十字花科黑腐病菌中调控致病相关基因hpaS的XC_2486基因鉴定

十字花科黑腐病菌hpaS影响致病性、HR其编码产物分别与HpaR2、HrpG形成双组分系统。为了深入了解hapS的表达调控机制,本研究将hpaS的启动子与蔗糖敏感基因sacB融合,构建了hpaS的表达报告质粒pL6sacB3670并导入十字花科黑腐病菌野生型菌株8004中,获得了报告菌株8004/pL6sacB3670。然后利用转座子EZ：Tn5对该报告菌株进行诱变,筛选到一株转座子EZ：Tn5插入基因组的克隆。通过测序定位分析发现该克隆是由转座子EZ：Tn5插入到编号为XC_2486的ORF所产生的。然后将hpaS启动子与报告基因gusA融合的报告质粒pL6GUS3670分别导入野生型8004和XC_2486的突变体239C02中,测定比较pL6GUS3670的GUS表达水平,结果显示在突变体背景下GUS表达水平明显比在野生型背景下降低。这表明XC_2486正调控hpaS的表达。对XC_2486突变体239C02进行致病性和过敏反应检测发现,XC_2486与致病性相关,与HR无关。     

水稻条斑病菌的hpal和hpaB基因控制水稻的致病性,但不决定烟草的过敏反应

水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)的hrp基因簇编码Ⅲ型分泌系统(T3SS),将致病性效应分子注入寄主细胞中,决定在寄主水稻(Oryza sativa)的致病性(pathogenicity) 和在非寄主烟草(Nicotiana benthamiana)的过敏性反应(hypersensitive response,HR).Hpa1可在烟草上激发HR,HpaB是T3SS的出口控制蛋白.为了解Hpa1与HpaB是否共同决定病菌Xoc在烟草上的HR以及在水稻上的致病性,本研究通过基因敲除方式分别获得了hpa1和hpaB的单突变体以及hpa1hpaB双突变体.致病性测定结果显示,hpa1突变体在水稻上的毒性减弱,在烟草上仍能激发HR;hpaB单突变体以及hpa1和hpaB双突变体在烟草上仍能激发HR,但对水稻无致病性.这暗示,水稻条斑病菌除Hpa1外,还存在不依赖HpaB分泌的未知Harpin蛋白.免疫杂交结果显示,hpaB突变后,效应分子XopQxoc不能通过T3SS进行分泌.这提示,HpaB控制了T3SS效应分子的分泌,从而决定Xoc对水稻的致病性.这些结果为进一步发掘水稻黄单胞菌中的未知Harpin蛋白以及分析依赖或不依赖HpaB进行分泌的T3SS效应分子与水稻的互作关系,提供了科学线索.     

十字花科黑腐病菌中转录调控因子HpaR1调控一个纤维素酶基因的表达

十字花科黑腐病菌（Xcc8004）中的一个转录调控因子XC2736（npaRI）在致病过程中具有重要的作用。前期研究发现该转录调控因子可能调控胞外纤维素酶的合成。为了解HpaRI对纤维素酶的转录调控机理,本研究对HpaR1进行原核表达纯化,并与488bp的包含XC0639的启动子区DNA片段进行凝胶电泳迁移率试验,发现HpaR1与XC0639启动子可以发生结合。将488bp的XC0639的启动子DNA片段与报告基因gus融合,构建XC0639的报告质粒pGUS0639r,分别导入野生型8004菌株和缺失突变体DM2736中,分析发现在突变体背景下GUS的表达水平比野生型背景明显降低。表明HpaRl正调控XC0639的表达。构建XC0639的极性整合突变体PK0639,检测发现PK0639几乎丧失胞外纤维素酶的活力;通过功能反式互补构建的互补菌株CPK0639可以恢复纤维素酶活性。研究结果表明HpaRl通过调控纤维素酶基因XC-0639的表达来调控细胞的纤维素酶活性。本研究为更深入地了解HpaR1如何调控细菌生理生化功能奠定了基础。     

贵州地方稻种来拢小圆粒半矮秆突变体srd-1筛选及鉴定

以贵州地方稻种来拢突变体库中能稳定遗传的小圆粒半矮秆突变体srd-1为材料,对其半矮化和小圆粒性状分子机制进行研究.暗形态建成表明srd-1突变体矮化性状与BR无关.srd-1突变体表现对GA敏感,外源GA3对突变体幼苗第2叶鞘有促进生长作用,能诱导α-淀粉酶活性,可以使倾斜方向排列的细胞微管骨架恢复至野生型横向排列方向,表明srd-1突变体矮化性状与GA信号传导途径无关.GA合成途径中关键酶基因OsKS1和OsGA2ox1表达相对于野生型差异不显著,OsCPS、OsKO2、OsKAO、OsGA20ox2和Os GA3 ox2基因表达下调,初步说明srd-1突变体的矮化性状可能是由活性GA生物合成降低所致.此外,小圆粒调控基因SRS1、SRS3和SRS5表达下调,表明srd-1突变体突变基因同时参与了籽粒大小和株高的调控,突变基因影响了活性GA的生物合成和小圆粒调控关键酶基因的表达,进而导致了矮化和小圆粒表型的产生.该研究为突变体突变基因的定位及利用研究提供了参考.     

小麦矮秆突变体DC20的转录组分析

为探明小麦矮杆突变体DC20致矮的分子调控机制,以小麦D6-3(WT)及其经高能混合粒子场诱变处理得到的矮秆突变体DC20为试验材料,通过对突变体DC20和WT的转录组分析,挖掘与DC20致矮相关差异表达基因。结果表明,在株高差异起始的孕穗期茎秆中,DC20与WT之间存在2 153个差异表达基因(DEGs),除参与糖代谢、能量代谢、转录调控、转录后修饰和翻译及翻译后修饰途径外,其中有47个差异表达基因显著富集在植物激素GAs的生物合成和IAA的动态平衡调节及信号转导、细胞周期调控以及细胞伸长等相关途径。大部分差异表达基因表现为表达下调,少量抑制因子的表达量上调。内源植物激素检测结果显示,DC20孕穗期茎秆中的IAA、GA₁和GA₃含量均显著低于WT。表明辐射诱变处理产生的变异是通过植物激素GAs与IAA的协同作用,调控细胞周期以及细胞伸长等途径相关基因的下调表达,从而对DC20的株高产生影响,形成矮化表型。本研究结果为更好地运用辐射诱变育种手段进行作物育种以及阐明矮秆突变体形成的分子调控机理研究提供了一定的理论依据。     

瓜类细菌性果斑病菌hpaP基因的功能分析

瓜类细菌性果斑病(bacterial fruit blotch of watermelon,BFB)是近年来发生在西瓜、甜瓜等葫芦科(Cucurbitaceae)植物上的重要细菌病害,由西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli,Ac)引起.本研究以xjL12菌株为背景构建了转座子(Tn5)插入文库.通过注射接种哈密瓜(Cucumis melo var.saccharinus)子叶和烟草叶片进行突变体的筛选,得到l株致病性完全丧失并失去激发烟草(Nicotiana tabacum)过敏反应的突变体△xj48.对△xj48中转座子插入基因的克隆和测序表明,其突变基因为西瓜噬酸菌Ⅲ型分泌系统(T3SS)中的保守基因hpaP.利用基因重组技术构建了hpaP基因的突变体,发现hpaP突变后影响了xjL12菌株的游动性、生物膜的形成能力及hrcV基因的表达.hpaP基因的互补菌株部分恢复其致病力.本研究证实了果斑病菌中的hpaP基因与该细菌的致病力相关,在侵染瓜类作物的过程中起着不可缺失的作用.     

小麦矮秆突变体DC20赤霉素合成及信号转导途径关键基因表达分析

小麦矮秆突变体DC20是经高能混合粒子场处理得到的,表现为赤霉素敏感型。本文采用实时荧光定量PCR技术,研究该突变体矮秆性状与GA合成及信号转导途径相关基因表达的关系。共检测编码GA合成途径关键酶和编码信号转导途径作用因子的10个关键基因。其中,编码内-贝壳烯杉氧化酶(KO)的GA3基因和编码正调控因子基因GAMYB的表达量极显著下调,下调倍数分别为20.0、3.1;2个编码负调控因子基因GAI和SPY显著上调,上调倍数分别为2.3、1.3。外源GA3(赤霉酸)处理能够抑制编码负调控因子基因GAI、SPY和RGA的转录,而GA合成关键酶基因GA3及正调控因子基因GAMYB转录水平显著升高表明DC20矮秆基因对GA相关途径的受外源GA3的调节。     

水稻白叶枯病菌rpfC基因DNA序列的测定分析

ｒｐｆＣ是甘蓝黑腐病菌中全局性调控胞外酶和胞外多糖合成以及致病性的一个基因簇中的一个基因。已从水稻白叶枯病菌中鉴定和克隆到一个在功能上能互补甘蓝黑腐病菌的ｒｐｆＣ突变体的基因，并通过构建突变体证实了这一基因在水稻白叶枯病菌致病性中起重要作用。本研究对水稻白叶枯病菌的这一基因的ＤＮＡ序列进行了测定分析，结果表明，它与甘蓝黑腐病菌的ｒｐｆＣ基因具有高度的同源性。因此，将水稻白叶枯病菌的这一基因也称为ｒｐｆＣ基因     

At2g29080基因可能参与了拟南芥盐代谢的调节

为进一步阐明植物盐代谢机理，以哥伦比亚生态型（Columbia type)野生拟南芥（Arabidopsis thaliana)及其盐敏感突变性（salt overly sensitive2,sos2）为材料，50mmol/L NaCl处理3d，利用mRNA差异显著显示技术分离得到了只在野生型拟南芥中表达，而在sos2突变体中不表达的一个未知功能的At2g29080基因片段DD156。序列同源性分析表明，它是一类大的蛋白家族AAA ATPase（ ATPase associated to a variety of cellular activities)中一员。Northern blot显示，随着NaCl处理浓度的升高。该基因在野生型拟南芥中的表达量增加。而在sos2突变体中，该基因的表达一直处于很低水平。这是首次发现AAA ATPase与植物的盐代谢有关。进一步研究发现，线粒体细胞色素氧化酶活化的变化，与与该基因在野生型和sos2突变体中的表达呈密切相关。表明该基因的编码产物可能参与了拟南芥线粒体细胞色素氧化酶活性的调控。     

野油菜黄单胞菌6-磷酸果糖激酶基因的初步分析

6-磷酸果糖激酶是糖酵解途径中的关键酶,它催化糖酵解途径中第一个不可逆反应。本研究利用pK18mobsacB自杀质粒采用同源双交换的方法对野油菜黄单胞菌Xcc8004中的6-磷酸果糖激酶基因（XC_0872）进行缺失突变,获得无标记的缺失突变体DM0872。表型检测结果显示DM0872突变体不影响野油菜黄单胞菌对葡萄糖和果糖的利用,不影响胞外多糖的合成,也不影响其致病性。该结果显示糖酵解途径在野油菜黄单胞菌的地位并不重要。另外,我们利用RT-PCR方法检测了XC_0872的转录情况,结果显示XC_0872在Xcc8004中是转录的。而之前曾有报道称黄单胞菌中无法检测出6-磷酸果糖激酶活性,这表明XC_0872进行了转录后调控从而使6-磷酸果糖激酶活性受到限制。本研究为野油菜黄单胞菌中糖酵解途径的调控提供了理论依据,对揭示野油菜黄单胞菌中该途径的调控机制具有一定的意义。     

十字花科黑腐病菌中一个与黄色素合成相关基因的鉴定

十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv.campestris,简称Xcc）能够产生大量的胞外多糖。胞外多糖商品名又称为黄原胶,具有广泛用途,在食品生产中可作为添加剂使用。为了得到不含黄色素的黄原胶,我们采用转座子EZ-Tn5随机插入诱变的方法对8004菌株进行突变,获得了一株不产黄色素的突变体。通过对突变体的转座子EZ-Tn5插入位点进行分析,发现该突变体是由于编号为XC_4097的基因被插入突变后衍生而来。同源性分析表明XC_4097编码一种脂质酰基转移酶,它与脂质的合成有关。采用同源双交换方法构建XC_4097基因的缺失突变体。通过对野生菌、突变体以及功能回补体的表型分析进一步证实了XC_4097基因功能的丧失只影响黑腐病菌黄色素的合成,而不影响细菌生长以及胞外多糖的合成。这为工业上生产无黄色素的黄原胶提供了应用基础。     

野油菜黄单胞菌XC1892基因与致病力关系的分析

野油菜黄单胞菌野油菜变种(简称Xcc)是十字花科作物黑腐病的病原菌。在前期工作中,从Xcc8004菌株获得1株编号为XC1892的基因的转座子Tn5gusA5突变体,其致病力降低。根据基因组注释,XC1892编码1个DsbE蛋白,参与细胞色素的合成。为评估XC1892的功能,采用自杀质粒pK18mob对XC1892进行诱变,获得非极性突变体1892nk。对突变体的表型分析发现,其致病力及胞外多糖产量分别是野生型的59%和55%。用一段包含XC1892基因的DNA片段对突变体1982nk进行功能互补,其致病力和胞外多糖产量基本得到恢复。这表明XC1892基因与Xcc的致病力和胞外多糖合成产量有关。     

野油菜黄单胞菌2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶基因的突变分析

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种是发酵工业生产黄原胶的菌种,通过对Xcc8004菌株全基因组序列进行搜索,发现该菌株拥有完整的ED、EMP、HMP等糖代谢途径。为评估ED途径对细胞功能的影响,选择基因组中编码ED途径的关键酶——2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的基因eda进行诱变,构建非极性突变体。通过对突变体表型进行分析,发现eda基因的突变体在培养基中能够正常生长繁殖,但其胞外多糖产量则降低77．6％。用一段包含eda基因的DNA片段对突变体进行功能互补,能基本恢复胞外多糖产量。这表明eda基因对细胞合成胞外多糖有重要影响,也暗示ED途径对细胞生长是非必要的,而对细胞大量合成胞外多糖是必须的。     

互补野油菜黄单胞菌野油菜致病型T113突变体胞外多糖产生的DNA片段的克隆

以从野油菜黄单胞菌野油菜致病型（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）胞外多糖突变体Ｔ１１３中克隆的含转座子Ｔｎ５ｇｕｓＡ５及其两侧相邻序列的１２．３ｋｂＥｃｏＲＩＤＮＡ片段为探针,从野生型菌株８００４中克隆到与突变位点相对应的６．５ｋｂＥｃｏＲＩ片段,克隆于载体ｐＬＡＦＲ３上的该片段能反式互补突变株Ｔ１１３的胞外多糖产生,说明该片段上含有至少一个与胞外多糖产生有关的基因。     

野油菜黄单胞菌一个假定蛋白激酶基因与多糖合成及致病力相关

已报道的野油菜黄单胞菌8004菌株基因组中,开放阅读框XC3631注释编码一个假定蛋白激酶。通过定点整合突变方法构建了XC3631基因的非极性突变体NK3631,表型分析发现NK3631合成脂多糖和胞外多糖的能力显著下降,致病力极显著减低,但产生胞外水解酶的能力不变。用带有全长XC3631基因序列的pLAFR3对NK3631进行功能互补,其脂多糖合成、胞外多糖产量和致病力均得到恢复。这一研究表明,XC3631基因与野油菜黄单胞菌脂多糖的核心多糖和胞外多糖的合成有关,并在致病中发挥重要作用。     

转座子诱变甘蓝黑腐病黄单胞菌所获胞外多糖突变体的验证

利用转座子Ｔｎ５ｇｕｓＡ５上的抗性基因,通过“鸟枪法”克隆到用这种转座子诱变甘蓝黑腐病黄单胞菌所获得的三个胞外多糖突变体菌株Ｔ１０６、Ｔ１１３和Ｔ１１７中的转座子及其相邻序列的ＤＮＡ片段,并利用含有这些片段的重组质粒,通过标记置换构建了突变体。通过检测标记置换突变体的胞外多糖产量及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交,证实了胞外多糖突变株Ｔ１０６、Ｔ１１３和Ｔ１１７不仅确系转座子插入所致,而且转座子插入的位点分布在染色体的不同区域。从而证实了我们所报道的诱变体系是可行的     

野油菜黄单胞菌6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的初步分析

野油菜黄单胞菌野油菜变种是发酵工业生产黄原胶的菌种,对该菌8004菌株全基因组序列进行分析,发现基因组中有两个编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因,编号分别为XC1977和XC4082,同源性分析显示这两个基因演绎的氨基酸序列只有36.3%的相似性。为了解这两个基因的功能,采用自杀质粒pK18 mob对XC1977和XC4082分别进行诱变,构建这两个基因的非极性突变体,对突变体表型初步分析,发现XC1977和XC4082分别突变后不影响细胞的生长繁殖,但对胞外多糖产量的影响则不相同,XC1977突变使胞外多糖产量降低56.3%,而XC4082突变基本不影响胞外多糖产量,表明8004菌株的两个zwf基因在细胞中的功能不同,XC1977与细胞的胞外多糖合成产量有关。     

采用两种突变方法对甘蓝黑腐病菌XC_1348基因的功能解析

为研究甘蓝黑腐病菌Xcc8004基因组中一个功能未知的假定蛋白XC_1348的基因功能,本研究用自杀质粒pK18mob和pK18mobSacB分别通过同源单交换和同源双交换构建XC_1348的非极性整合突变体1348nk和有标记的缺失突变体DM1348Gm,并对两种突变体的表型进行检测,结果显示该基因突变后不影响细菌的胞外多糖（EPS）产量、胞外酶活性以及细菌游动性.有趣的是该基因的两种突变体的致病力存在较大差异,原因可能是Xcc经两种方法定点突变后分别具有的不同基因组结构而影响到某些基因的表达所致.通过研究初步了解了XC_1348基因的功能并为今后改进定点突变方法提供现实依据.     

野油菜黄单胞菌分泌组双向电泳样品制备方法的建立

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc）是十字花科植物黑腐病的病原细菌。我们建立了Xcc的蛋白质组学研究平台,用于分离、鉴定该菌的致病相关蛋白。为了减少胞外多糖（exopolysaccharide,EPS）对蛋白材料质量的影响,我们构建了EPS缺陷的Xcc8004ΔgumB突变体。本研究以Xcc8004ΔgumB出发菌株,用诱导培养液培养,取细胞上清通过超滤浓缩得到蛋白质粗提物,分别采用丙酮沉淀法、试剂盒纯化法和丙酮沉淀-试剂盒联用法来纯化蛋白质粗提物,通过比较双向电泳的结果优选最佳的样品制备方法。结果证明丙酮沉淀-试剂盒联用法较为理想,所得双向电泳图片清晰,分辨率高。因此,此方法可以用于制备野油菜黄单胞菌分泌组双向电泳样品,并可以满足进一步研究的需要。