两种巢式PCR法检测实验大鼠卡氏肺孢子虫的灵敏度评价

目的 对ITS1-5.8S rRNA-ITS2 巢式PCR 法与mtLSUrRNA 巢式PCR 法检测大鼠卡氏肺孢子虫的敏感性进行评价.方法 把大鼠随机分为7 组(6 组实验组,1 组对照组),每组10 只,采用地塞米松免疫抑制法诱导实验组大鼠感染肺孢子虫;自第3 周开始每周剖杀1 组实验鼠,收集第3 周至第8 周实验组大鼠肺组织(LT,lung tissue) 和支气管肺泡灌洗液(BALF,bronchoalveolar lavage fluid) 标本.同时采用镜检法、ITS1-5.8S rRNA-ITS2 巢式PCR 法和mtLSUrRNA 巢式PCR 法对大鼠LT 和BALF 标本进行检测,并对结果 进行统计学分析.结果 采用GMS 染色镜检法于第5 周开始检出肺孢子虫包囊,第6、7 周包囊数最多.采用ITS1-5.8S rRNA-ITS2-巢式PCR 法和mtLSUrRNA 巢式PCR 法对实验感染大鼠LT 和BALF 进行检测,前者卡氏肺孢子虫阳性率分别为第3 周20% (2/10)和0(0/10);第4 周70%(7/10)和10%(1/10);第5 周90%(9/10)和30%(3/10);第6 周90%(9/10)和80%(8/10);第7 周100%(10/10)和80%(8/10);第8 周40%(5/8)和40%(5/8).后者卡氏肺孢子虫阳性率分别为第3 周100% (10/10)和100(10/10);第4 周100%(10/10)和80%(8/10);第5 周100%(10/10)和50%(5/10);第6 周90%(9/10)和100%(10/10);第7 周100%(10/10)和80%(8/10);第8 周100%(8/8)和87.5%(7/8).经χ2检验,在大鼠无明显症状阶段(3~4w)时,两种巢式PCR 方法 检测敏感性差异有统计学意义.有明显症状阶段(5~8wq)时,其敏感性差异无统计学意义;同时统计学分析显示不同来源的标本对不同方法 敏感性不同,采用mt-LSU 巢式PCR 检测时,LT和BALF标本敏感性差异无统计学意义,采用ITS-巢式PCR检测时,对LT检测的敏感性更高.结论 mtLSU-巢式PCR 法检测实验大鼠中检出卡氏肺孢子虫敏感性高于ITS1-5.8S rRNA-ITS2-巢式PCR 法.     

AIDS患者合并感染耶氏肺孢子虫的巢式PCR检测及ITS基因的克隆测序

目的 探讨ITS巢式PCR检测AIDS患者合并耶氏肺孢子虫感染的应用价值并对ITS1-5.8S rDNA-ITS2基因进行克隆测序.方法 收集AIDS患者痰液标本,用二硫苏糖醇(DTT)消化处理后进行六亚甲基四胺银(CMS)染色镜检;提取肺孢子虫DNA后进行巢式PCR扩增,选取GMS染色和PCR同时阳性的112号和仅PCR阳性的185、200号病例的PCR产物进行TA克隆、测序,然后用Blastn程序和DNANAN软件对所测序列进行同源性比较和序列间比对,并和GenBank登录的耶氏肺孢子虫ITS1-5.KS rDNA-ITS2序列进行比较分析.结果 用ITS巢式PCR法检测AIDS患者99例,耶氏肺孢子虫DNA阳性43例,阳性率为43.4%(43/99),用GMS染色法检测,阳性率为4.04%(4/99),两者比较,有非常显著性差异(P<0.01).TA克隆112、185、200号病例的耶氏肺孢子虫ITS1-5.8S rDNA-ITS2基因序列长度分别为523bp、515bp、51lbp,三者之间的基因同源性为95%～97%,与GenBank登录的耶氏肺孢子虫(U07220)、(U07221)、(U07222)和(U07226)的ITS1-5.8S rDNA-ITS2基因的同源性为95%～98%,其变异位点多在ITS1和ITS2基因片段.结论 ITS巢式PCR法检测耶氏肺孢子虫敏感性明显高于GMS染色法.ITS巢式PCR法可作为肺孢子虫肺炎早期诊断方法,尤其适用无创性标本的检测,CMS染色法对无创性标本痰液的检测敏感性低,在临床上意义不大;成功获取广西株耶氏肺孢子虫ITS1-5.8S rDNA-ITS2的基因序列,与GenBank登录的外国株耶氏肺孢子虫基因序列高度同源,其中5.8S rDNA高度保守,ITS1和ITS2基因变异较大.     

黄芩苷对卡氏肺孢子虫肺炎大鼠SOD和MDA影响

目的 研究黄芩苷对卡氏肺孢子虫肺炎(PCP)大鼠血清和肺组织匀浆超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MOA)含世的影响,探讨中药黄芩苷对PCP大鼠的抗氧化作用.方法 给SD大鼠皮下注射地塞米松磷酸钠建立PCP动物模型,观察黄芩苷对PCP模型建立前后肺组织病理及血清和肺组织中SOD活性和MDA含量的影响,研究中药黄芩苷对PCP大鼠的抗氧化作用.结果 黄芩苷可使大鼠肺组织炎症明显减轻,血清和肺组织中SOD活性高剂量组分别为(1075.69±9.91)和(1235.73±202.52)U/ml,显著高于模型组的(664.14±245.76),(290.20±39.68)U/ml;MDA含量分别为(1.67±0.57),(1.73±0.35)nmol/(mg prot)显著低于模型的(8.46±0.78)和(28.00±7.43)nmol/(mg prot).结论 黄芩苷对PCP大鼠具有一定的抗氧化作用,能够降低MDA含量和升高SOD活性,减轻炎症反应.     

黄芩苷对卡氏肺孢子虫肺炎大鼠TNF-α和IL-8影响

目的研究黄芩苷对卡氏肺孢子虫肺炎(PCP)大鼠血清肿瘤坏死因子-a(TNF-α)和白细胞介素-8(IL-8)含量的影响,以探讨中药黄芩苷对PCP大鼠的免疫调节作用。方法给SD大鼠皮下注射地塞米松磷酸钠建立PCP动物模型,观察该药对PCP模型建立前后肺组织病理及血清肿瘤坏死因子-α和IL-8含量的影响。结果大鼠血清TNF-α含量,黄芩苷预防组(2.14±0.14)及(2.57±0.15),(1.46±0.14),(1.12±0.13)ng/mL剂量组均高于正常对照组(0.70±0.21)ng/mL(P<0.05,P<0.01),低于模型对照组(3.65±0.73)ng/mL(P<0.01)。有效药物对照组(1.59±0.14)ng/mL明显高于正常对照组(P<0.01),低于模型对照组(P<0.01)。血清IL-8含量,预防组(0.43±0.11)ng/mL及低(0.47±0.10)ng/mL、中(0.39±0.11)ng/mL、高(0.32±0.11)ng/mL剂量组均低于模型对照组(0.65±0.12)ng/mL(P<0.01)。有效药物对照组(0.33±0.12)ng/mL低于模型对照组(P<0.01)。治疗组肺组织炎症较模型对照组明显减轻,肺泡腔泡沫样渗出物均明显减少。结论黄芩苷对PCP大鼠具有一定的免疫调节作用,能够降低TNF-α和IL-8含量,从而减轻炎症反应。     

Molecular Identification and Differentiation of Fasciola Isolates Using PCR- RFLP Method Based on Internal Transcribed Spacer (ITS1, 5.8S rDNA,ITS2)

Background

In this study, we used both ITS1 and ITS2 for molecular identification of Fasciola species.

Methods

The region between 18S and 28S of ribosomal DNA was used in PCR-RFLP method for molecular identification of Fasciola species. Ninety trematodes of Fasciola were collected during abattoir inspection from livers of naturally infected sheep and cattle from Khorasan, East Azerbaijan, and Fars provinces in Iran. After DNA extraction, PCR was performed to amplify region ITS1, 5.8S rDNA, ITS2. To select a suitable restriction enzyme, we sequenced and analyzed the PCR products of F. hepatica and F. gigantica samples from sheep and cattle. Tsp509I fast digest restriction enzyme was selected for RFLP method that caused the separation specifically of Fasciola species.

Results

The fragment approximately 1000bp in all of the Fasciola samples was amplified and then digested with the Tsp509I restriction endonuclease. Seventy F. hepatica and 20 F. gigantica were identified of total 90 Fasciola isolates.

Conclusion

The new PCR-RFLP assay using Tsp509I restriction enzyme provides a simple, practical, fast, low cost, and reliable method for identification and differentiation of Fasciola isolates.