WO-1生物衍生组织工程骨支架材料的制备及性能研究

目的制备WO-1胶原生物衍生骨复合支架材料,检测其理化性质及力学强度,为骨组织工程研究和应用提供可选择的支架材料。方法将同种异体骨、I型胶原、WO-1进行系列理化处理,制成单纯生物衍生骨材料、胶原生物衍生骨复合材料及WO-1胶原生物衍生骨复合材料。制备后的材料行大体及扫描电镜观察其形貌特征,X线衍射分析材料成分,并对材料的力学性能进行分析测定。结果单纯生物衍生骨材料具有天然骨的网状孔隙系统;胶原生物衍生骨复合材料具有天然骨的网状孔隙系统,微孔表面覆盖胶原膜;WO-1胶原生物衍生组织工程骨复合支架材料具有骨组织的天然网状孔隙系统,微孔表面可见胶原膜覆盖。3种材料的孔径依次为90～700μm、75～600μm、80～600μm;孔隙率依次为87.96%、80.47%、84.29%,差异无统计学意义(P>0.05);其主要成分为羟基磷灰石,弯曲强度和压缩强度无统计学意义(P>0.05)。结论WO-1胶原生物衍生骨复合材料与其它两种材料相同,可作为一种有效的天然组织工程骨支架材料。     

明胶/纳米羟基磷灰石三维多孔骨支架的制备及其生物安全性评价

[目的]探讨冷冻干燥法制备明胶/纳米羟基磷灰石(nano-hydroxyapatite,nHA)三维多孔支架的可行性并评价材料的生物安全性。[方法]取明胶水溶液,将其分别与10 wt%、20 wt%、30 wt%的nHA混合,交联后采用冷冻干燥法制备明胶/nHA三维多孔支架。评价材料的理化性质,通过测定支架孔径、孔隙率、吸水率、抗压强度及降解pH值优化制备条件;MTT法分析支架浸提液毒性;共培养观察细胞在材料表面及周围生长情况;材料埋入背部肌肉内,组织学染色观察评价其生物安全性。[结果]体视显微镜及电镜显示,制备的支架均呈三维多孔隙结构。随着nHA含量的增加,材料成孔效果变差,孔径、孔隙率、吸水率变小,而抗压强度增加。其中以nHA含量为20 wt%的材料表现更为适宜,并选其进行生物相容性实验。MTT法显示不同浓度支架浸提液与对照DMEM培养液吸光度值比较,差异无统计学意义(P>0.05)。细胞与材料共培养生长状态良好。HE染色观察材料与周围肌肉组织无排斥反应,组织相容性良好。[结论]制备的明胶/nHA支架材料具有三维孔隙结构,具备合适的孔径和孔隙率,无毒,生物相容性良好,可作为骨组织工程支架使用。     

缓释PDGF-BB的纳米珍珠层/聚乳酸/纤维蛋白胶复合支架的制备

[目的]探讨缓释血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)的纳米珍珠层/聚乳酸/纤维蛋白胶复合支架的制备方法及其性能.[方法]采用溶剂浇铸-粒子沥滤法制备聚乳酸支架(S1)和纳米珍珠层/聚乳酸支架(S2),接着将PDGF-BB与纤维蛋白胶混合注入S2,冷冻干燥后制成缓释PDGF-BB的纳米珍珠层/聚乳酸/纤维蛋白胶复合支架(S3).3种支架通过万能测试机测试抗压强度、扫描电子显微镜观察表面形貌以及阿基米德法测定孔隙率;利用ELISA法检测S3降解过程中PDGF-BB释放量.[结果]3种支架材料均具有良好的三维多孔结构,孔径分别为(330.0 ±55.6)μm、(322.5±50.8)μm和(303.3±47.0)μm,差异无统计学意义(P>0.05);孔隙率分别为81.0%±1.1%、82.5%±0.8%和80.2%±0.7%,差异无统计学意义(P>0.05);抗压强度分别为(3.6 ±0.12)MPa、(5.0±0.35)MPa和(5.1 ±0.26)MPa,S1与S2和S3有显著性差异(P<0.01).ELISA实验结果表明支架中复合的PDGF-BB释放长达30 d,呈持续缓慢释放.[结论]缓释PDGF-BB的纳米珍珠层/聚乳酸/纤维蛋白胶复合支架为三维多孔结构,具有较好的力学性能,持续缓慢释放PDGF-BB,有望成为一种理想的骨组织工程支架材料.     

基于磁共振图像构建髌股关节三维有限元模型

[目的]探讨基于活体髌股关节磁共振图像应用逆向工程准确构建髌股关节三维有限元模型的方法.[方法]采集1例健康青年男性志愿者膝关节磁共振图像,应用Mimics软件提取髌股关节轮廓曲线,再经AutoCAD软件及SolidWorks软件对曲面进行反求拟合、修整装配,生成了表面光滑的髌股关节骨软骨三维实体模型,并应用ABAQUS软件定义各部件材料力学属性、网格划分后,进行髌股关节应力分析.[结果]本研究成功建立了包括髌骨骨、软骨,股骨骨、软骨的三维有限元模型并进行应力分析,分析结果与既往研究方法结果相似.[结论]基于MRI数据可精确构建髌股关节三维实体模型,该模型可用于该关节的三维有限元应力分析,为深入对其进行生物力学研究提供技术支撑.     

交联温度对京尼平交联壳聚糖/藻酸盐组织工程支架的影响

[目的]通过对壳聚糖/藻酸盐复合支架材料表面结构、降解率、细胞毒性、孔隙率、含水量以及生物力学性能变化的研究,探究交联温度对京尼平交联壳聚糖/藻酸盐组织工程支架的影响.[方法]运用冷冻干燥法制备壳聚糖/藻酸盐支架材料,分别在4℃、25℃、37℃条件,于0.5％京尼平溶液中交联24 h,作为实验组.以未用京尼平交联的支架材料作为对照组,评价支架材料降解率、细胞毒性、孔隙率、含水量以及生物力学性能的特点.[结果](1)伴随交联温度升高,支架材料的颜色从浅紫色变为紫黑色,未交联的支架材料为白色;(2)降解率4周后在4℃为21.54％±3.07％、25℃组为9.9％±1.2％、37℃组为8.98％±0.79％.其中,37℃和25℃组抗降解能力优于4℃组(P＜0.05).各实验组均优于对照组(P＜0.01);(3)弹性模量在4℃组为0.84±0.55,25℃组为1.44±0.06,37℃组为1.53±0.02,对照组为0.79±0.16.对照组与25℃组及37℃组之间差异有统计学 意义(P＜0.05);(4)孔隙率、含水量、细胞毒性各实验组间未见明显差异.[结论]随着交联温度的提高,支架材料的抗降解能力、抗拉伸性能增加,且对支架材料的结构、细胞毒性、孔隙率以及含水量无明显影响.     

仿生矿化对PLGA支架材料孔隙率及生物力学性能的影响

目的通过聚乳酸-羟基乙酸(polylactide-co-glycolide,PLGA)的仿生矿化,对材料表面改性,检测矿化物组成,评价矿化对多孔材料孔隙率和生物力学性能的影响。方法PLGA经水解处理后在模拟体液(simulatedbodyfluid,SBF)中仿生矿化,应用扫描电镜、X射线衍射仪和红外光谱仪行矿化物形貌物相分析,比重法测量矿化前后材料孔隙率的变化,津岛生物力学测试仪测试材料矿化前后抗压强度的变化。结果PLGA在SBF中矿化后,表面可以形成明显的矿化层;矿化物主要成分为磷灰石,含有碳酸根成分,类似于人骨无机质。仿生矿化前后多孔PLGA孔隙率及生物力学性能无明显改变(P>0.05)。结论仿生矿化对三维多孔PLGA支架材料的孔隙表征和生物力学性能无影响,是表面改性的可行方法。     

纳米珍珠层粉的降解实验及其复合人工骨的生物相容性研究

[目的]研究纳米珍珠层粉的体内降解情况,及其所制得的复合人工骨的生物相容性.[方法]机械研磨法制得的纳米珍珠层粉及其与消旋聚乳酸复合制得的人工骨,分别植入大鼠股骨骨洞及股部肌囊,同时与微米珍珠层粉及其人工骨作对照,并建立空白对照.于术后当天及第2、4、8周分别作X线片检查,动物处死前予四环素注射活体荧光标记,处死后行大体、组织学及扫描电镜观察.[结果]各检查结果显示纳米组较微米组降解更快,骨缺损愈合也最快;2种材料制得的复合人工骨均与周围组织结合良好.[结论]纳米珍珠层粉在动物体内的降解速度较微米级的快,可促进新生骨的生长;纳米珍珠层人工骨生物相容性好,是更好的生物活性可降解材料.     

三维多孔复合人工骨的制备及性能检测

[目的]研制新型三维多孔复合人工骨材料并评价其相关性能.[方法]将海洋贝壳牡蛎粉、消旋聚乳酸按一定比例复合,采用热致相分离法制备多孔复合人工骨(CAB)材料,检测其孔隙率、孔径、生物力学强度;并将CAB和纯PLLA薄片浸泡于37℃平衡液中,观测不同时间点CAB和纯PLLA体外降解变化参数,对其结果进行统计学比较.[结果]研制的CAB材料平均孔隙率为85.1%;电镜下孔径测量大小为100～300 μm,孔隙之间的连通较好,孔隙形态、取向规则有序;压缩强度为2.12 MPa;在观测周期内,随着浸泡时间的延长,CAB和纯PLLA的质量损失率、浸泡液pH值呈现出规律性变化,两组各时期的各项指标比较具有显著性差异(P﹤0.05). [结论] 该法制得的CAB材料的孔隙率、孔径、生物力学强度、体外降解性能表明能满足骨替代材料的要求.     

Ⅰ型胶原海绵/血管内皮生长因子缓释系统的初步构建

[目的]研制Ⅰ型胶原(collagen type Ⅰ,CI)海绵/血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)缓释生物支架材料,了解该种材料中的VEGF体外缓释效果.为骨肌腱组织工程寻求一种新型复合支架材料.[方法]从CI海绵自身的力学、孔径、紫外最大吸收光谱、孔隙率、含水率、傅立叶红外光谱及与VEGF的组织相容性等方面研究VEGF胶原缓释系统支架材料的特性,利用生物学方法将VEGF负载于CI,制备具有VEGF缓释效果的复合支架.[结果]CI海绵能够成功的将VEGF包裹起来,可以达到明显的缓释作用,与VEGF有良好的组织相容性.[结论] CI海绵有理想的孔径和合理的生物力学及与VEGF良好的生物学相容性结构性质,VEGF可以从CI - VEGF缓释材料中缓慢释放,有明显的缓释效果,是一种具有良好材料特性的组织工程材料.     

聚乙烯醇/壳聚糖复合纳米纤维支架构建及降解行为研究

目的 制备能够模拟皮肤ECM生理结构的聚乙烯醇(PVA)/壳聚糖复合纳米纤维支架,并研究其体内外降解行为。 方法 (1)利用静电纺丝技术分别构建PVA纳米纤维支架和PVA/壳聚糖复合纳米纤维支架,采用戊二醛蒸气法对2种支架样本分别进行交联,于扫描电镜下观察2种支架的形貌。(2)体外降解实验：分别裁取2种支架样本(2 cm ×2 cm)置于PBS中,37.0℃水浴温育3、7、14 d取出,干燥,真空条件下喷金后于扫描电镜下观察支架形貌变化。(3)体内降解实验：将48只Wistar大鼠按随机数字表法分为2组,其一为PVA组,大鼠脊柱两侧对称区域（4处）皮下埋植PVA纳米纤维支架;另一为PVA/壳聚糖组,大鼠脊柱两侧对称区域（4处）皮下埋植PVA/壳聚糖复合纳米纤维支架。每组24只大鼠。术后3、7、14、28 d,分别取各组6只大鼠埋植样本,HE染色行组织形态学观察。 结果 (1)交联后PVA纳米纤维支架和PVA/壳聚糖复合纳米纤维支架的纤维表面光滑,纤维直径分布均匀(200 ～300 nm),具有较高的孔隙率。(2)体外降解实验结果显示：温育3、7、14 d,PVA纳米纤维支架的纤维分别呈现溶胀、溶解、融合的形貌变化;而PVA/壳聚糖复合纳米纤维支架的纤维则分别呈现溶胀、溶解断裂、消失的形貌变化。(3)体内降解实验结果显示：术后3、7、14、28 d,2组纤维支架结构均分别呈现松散、边界不清、大部分被降解及最终消失的形貌学变化。 结论 采用静电纺丝技术可成功制备PVA/壳聚糖复合纳米纤维支架,交联后的该支架具有与组织重构相适宜的降解行为。     

Biological Advantages of Porous Hydroxyapatite Scaffold Made by Solid Freeform Fabrication for Bone Tissue Regeneration

Presently, commercially available porous bone substitutes are manufactured by the sacrificial template method, direct foaming method, and polymer replication method (PRM). However, current manufacturing methods provide only the simplest form of the bone scaffold and cannot easily control pore size. Recent developments in medical imaging technology, computer‐aided design, and solid freeform fabrication (SFF), have made it possible to accurately produce porous synthetic bone scaffolds to fit the defected bone shape. Porous scaffolds were fabricated by SFF and PRM for a comparison of physical and mechanical properties of scaffold. The suggested three‐dimensional model has interconnected cubic pores of 500 μm and its calculated porosity is 25%. Whereas hydroxyapatite scaffolds fabricated by SFF had connective macropores, those by PRM formed a closed pore external surface with internally interconnected pores. SFF was supposed to be a proper method for fabricating an interconnected macroporous network. Biocompatibility was confirmed by testing the cytotoxicity, hemolysis, irritation, sensitization, and implantation. In summary, the aim was to verify the safety and efficacy of the scaffolds by biomechanical and biological tests with the hope that this research could promote the feasibility of using the scaffolds as a bone substitute.     

无机活性元素骨组织工程支架材料的细胞亲和性

目的 评价作为骨修复材料的无机活性元素骨组织工程支架材料的细胞亲和性。方法 测试无机活性元素骨组织工程支架材料的比表面积、孔径分布、孔隙率、吸水率。将体外培养扩增并经过流式细胞仪鉴定的人骨髓间充质干细胞（MSCs）与无机活性元素骨组织工程支架材料复合培养,以单纯接种培养MSCs为对照组,噻唑蓝（MTT）法检测材料对细胞增殖的影响,扫描电镜观察材料表面细胞生长状况。结果 无机活性元素骨组织工程支架材料比表面积为210m^2／g,平均微孔直径为6nm,孔隙率90％,有34％的吸水率。MIT法显示培养至第7天时材料组细胞增殖与对照组有显著性差异（P〈0．05）,扫描电镜下见材料表面细胞生长状况良好。结论 无机活性元素骨组织工程支架材料具有良好的细胞亲和性,是一种较为合适的极具潜力的骨修复材料。     

Preparation and evaluation of a biomimetic scaffold with porosity gradients in vitro

A novel biodegradable scaffold based on mimetic a natural bone tissue morphology with a porosity gradient structure was prepared in this paper. The result of surface morphology indicated that a graded porous structure was formed in the fabricated scaffold, where the dense layer (0%) was connected with the most porous layer (60%) by a middling porous layer (30%). To evaluate the degradability, graded porous scaffolds compared with homogeneous scaffolds were placed into a Tris-HCl buffer solution (pH = 7.4) for 28 days. It was found that both scaffolds presented the same degradation trend, and the graded porous structure did not change the original degradability of the scaffold. Moreover, the compressive strength of the graded porous scaffold was better than that of conventional homogeneous scaffold with the increase of degradation time, and the graded porous structure can enhanced the mechanical property of the scaffold. These findings suggest that this biodegradable and porosity-graded scaffold may be a new promising scaffold for loaded bone implant.     

骨髓间充质细胞与速固化磷酸钙支架共培养的实验研究

[目的]观察人骨髓间充质干细胞在速固化磷酸钙骨水泥支架中的增殖和生长情况。[方法]将速固化壳聚糖-磷酸钙骨水泥支架材料预先成形。采用全骨髓法分离人骨髓间充质细胞并在体外对细胞进行培养和扩增。72h首次换液,细胞融合80%传代,取第3代细胞用于实验。将细胞与磷酸钙骨水泥支架复合培养,分别利用四甲基偶氮唑蓝MTT法及扫描电镜等检测细胞在材料中的增殖和生长情况。[结果]用酶标仪检测OD值提示共培养后,支架内的细胞数量逐渐增加。扫描电镜结果显示支架材料内部为多孔结构,孔内见有细胞生长,细胞表面可见分泌颗粒。[结论]速固化壳聚糖-磷酸钙骨水泥对人骨髓间充质干细胞有较好的细胞相容性,细胞可在材料内黏附和增殖,是理想的骨组织工程支架材料。     

胶原/羟基磷灰石骨软骨一体化支架的生物学特性研究

[目的]对体外条件下胶原/羟基磷灰石一体化复合材料的生物学特性进行评价,探讨其作为骨软骨组织工程支架的可行性。[方法]以胶原和羟基磷灰石为原料,研制出由胶原逐层过渡到羟基磷灰石为主的一体化支架材料,其软骨层主要成分为胶原,骨层主要成分为羟基磷灰石。通过扫描电镜观察材料内部结构及孔径大小,液体位移法测定材料的孔隙率。将材料与兔骨髓基质细胞复合培养,MTT法测定细胞的生长曲线,扫描电镜观察细胞在材料上的生长粘附情况。[结果]胶原/羟基磷灰石一体化复合支架具有疏松多孔结构,其中软骨层孔径大小(90±15)μm,骨层孔径大小(120±20)μm,孔隙率(75±5.0)%。细胞在材料上生长良好。[结论]胶原/羟基磷灰石一体化复合材料具有适宜的孔隙结构和良好的生物相容性,可用作骨软骨组织工程支架材料。     

可控微结构EBM钛合金支架与成骨细胞的体外三维复合培养

[目的]探讨可控微结构EBM钛合金支架作为成骨细胞体外培养载体的可行性,并观察载体类蜂巢状孔结构在成骨细胞培养中的作用.[方法]应用直接金属快速成形技术一电子束熔化成形(electron beam melting,EBM)过程直接构建和制备可控性微结构钛合金支架.分离培养1 d龄胎兔颅骨成骨细胞,以兔颅骨源性成骨细胞复合支架作为实验组,以单独培养的兔颅骨源性成骨细胞作为对照组.将成骨细胞与支架复合培养1、7、14 d后,进行倒置相差显微镜、扫描电镜及组织切片染色观察细胞与材料复合情况,以MTT比色法及碱性磷酸酶的定量检测研究材料结构对细胞增殖、分化的影响.[结果]成骨细胞/支架复合培养7d后,大量细胞通过伸出多个伪足粘附在支架表面以及孔周围并与支架牢固结合;培养14 d后支架表面及孔隙内有大量细胞分布,细胞伸出数个突起沿着孔隙壁逐渐向孔隙内延伸、汇集.支架上的细胞增殖、分化以及转移明显增加,与对照组比较有明显统计学差异(P<0.05).[结论]EBM钛合金支架有利于细胞的贴附、生长及增殖,并对细胞的功能无不良的影响.支架类蜂巢状孔结构能够调节成骨细胞在支架内的分布.     

Repair of osteochondral defects with hyaluronan- and polyester-based scaffolds

OBJECTIVE: The natural repair of osteochondral defects can be enhanced with biocompatible, biodegradable materials that support the repair process. It is our hypothesis that hyaluronan-based scaffolds are superior to synthetic scaffolds because they provide biological cues. We tested this thesis by comparing two hyaluronan-based scaffolds [auto cross-linked polysaccharide polymer (ACP) and HYAFF-11] to polyester-based scaffolds [poly(DL-lactic-co-glycolic acid) (PLGA) and poly(L-lactic acid) (PLLA)] with similar pore size, porosity and degradation times. DESIGN: Fifty-four rabbits received bilateral osteochondral defects. One defect received a hyaluronan-based scaffold and the contralateral defect received the corresponding polyester-based scaffold. Rabbits were euthanized 4, 12 and 20 weeks after surgery and the condyles dissected and processed for histology. RESULTS: Only ACP-treated defects presented bone at the base of the defect at 4 weeks. At 12 weeks, only defects treated with rapidly dissolving implants (ACP and PLGA) presented bone reconstitution consistently, while bone was present in only one third of those treated with slowly dissolving scaffolds (HYAFF-11 and PLLA). After 20 weeks, the articular surface of PLGA-treated defects presented fibrillation more frequently than in ACP-treated defects. The surface of defects treated with slowly dissolving scaffolds presented more cracks and fissures. CONCLUSIONS: The degradation rate of the scaffolds is critical for the repair process. Slowly dissolving scaffolds sustain thicker cartilage at the surface but, it frequently presents cracks and discontinuities. These scaffolds also delay bone formation at the base of the defects. Hyaluronan-based scaffolds appear to allow faster cell infiltration leading to faster tissue formation. The degradation of ACP leads to rapid bone formation while the slow degradation of HYAFF-11 prolongs the presence of cartilage and delays endochondral bone formation.     

BMP2重组慢病毒转染兔BMSCs黏附DBM支架的生物矿化研究

目的 探究BMP2重组慢病毒转染兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)黏附脱钙骨(DBM)支架体外构建转基因组织工程骨的生物矿化能力。方法 密度梯度离心及贴壁培养法获取第5代兔BMSCs,用BMP2重组慢病毒转染细胞，通过RT-PCR检测目的基因的表达，利用倒置荧光显微镜观察细胞在DBM支架上的生长情况，借助扫描电镜和能谱分析观测细胞在DBM支架上的表面微观形貌及生物矿化能力。结果 BMP2重组慢病毒成功转染兔BMSCs, RT-PCR显示转染后细胞能高效表达BMP2目的基因，在倒置荧光显微镜下观察见转染后细胞黏附在DBM支架上呈满天星样，并沿DBM支架孔隙内壁贴壁叠加生长、分裂增殖，扫描电镜下见细胞填满整个DBM支架孔隙，分泌大量细胞外基质，并在DBM支架表面形成凹凸不平的光泽结晶矿化物，能谱分析显示其钙磷比(Ca/P)为1.89±0.31,与正常骨组织成分相近(P>0.05)。结论 BMP2重组慢病毒转染兔BMSCs黏附DBM支架构建的转基因组织工程骨成功完成了生物矿化过程，体现出较好的生物矿化能力。     

骨组织工程支架材料合成技术的进展

组织工程骨是由人工支架材料体外复合扩增的成骨细胞或其前体细胞及生物活性分子构成,高孔隙支架材料在细胞黏附、增殖和新骨组织形成过程中起到最重要的作用。过去的十年,产生和发展了许多合成生物可降解支架材料的技术,骨组织工程研究取得了可喜的成绩。本文主要是回顾这些技术在支架材料的设计、制做工艺,以及各种技术不同参数对支架材料(孔隙率、孔径大小、孔隙连通率等)的影响,阐述不同技术的发展过程的优缺点。