人γ－干扰素生产工艺的研究

采用高密度发酵法发酵重组人γ干扰素产生菌ＳＷＩＮＦ／ＤＨ５α并成功地获得高表达、高产量的菌体,表达的γ干扰素蛋白占菌体总蛋白的６０％以上,２０Ｌ发酵液可收获２ｋｇ（湿重）菌体。纯化过程中采用尿素抽提、稀释、复性、浓缩后通过ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ２００柱的纯化方法,简化了纯化步骤,缩短周期,提高了蛋白回收率。纯化中未采用单抗亲和层析技术,使产品更为安全可靠。最终产品经ＳＤＳＰＡＧＥ检测纯度达１００％,核酸含量和热原均合格,Ａ２８０／Ａ２６０＞１５,比活性达１×１０７ＩＵ／ｍｇ,总回收率达４０％。这说明整个工艺适宜大规模生产的需要,具有实际应用价值。     

中国人γ－干扰素cDNA在大肠杆菌中的高效表达

应用RT-PCR技术从中国人淋巴细胞mRNA反转录产物中克隆了IFN-γcDNA,序列分析证实了分子进化规律对IFN-γcDNA序列存在多态性的推论.在此基础上应用DNA重组技术,将去信号肽中国人IFN-γcDNA克隆到原核表达质粒pBV220 P_RP_L启动子下游,转化大肠杆菌DH5α,通过温度诱导表达,成功地在大肠杆菌中稳定、高效地表达了中国人IFN-γcDNA,其表达水平占全菌可溶性总蛋白的44.4%,初步复性后生物学活性测定结果表明γ-IFN表达量为0.45×10⁷～2.34×10⁷单位/L.     

人γ干扰素/β肿瘤坏死因子重组杂合蛋白对γ干扰素抗性细胞株的杀伤效应

已有大量研究资料表明,γ干扰素(Interferon γ,IFNγ)、淋巴毒素(Lymphotoxin,LT,又称TNFβ)或肿瘤坏死因子(TNFα),均有杀伤肿瘤细胞的细胞毒效应,并对其作用机理进行了广泛的研究。与此同时还对晚期肿瘤患者进行了临床治疗的探索,也取得了可喜的进展。但有些肿瘤细胞对这两种淋巴因子有天然的或逐渐获得的抗性现象,而且这两者在临床用有效抗癌剂量时,又可出现不同程度的副作用。为此有人用IFN和TNF联合处理肿瘤细胞,发现它们具有协同抗癌效应,这就为低剂量治疗肿瘤以减轻副作用提供了理论依据。据此,Feng等于1988年将人IFNγ和人TNFβ两个cDNA片段连接为融合基     

人重组γ-干扰素对兔妊娠的影响

ao et al. (1999) reported that human recombinet interferon gamma (hrIFN γ) exerted a certain anti contraceptive effect on the pregnant rabbit. In order to investigate the possible mechanisms by which interferon gamma (IFN γ) exerts its deleterious effect on pregnancy, 12 New Zealand breed rabbits were used as an animal model. One day (Day 1) after the females were mated with male animals, They were randomly divided into 3 groups. There were control, hrIFN γ 50 000 IU and hrIFN γ 100 000 IU groups. Saline and hrIFN γ of different doses were administered respectively to control and experimental rabbits via vaginal muscular injection on Day 6 and were killed on Day 12 of pregnancy. The fetus and placenta were weighed. The blood was collected before injection and at various intervals(6, 12, 24, 48 and 96 h) after injection. The concentration of serum progesterone were measured by radioimmunoassay. The apoptosis in placenta were examined by DNA fragmentation analysis. The results were as folloows: 1) In control, 50 000 IU and 100 000 IU hrIFN γ groups, progesterone level in serum were 26 20±0 74 ng/ml,17 81±0 55 ng/ml and 10 97±0 84 ng/ml respectively at 96 h after injection. In contrast with control group, progesterone production dropped significantly in rabbits treated with hrIFN γ, especially 100 000 IU hrIFN γ. 2) Apoptotic fragmentation of DNA(180 bp units) in placenta were detected both in control and experimental groups. The scan density of degraded DNA fragmentation in experimental group was higher than that in control, which suggested that apoptosis in placenta was further induced by hrIFN γ, especially by high dose hrIFN γ. In addition, the weight of placenta in rabbits treated with hrIFN γ reduced significantly as compared with that in control group( P <0 01). We suggest that hrIFN γ inhibits the secretion of progesterone, as a result of inducing apoptosis in placenta.     

人γ干扰素的结构特征

<正> γ干扰素(IFN-γ)是人体三种主要的干扰素之一,现已表明其具有抗增殖、免疫调节和抗病毒等广泛的生物学活性。在理化性质方面,IFN-γ不同于α干扰素(1FN-α)和β干扰素(1FN-β)。由互补DNA(cDNA)推断1FN-γ,为146个氨基酸的多肽链。天然IFN-γ的纯化与结构分析表明有两种主要的活性分子,其分子量分别为25KDa和20KDa,两者的氨基酸序列完全相同,均     

人γ型基因工程干扰素中残余DNA的检测

采用地高辛标记探针,以核酸杂交法检测人γ型基因工程干扰素(IFN-γ)制品中残余DNA含量,结果表明,自制的二组DNA标准品相应量间显示的色斑相差悬殊,提示高蛋白含量对痕量残余DNA的检测干扰较大,添加IFN-γ的DNA标准品比纯DNA标准品更合理,以此测得各样品均符合WHO要求(<100pg/剂量),方法敏感性为4pg.     

重组干扰素γ的中间试制

用带有表达质粒ＰＢＶ２２０（含有γ干扰素基因）的大肠杆菌ＤＨ５α株进行发酵培养,３批中试的菌产量平均为１４．１克／Ｌ,γ干扰素的表达量平均为１．０２±１０＾９ＩＵ／Ｌ,收集的菌体经高压匀质破菌后收集包涵体,用７ｍｏｌ／Ｌ盐酸胍提取干扰素,此过程中去除７８．４％菌体蛋白,而干扰素活性仅损失１０．４１％,粗制干扰素经复性可使干扰素活性提高４０５％,比活也有明显提高,３批平均为１．７６×１０＾７ＩＵ／ｍ     

重组人r干扰素的纯化及其N端氨基酸序列分析

本文对两个重组人γ干扰素高效表达株pIFN-γ及PBVIFN-γ的表达产物进行了纯化并对纯化的γ干扰素进行了活性鉴定及N端氨基酸序列分析。采用连续沉淀的方法对高表达菌株pBVIFN-γ及低表达菌株pIFN-γ,裂解液进行初步纯化,然后应用单克隆抗体亲和层析方法进行纯化,分别可纯化14倍与933倍,均达电泳纯,回收率分别为25％和30％,比活性达7.56×10~7U/mg蛋白。SDS-PAGE电泳上γ干扰素分子量约17.5kD。测定了纯化的γ干扰素N末端19个氨基酸序列,与由其DNA序列推导的氨基酸序列完全一致,确认了本研究所表达、纯化的γ干扰素达到了较高纯度。本方法为γ干扰素的批量生产奠定了基础。     

重组人干扰素α2b的提取和纯化

为了提高重组人干扰素α2b的质量 ,增加产量 ,降低成本 ,通过破菌 ,包涵体提取 ,离子交换层析 ,凝胶过滤等纯化方法制备干扰素纯品。结果表明干扰素纯度可达 95%以上 ,比活达到 1.2× 10 8IU/mg以上。结果提示 ,采用本方法收率高 ,纯度好 ,工艺稳定 ,适合大规模生产     

γ－亚麻酸发酵条件研究

本文对γ－亚麻酸发酵的碳源、氮源、ｐＨ值、菌体得率、油脂含量、γ－亚麻酸含量等进行了考察,并通过均匀设计,得到了该菌株发酵生产γ－亚麻酸的优化配方,用优化配方发酵结果表明,菌体得率、γ－亚麻酸含量均有显著的提高。     

小分子伴侣协助重组人γ-干扰素体外复性研究

考察了小分子伴侣在游离和固定化两种情况下,对重组人γ-干扰素（rhIFN-γ）体外重折叠复性的作用.实验结果表明,小分子伴侣GroEL191～345的加入有效地促进了rhIFN-γ的复性,在初始蛋白质浓度为100 mg/L时,rhIFN-γ复性后蛋白质回收率提高了2.2倍,总活性提高了近3倍;将小分子伴侣固定化在NHS-activated Sepharose Fast Flow凝胶后,不但能重复利用,而且进一步提高了rhIFN-γ复性效率,在初始蛋白质浓度为400 mg/L 时,仍使蛋白质回收率达到46.29%和比活达到1.95×10⁷ U/mg.     

蛋白质定点PEG化研究：97Cys－IFH－γ的巯基专—PEG修饰

蛋白质定点ＰＥＧ化研究：９７Ｃｙｓ－ＩＦＨ－γ的巯基专—ＰＥＧ修饰唐微,常远,徐　飞,郑仲承,刘新垣（中国科学院上海生物化学研究所,２０００３１）关键词人干扰素－γ;定点修饰;半胱氨酸目前进行的ＰＥＧ化反应,多是针对蛋白质肽链上自由末端氨基进行的,由...     

重组人干扰素—β的中试研究

从大肠杆菌中大规模纯化新型干扰素β(IFN-βser17).首先建立IFN-βser17发酵和纯化工艺,连续大量纯化三批,并对纯化终产品进行全面鉴定.建立了稳定的发酵和纯化工艺流程,中试三批菌产量平均为4.33g/L,IFNβser17的表达量平均为20%,经破碎、粗提、精制后IFN-βser17的比活达2×107IU/mg以上,纯度超过96%,其他检定项目也均符合规程要求.     

蛋氨酸脑啡肽（MEK）联合干扰素γ抗肿瘤作用研究

观察蛋氨酸脑啡肽（MEK）和注射用重组人干扰素γ（IFN-γ）单独和联合应用的抗肿瘤效应。应用动物移植性肿瘤的体内试验法,分别观察MEK、IFN-γ和MEK＋IFN-γ对肿瘤的抑瘤作用及小鼠生命延长率情况。结果显示,MEK组、IFN-γ组和MEK＋IFN-γ组的抑瘤作用分别为129．11％（P〈0．001）、78．11％（P〈0．001）、231．10％（P〈0．001）,均有显著差异;生命延长率MEK组20．28％（P〈0．001）有显著差异,IFN-γ组13．50％（P〉0．001）无显著差异,MEK＋IFN-γ组41．25％（P〈0.001）有显著差异。可见,MEK、IFN-γ和MEK＋IFN-γ都对小鼠移植性瘤有一定的抑制作用,MEK和MEK＋IFN-γ能够延长小鼠生命,而IFN-γ单独应用不能延长小鼠生命。MEK和IFN-γ联合应用时作用相加。而不良反应未相加。     

重组人干扰素βser17工程菌发酵培养条件的优化研究

实验对重组人干扰素βser17(rhIFNβser17)工程菌的发酵培养条件进行了研究,通过实验优化确定了适宜rhIFNβser17表达的培养基、诱导剂使用浓度、诱导时期和诱导后的收获时间等,建立了发酵培养工艺,并在50L发酵罐进行了中试发酵,菌体收获量湿重达13.08g/L,rhIFNβser17表达量占菌体总蛋白的20.2%,纯化后比活性达2×107IU/mg蛋白以上,为进一步的下游开发奠定了基础。     

注射用重组人干扰素βser17的分离纯化及鉴定

重组人干扰素βser17(rhIFN βser17)工程菌经发酵培养后,采用高压匀浆破菌、离心分离包涵体、有机抽提、酸沉淀、SephacrylS -200、SephadexG -75等进行分离纯化,通过各种方法对终产品进行鉴定。结果显示,纯化的rhIFN- βser17比活性超过 2×107IU/mg,纯度超过 99%,其它各项质量指标均符合质量标准。通过研究建立了大规模制备rhIFN- βser17的纯化工艺,研制出了符合规程要求的注射用rhIFN -βser17纯品,为临床研究奠定了基础。     

抗人α2a型基因工程干扰素单克隆抗体及亲和层析柱的研制

应用鼠－鼠杂交瘤细胞技术建立了三系稳定分泌抗重组人α２ａ型干扰素（ｒＨｕ－ＩＦＮ－α２ａ）单克隆抗体细胞系１Ａ５、１Ｂ５和２７Ａ７。细胞连续传代和在液氮中冻存后复苏,分泌抗体能力不变,并且维持在较高水平,细胞培养上清效价１∶２５６～１∶４０９６,腹水１∶２６×１０５～１∶２７×１０８。Ｉｇ亚类测定,１Ａ５和１Ｂ５ＭｃＡｂ为ＩｇＧ１,２７Ａ７为ＩｇＧ２ａ。三系ＭｃＡｂ均识别ｒＨｕ－ＩＦＮ－α２ａ和－α２ｂ,与ｒＨｕ－ＩＦＮ－α１和正常大肠菌体裂解液无反应。竞争ＥＬＩＳＡ试验,三系ＭｃＡｂ分别针对ｒＨｕ－ＩＦＮ－α２ａ上三个不同表位。同ＭｃＡｂ建立双抗体夹心ＥＬＩＳＡ对ｒＨｕ－ＩＦＮ－α２ａ和－α２ｂ均可检测到１５０ｐｇ／ｍｌ,约１０ＩＵ／ｍｌ的敏感度。用提纯的单抗制备亲和层析柱,单抗偶联率９５％以上。三系单抗亲和层析柱均可将粗制ｒＨｕ－ＩＦＮ－α２ａ提纯到９７％以上纯度。平均回收率为：１Ａ５单抗柱９０２％,１Ｂ５单抗柱９５３％,２７Ａ７单抗柱９４７％。比活性平均值依次为１９４×１０８ＩＵ／ｍｇ,１９７×１０８ＩＵ／ｍｇ和１６４×１０８ＩＵ／ｍｇ,残余鼠ＩｇＧ量均符合规程要求。纯化ｒＨｕ－ＩＦＮ?     

猪γ干扰素基因的克隆、表达及其纯化

以RT-PCR方法,从经丝裂原诱导的猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增出编码猪IFNγ的基因。经测序证实后插入载体pJLA503,并实现在大肠杆菌中的高表达。表达产物以包涵体形式存在,经7mol/L盐酸胍变性及精氨酸存在的情况下复性。再经DEAE-Sepharose离子交换柱、Sephdex-200凝胶过滤柱分离获得电泳单一纯猪IFN-γ蛋白,细胞病变抑制实验检测纯化产物有干扰素活性。