胞嘧啶脱氨酶的原核表达和多克隆抗体的制备

目的：在原核系统中表达并纯化大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase,CD)，制备鼠抗大肠杆菌CD多克隆抗体，方法：亚克隆CD基因到原核表达载体pMAL-c2和pBV222中，并转化入大肠杆菌DH5α内，诱导表达并纯化MBP-CD和6his-CD融合蛋白，用纯化的MBP-CD融合蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。结果：通过重组质粒的酶切筛选出重组阳性克隆，成功地表达和纯化出MBP-CD和6his-CD融合蛋白，用纯化的MBP-CD成功制备了鼠抗CD多克隆抗体，并用6his-CD和GST-CD重组蛋白进行Western印迹分析，证实了抗体的正确性，结论：应用多克隆抗体可以检测体内外CD基因的表达，为临床前和临床上深入开展CD基因的生物治疗研究提供重要的实验材料。     

大鼠ANT1蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体的制备

目的：表达和纯化大鼠腺苷酸转运体（ANT1）蛋白并制备其多克隆抗体.方法：通过PCR扩增大鼠脑组织中ANT1的编码区序列,构建ANT基因重组载pET28a-ANT1,转化至E. coli BL21（DE3）,IPTG诱导表达,Ni2＋-NTA离子交换树脂层析纯化;纯化的ANT1蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并亲和纯化,并通过Western Blot法鉴定其特异性.结果：成功构建重组质粒pET28a-ANT1,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达了Mr约为32×10^3的目的蛋白;亲和层析纯化后免疫的新西兰大白兔获得其多克隆抗体;曝光后胶片上均可见Mr32×10^3的阳性条带,与纯化的大鼠ANT1重组蛋白处于同一水平,表明纯化的抗ANT多克隆抗体具有高度的特异性.结论：利用基因重组技术,在大肠杆菌中成功表达了大鼠ANT1融合蛋白并制备了其多克隆抗体,为研究腺苷酸转运体蛋白在癫痫发病过程中的作用机制奠定了基础.     

TDG蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备

目的:表达纯化胸腺嘧啶糖苷酶(TDG)蛋白并制备TDG多克隆抗体.方法:PCR扩增小鼠TDG(mTDG)的基因片段并插入pET28a(+)原核表达载体,表达并纯化His-mTDG融合蛋白.用纯化的His-mTDG蛋白免疫兔子产生抗血清,进一步亲和纯化抗血清制备抗TDG的多克隆抗体,并检测分析制备的抗体在Western blotting和免疫荧光分析中的应用.结果:在低温(20 ℃)和低IPTG浓度(0.2 mmol·L-1)时,His-mTDG融合蛋白大部分在可溶上清部分,用亲和层析法分离纯化了His-mTDG蛋白,并用纯化的蛋白制备了兔抗TDG抗体,结果显示制备的抗体能够特异性地在免疫分析中使用.结论:本研究纯化了条带单一的并且具有生物学活性的TDG融合蛋白,制备了具有良好特异性的兔抗TDG抗体,为进一步研究TDG的性质、结构和功能奠定了基础.     

亲环素A的原核表达、蛋白纯化及多克隆抗体制备

目的构建人亲环素A(CypA)基因的原核表达载体,诱导表达、纯化蛋白,制备抗体,为进一步研究其生物学作用奠定基础。方法以人肺癌组织总RNA为模板,RT-PCR扩增CypA基因片段,克隆到pMD18-T载体中。扩增产物与原核表达载体pET30a(+)连接,构建表达质粒pET30a-CypA,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用镍树脂亲和层析柱High-Affinity Ni-IDA Resin纯化表达产物,SDS-PAGE检测纯化蛋白。用获得的蛋白免疫大白兔,制备抗CypA蛋白多抗,采用蛋白印迹法检测抗体特异性。结果成功构建了CypA的原核表达载体,经大肠杆菌诱导表达、镍亲和层析柱纯化,得到纯度达80.2%的融合蛋白,免疫大白兔后得到多抗血清。蛋白印迹结果显示此多克隆抗体能与CypA蛋白特异性结合。结论成功获得CypA纯化蛋白及CypA多克隆抗体,为进一步研究CypA在肺癌中的作用机制奠定了基础。     

人sCR1克隆、真核和原核表达纯化及其多克隆抗体制备

的：原核表达人sCR1分子胞外区及其多克隆抗体制备。方法：提取人总RNA进行RT—PCR扩增合成cDNA,以cDNA为模板,构建重组表达质粒pET28a—sCR1。转化大肠杆菌中,用IPTG诱导表达重组人sCR1融合蛋白,将其作为免疫原制备兔多抗。采用ELISA法检测抗体效价,经免疫亲和层析法纯化后,进行SDS—PAGE鉴定分析。结果：在原核细胞巾高效表达人sCR1融合蛋白,经纯化复性后作为免疫原,免疫家兔,获得了高效价及特异性的兔抗人sCR1多克隆抗体,可特异地识别人sCR1蛋白。结论：纯化复性后的sCRI融合蛋白作为抗原免疫家兔,有较好的抗原性和免疫原性,成功地制备出兔抗人sCR1多克隆抗体,为进一步大量表达纯化人sCR1融合蛋白与临床免疫学检测方法的建立,也为深入研究sCR1生物学功能奠定了基础。     

Flt3的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

Flt3(fms-like receptor tyrosine kinases)又称FLK-2(foetal liver kinase2)、STK-1(stem cell tyrosine kinase 1),为Ⅲ型受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases,RTK)成员之一,在血细胞中表达仅限于造血干/祖细胞表面,与其配体在正常造血及免疫系统发育中起重要的调节作用.     

空肠弯曲菌PEB1重组蛋白的免疫原性研究

目的探讨空肠弯曲菌PEB1重组蛋白的免疫原性及对机体的保护作用。方法以不同剂量的含弗氏佐剂的纯化PEB1重组蛋白为疫苗,分别经皮下注射和肌肉注射的方法免疫Balb/C小鼠,ELISA法测定血清中特异性抗体的含量,MTT法测定细胞增殖效应。CJ菌液攻击实验,观察攻击后小鼠的精神状态、病死情况,并做血液、肠道分泌液细菌培养。结果用PEB1重组蛋白免疫Balb/C小鼠,可诱导出高滴度的特异性抗体,能有效地刺激淋巴细胞增殖,加入刺激原的各实验组SI值均较对照组显著增高。结论PEB1重组蛋白免疫接种后可诱导出高滴度特异性抗体和致敏淋巴细胞,能有效保护小鼠免受大剂量空肠弯曲菌的攻击,是一种比较理想的基因工程亚单位疫苗候选抗原。细菌攻击实验结果表明,PEB1基因工程亚单位疫苗能使实验动物产生有效的免疫保护力,明显降低动物的患病率和病死率,并能有效地降低血液和肠道分泌液的细菌含量。     

携带跨膜信号的凋亡蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的构建携带跨膜信号序列的凋亡蛋白（apoptin）的原核表达载体PET-28a（＋）-apoptin,诱导表达并纯化重组apoptin蛋白,制备多克隆抗体。方法用多重PCR的方法扩增跨膜信号序列（PTD）及apoptin的编码序列,构建原核表达载体PET-28a（＋）-PTD-apoptin,转化大肠杆菌BL21（DE3）,低温条件下IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE方法鉴定蛋白表达,经镍亲和层析方法纯化目的蛋白后,免疫BALB／c小鼠,制备多克隆抗体。结果DNA测序鉴定表明成功构建了原核表达载体PET-28a（＋）-PTD-apoptin,该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经低温和IPTG诱导后,获得重组apoptin蛋白,制备的多克隆抗体经ELISA方法和免疫印迹法证实能特异性地识别apoptin。结论成功获得了携带跨膜信号序列的重组蛋白apoptin及其多克隆抗体,为进一步研究其特异性诱导肿瘤细胞凋亡功能及相关机制奠定了基础。     

FAAP的原核表达、纯化与抗体制备

目的 构建pET28a-FAAP-His原核表达载体,表达His-FAAP融合蛋白,制备FAAP蛋白的多克隆抗体.方法 构建pET28a-FAAP-His原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21中并诱导表达His-FAAP融合蛋白,用纯化的FAAP蛋白免疫昆明小白鼠后,制备多克隆抗体,通过Western blotting检验抗血清的特异性和灵敏性.结果 成功构建pET28a-FAAP-His原核表达栽体.在大肠杆菌BL21中经1mM的异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(isopropy-β -D-thiogalactoside,IPTG)37℃诱导4h后,融合蛋白有很高水平的表达.Western blotting结果显示FAAP抗体能够有效地检测人血管内皮脐静脉细胞内FAAP蛋白的表达.结论 成功地对FAAP进行了原核表达、纯化,抗FAAP小鼠的多克隆抗体具有较好的特异性,为进一步研究FAAP的结构与功能奠定了坚实的基础.     

HBV 靶向核糖核酸酶基因的原核表达和纯化及多克隆抗体的制备

目的旨在获得HBV靶向核糖核酸酶,并制备其兔的多克隆抗体. 方法 将构建好的HBV靶向核糖核酸酶基因克隆入原核表达载体pET32a(+),转化入大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导6×His融合蛋白的表达并经Ni2+亲和层析纯化.通过SDS-PAGE 和 Western blot鉴定后,用纯化的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体,并以复性的蛋白作为抗原,用ELISA测定抗体的效价. 结果 成功地纯化和复性了HBV靶向核糖核酸酶,获得了较高效价的抗血清. 结论 获得纯化并复性的HBV靶向核糖核酸酶和多克隆抗体,为进一步研究奠定了基础.     

Mrell多克隆抗体的制备及初步鉴定

目的原核表达人Mrell蛋白,并制备出Mrell蛋白的多克隆抗体,为研究Mrell蛋白功能奠定基础。方法以人cDNA文库为模板,构建出原核表达质粒PET41a—Mrell,然后转化受体茵E-coliBL21,再经IPTG诱导表达,通过采用GST亲和纯化获得GST-融合蛋白,将该融合蛋白免疫免以制备出Mrell多抗血清,最后采用western—blot及免疫荧光等方法检测其在细胞中的特异性。结果在受体茵E-coliBI。21中成功诱导表达出了GST—Mrell融合蛋白,免疫新西兰大白兔后获得了高效价的Mrell蛋白抗血清,IP、western—blot及免疫荧光等多种方法检测证实该抗血清能够特异性识别293T和U20S细胞株中Mrell蛋白,并能够正确清楚检测293T和U20S细胞株中的Mrell表达情况,具有良好的特异性和高效性。结论成功制备出了兔抗人Mrell蛋白的多克隆抗体,为深入研究Mrell蛋白在DNA损伤中的功能奠定了基础。     

转录因子Blimp-1的原核表达、纯化及抗体制备

目的获得B limp-1纯化蛋白,制备多克隆抗体,为研究浆细胞发育的调控奠定基础。方法采用PCR方法从B limp-1质粒中克隆B limp-1编码前350个氨基酸的基因片段,构建B limp-1与6个H is的融合蛋白原核表达质粒,进行原核表达与蛋白纯化后,免疫动物,制备B limp-1多抗。采用ELISA方法检测其效价,W estern检验抗体特异性及在骨髓瘤细胞株中的表达。结果构建了表达B limp-1前350个氨基酸的原核表达质粒PQE-B limp-1,经过大肠杆菌表达、镍亲和层析柱纯化,得到分子量约46×103的融合蛋白,免疫家兔后得到多抗血清。ELISA显示抗体效价达1/20 000。W esternb lot结果显示此多克隆抗体与B limp-1蛋白特异性结合,并在骨髓瘤细胞中表达。结论本研究获得B limp-1纯化蛋白,制备了B limp-1多克隆抗体,为进一步研究B limp-1的作用机制及与血液疾病间的关系奠定了基础。     

Pax6variant新基因的原核表达蛋白纯化和多克隆抗体制备

目的 构建花背蟾蜍(Bufo raddei Strauch)转录因子Pax6 variant的原核表达载体,纯化融合蛋白His-Pax6 variant并以其为抗原免疫家兔,制备花背蟾蜍转录因子Pax6 variant多克隆抗体.方法 RT-PCR扩增得到花背蟾蜍胚胎组织的Pax6 variant基因,并将此片段与原核...     

铁蛋白轻链的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

目的:构建FTL的原核表达载体,获得FTL纯化蛋白,制备抗体,为研究其生物学作用奠定基础.方法:采用基因重组技术将PCR扩增的FTL基因产物与原核表达载体pET30a( )连接,转化入大肠杆菌BL21(DE3),通过PCR、单双酶切及测序鉴定构建结果,用IPTG诱导蛋白表达,将融合蛋白纯化后,免疫日本大白兔,制备FTL多抗,采用Western印迹法检验抗体特异性.结果:成功地构建了FTL的原核表达载体,经大肠杆菌中诱导表达、镍亲和层析柱纯化,得到较纯的相对分子质量约25 800的融合蛋白,免疫日本大白兔后得到多抗血清,Western印迹结果显示此多克隆抗体与FTL蛋白特异性结合.结论:本研究获得FTL纯化蛋白,制备了FTL多克隆抗体,为进一步研究FTL的作用机制及其在肺癌组织中的表达情况奠定了基础.     

BTBD10基因的原核表达和多克隆抗体制备

目的 克隆和表达BTBD10基因,为进一步研究BTBD 10与胰岛细胞增殖功能提供工具.方法 制备兔抗BTBD10多克隆抗体,利用PCR方法扩增BTBD10全长,经Bam H I和Sal I酶切后连接入pET32a原核表达载体,将重组表达质粒pET32a-BTBD 10转化大肠杆菌ROSSET,经IPTG诱导表达蛋白,并以亲和层析的方法进行纯化,以纯化的BTBD10蛋白免疫新两兰大白兔,制备兔抗BTBD10的多克隆抗体,利用Western blot方法分析鉴定.结果 经双酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的BTBD10读码框.SDS-PAGE电泳分析显示IPTG诱导后表达约85kU的融合蛋白,与预期结果相符.将纯化的融合蛋白免疫家兔,获得兔抗BTBD10多克隆抗体血清,Western blot结果显示该抗体特异性好,效价高,目的条带位于56kU处.结论 成功构建人BTBD10原核表达载体,并获得了高纯度BTBD10重组蛋白及兔抗BTBD10多克隆抗体.     

大鼠神经球蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的 克隆Wistar大鼠神经球蛋白(NGB)基因,通过原核表达制备其多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础.方法 从雄性Wistar大鼠脑组织中提取总RNA,经逆转录PCR得到cDNA,测序证明该基因序列正确后,亚克隆人pET-28a( )载体中,通过双酶切和测序确定序列和阅读框正确.转化大肠杆菌BL21菌株,获得可溶性表达产物,经鉴定、纯化后免疫新西兰兔,分离血清,ELISA法测定抗体效价.结果 神经球蛋白多克隆抗体效价达1:100 000,此多抗可以与293细胞内表达的重组蛋白发生很好的抗原抗体反应.结论 成功制备了兔抗NGB的多抗,为后续研究提供了重要的实验材料.