15 vs.5.1±0.74,P＜0.05）。结论 YB-1乳腺癌中表达上调与乳腺癌临床分期及淋巴结转移有关。