肝脏热缺血再灌注损伤对细胞周期调控相关基因表达的影响

目的观察肝脏热缺血再灌注损伤（WIRI）对细胞周期调控相关基因表达的影响,探索WIRI的分子机制。方法将24只SD大鼠随机分为假手术组、热缺血30min组、再灌注1h组和24h组,利用基因芯片和实时荧光定量聚合酶链反应（real-timePCR）分析验证WIRI大鼠模型处理前后基因表达的动态变化;按基因表达的动力学特征对功能基因进行多元变量聚类分析。结果常温热缺血30min、再灌注1h和24h时,肝实质细胞内mRNA表达上调的基因分别有86、410和234条,表达下调的基因有136、312和653条。经real-time PCR技术验证Gadd45a、Egr1和Hsp70的表达情况与芯片检测结果一致。结论采用非致死性WIRI处理大鼠后,再灌注早期肝脏细胞周期调控基因和再生相关基因表达上调,再灌注24h后多数早期上调基因恢复到WIRI处理前水平,证明WIRI早期即通过细胞周期调控基因影响细胞周期。Gadd45a、Egr1和Hsp70基因有可能成为药物治疗WIRI的新靶点。     

脑缺血／再灌注后神经元Ku蛋白的表达与DNA双链损伤的变化

目的：探讨脑缺血／再灌注后早期神经元Ku蛋白的表达与DNA双链损伤的变化及其与神经元转归的关系。方法：56只大鼠随机分为脑缺血／再灌注组（大脑中动脉线栓法制备缺血／再灌注模型）和假手术组,分别于术后1、6、12、24、48、72h6个时相点取脑组织,免疫组化法测定缺血／再灌注区Ku异二聚体的成分之一Ku70的表达,原位末端标记法（TUNEL法）观察脑缺血／再灌注后不同时相点缺血／再灌注区神经元DNA双链损伤的变化,DNA琼脂糖凝胶电泳检测缺血／再灌注区细胞凋亡。结果：脑缺血／再灌注1h时,缺血侧Ku70阳性细胞数即开始减少,缺血／再灌注24h降至最低水平;缺血／再灌注6h,缺血区TUNEL细胞数量开始升高,于24hTUNEL阳性细胞数均达到高峰,其后逐渐减少;24h后细胞DNA琼脂糖凝胶电泳始见凋亡特有的阶梯状（Ladder）条带。结论：脑缺血／再灌注早期,神经元Ku蛋白表达下降,可能是导致双链断裂的DNA无法得到修复造成神经元DNA不可逆性损伤,进而引起神经元死亡的原因。     

TLR2/4蛋白在小鼠全肝缺血再灌注损伤肝脏的表达及意义

目的观察Toll样受体2／4蛋白在小鼠全肝缺血再灌注损伤中肝脏的表达，并分析其与肝功能损伤的关系。方法通过夹闭BALB／c小鼠肝门，复制小鼠全肝缺血再灌注损伤模型。采用Western blot方法定量检测缺血肝叶中TLR2／4蛋白的表达变化，并检测门静脉血浆丙氨酸氨基转移酶（pALT）、肿瘤坏死因-α（TNF-α）及门静脉血清内毒素（endotoxin，EN）水平。结果与假手术组（sham-operated group，SH组）相比：（1）全肝缺血20min并行再灌注后，缺血再灌注组（ischemic／reperfusion group，I／R组）血清ALT在再灌注1h即明显升高，且在再灌注3h时较1h时明显升高；（2）I／R组缺血肝脏TLR2／4蛋白的表达（OD值）明显升高，TLR2蛋白的表达在再灌注3h较1h明显高；而TLR4蛋白的表达以再灌注1h时水平最高。（3）I／R组中门静脉血清TNF-α在再灌注1h即开始高，在再灌注3h达高峰。（4）门静脉血清内毒素水平明显升高（与SH相比，P〈0．01），但I／R组在不同灌注时间点之间无显著性差异（P〉0．05）。结论TLR2／4蛋白表达的上调参与了小鼠全肝脏缺血再灌注中肝脏的损伤。     

缺血预处理对大鼠部分肝脏切除术后肝脏一氧化氮合酶的影响及意义

目的 探讨缺血预处理（IPC）对大鼠部分肝脏切除术后肝脏一氧化氮合酶（NOS）的影响及意义。方法 20只SD大鼠随机分为2组：单纯热缺血组（WI）和缺血预处理组（IPC）。WI组于缺血前、再灌注后0．5、1、2、3h，IPC组于IPC前、IPC结束时、再灌注后0．5、1、2及3h分别切取肝脏组织约0．1g，用荧光定量PCR法检测其内皮型NOS（eNOS） mRNA和诱导型NOS（iNOS） mRNA。结果 两组肝脏热缺血再灌注后早期eNOS mRNA表达均增强，IPC组的表达高于WI组（P〈0、01或P〈0．05）。两组肝脏热缺血再灌注1h后iNOS mRNA开始表达，IPC组的表达低于WI组（P〈0．05）。结论 IPC可能通过促进肝脏热缺血再灌注早期eNOS mRNA的表达和抑制其稍后iNOS mRNA的表达，而发挥其对大鼠肝脏切除术中肝脏热缺血再灌注损伤的保护作用。     

BQ123与L-arginine在肝脏缺血再灌注损伤中的作用研究

目的：探讨肝脏缺血再灌注损伤的机制及BQ123或（和）L－arginine能否有效改善肝脏缺血再灌注损伤。方法：在大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型基础上，对组织形态学、肝脏酶学、透明质酸、血浆内皮素及免疫组织化学染色情况进行观测。结果：肝脏缺血再灌注损伤时，血肝酶、透明质酶、血浆内皮素水平均显著增高，再灌注前使用BQ123或（和）L-arginine的肝脏，其组织结构及功能损伤均显著减轻。结论：肝脏缺血再灌注损伤与肝脏微循环改善有关，若能在肝脏再灌注前使用BQ123或（和）L－arginine，可有效改善肝脏微循环，从而减轻肝缺血再灌注损伤。     

肝缺血再灌注对肝硬化大鼠的损伤作用

目的 研究肝硬化大鼠肝缺血再灌注（hepatic ischemia reperfusion,HIR）损伤的机制和程度。方法 用60％四经碳（CCl4）溶液皮下注射方法制作肝硬化大鼠模型，肝硬化大鼠随机分为六组：A组：假手术组（6只）；B、C、D组：分别为肝门完全阻断20min、30min、40min（每组各16只）；E组“单纯肠系膜上静脉阻断（16只）;F组：肝门阻断＋门腔转流（16只）；另外，随机取10只正常肝脏大鼠组成G组，行肝门完全阻断30min。观察7天存活率、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、透明质酸（HA）、肿瘤坏死因子（TNF），以及肝、肺病理的变化。结果 B、C、D、E、F、G组的7天存活率分别为10／10只、6／10只、4／10只、5／10只、8／10只、6／10只；再灌注后4h血清TNF变化：后六组均明显高于术前，C、D组高于B、A组，E、F组也明显高于A组（P＜0.01）再灌注4h后HA变化：D组明显高于B、E组，F、C组明显高于A组（P＜0.05）；再灌注4h后D、C组的AST、ALT均明显高于B组、A组、D组的AST明显高于F组，F组的AST、ALT显著高于E组（P＜0.05）；C、G两组比较，上述指标的差异无显著性（P＞0.05）；肝、肺组织学检查可见肝、肺的病理损害，程度随缺血时间的延长而加重，E组损伤重于F组。结论 硬化肝脏肝缺血再灌注损伤涉及全身多个器官，门脉静淤血可能是损伤乃至死亡的主要原因；肝硬化大鼠耐受肝缺血的最大的时限在30min以内。     

肝缺血再灌注细胞凋亡现象及Fas蛋白、PCNA 、p53、bcl-2 mRNA表达

目的：探讨肝缺血再灌注肝细胞凋亡发生的时空分布、基因表达特点及意义。方法：在观察SD大鼠（n=40）肝缺血0,30,45,60min再灌注3,6,24h存活率及病理形态基础上,重点观察大鼠（n=100)全肝血流阻断30min再灌注0,0.5,1,3,6,12,24,48,72,96h凋亡细胞分布（原位末端标记术,TUNEL）,G0-G1期细胞、凋亡细胞、增殖细胞指数分布（流式细胞术）,肝细胞显微及超微结构（光镜、电镜技术）,Fas蛋白、PCNA蛋白（免疫组化）及p53、bcl-2基因mRNA表达（原位杂交）。结果：缺血30min组多见细胞凋亡,细胞应答反应主要为三期：①急性期：再灌注0.5h Fas蛋白首先在血管周围高表达;②亚急期（3-24h):TUNEL阳性细胞在血管周围高分布,并向周围扩展;病理形态可见严重变性、细胞皱缩、细胞增殖三种变化;G1期细胞数大量减少,凋亡峰逐渐升高,12h后出现增殖峰,相关基因表达增强;③恢复早期（24-96h)：G1期细胞指数回升,凋亡峰和增殖峰持续并缓慢下降;相关基因表达陆续减弱。结论：肝缺血30min再灌注期机体可能通过下述基因调控途径影响细胞损伤应答反应：①Fas死亡基因与bcl-2存活基因的双重调控;②细胞凋亡与增殖双重调控;③经p53基因实现的细胞周期调控。     

缺血再灌注损伤对大鼠肝细胞周期G2/M期相关基因Gadd45a和Egr-1表达的影响

目的 观察缺血再灌注损伤(IRI)对大鼠肝组织内细胞周期调控相关基因转录和表达的影响,探讨生长阻滞和DNA损伤修复基因(Gadd45a)和早期生长反应基因1(Egr-1)参与DNA损伤后修复的可能机制.方法 按随机成组对照设计将大鼠平均分为正常对照组、缺血组、再灌注30min、1h、2h、3h及24 h组,于相应时间点获取大鼠肝组织样本,将利用芯片实验筛选出的关键基因Gadd45a和Egr-1作为目的基因,并采用RNA印迹法和实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT1PCR)验证基因芯片筛查的结果,采用荧光免疫组织化学染色检测冰冻新鲜肝组织样本Egr-1的表达,采用免疫组织化学染色检测肝组织样本Gadd45a的表达.结果 RNA印迹检测结果显示,RT-PCR产物与待测的目标基因一致;表达谱芯片信号与RT-PCR的检测显示,目的基因的表达变化特征均为再灌注早期(1h)升高4倍以上,其中Egr-1的表达上调9.39倍,Gadd45a的表达上调8.28倍及热休克蛋白70-1a的表达上调10.8倍;再灌注后24 h均降至正常水平,芯片初筛结果与RT-PCR的检测结果一致,是准确、可靠的.荧光免疫组织化学检测显示,再灌注1h组和2h组肝组织细胞核Egr-1的表达均为阳性;免疫组织化学检测显示,随着再灌注时间的增加,细胞核和细胞浆内Gadd45的表达逐渐升高.结论 Gadd45a和Egr-1基因均是核因子kB调控通路的关键基因,在大鼠肝脏IRI中参与调控了细胞周期G2/M期的停滞和修复受损的DNA.     

缺血预适应对肢体缺血再灌注大鼠肝脏的保护效应

目的 观察缺血预适应(IPC)对大鼠肢体缺血再灌注后肝脏损伤的影响,以进一步探讨IPC对肢体缺血再灌注后肝脏功能的保护作用。方法 实验用雄性Wistar大鼠18只,随机分为对照(Control)组,缺血再灌注(IR)组和缺血预处理(IPC IR)组．每组6只。分别测定血浆谷草转氧酶(ALT)、谷丙转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)．血浆和肝组织超氧化物歧化酶(SOD)、黄嘌呤氧化酶(XOD)、丙二醛(MDA)的含量变化及肝组织的湿/干重比值(W／D)、髓过氧化物酶含量(MPO)及DNA双链百分率(Ratio of DNA Chain％)。结果 发现IPC减轻了肢体IR后引起的ALT、AST、LDH、XOD、MDA、MPO、W／D含量的升高．并且增加了SOD以及肝组织中DNA双链百分率。结论 IPC对肢体IR继发的肝脏功能损伤具有保护作用。     

功能MR成像在DCD供肝热缺血再灌注损伤评估中的应用

目的探讨功能磁共振(MR)成像在心脏死亡器官捐献(DCD)供肝热缺血再灌注损伤评估中的应用情况。方法对关于功能MR成像原理及其在肝脏热缺血再灌注损伤评估中应用的相关文献进行综述并进行分析总结。结果目前应用于肝脏热缺血再灌注损伤评价的功能MR技术主要包括扩散加权成像、体素内不相干运动、扩散张量成像、血氧气水平依赖性MRI、MRI特异性对比剂增强检查、T2 mapping等,这些技术目前主要用在对动物模型的评价中。结论从目前动物模型研究结果看,功能MR成像能够无创、定量评价活体肝脏组织的微观信息变化,对进一步认识肝脏热缺血再灌注损伤的机制及其预后评估具有重要价值,特别是随着DCD的开展,功能MR成像将在肝脏热缺血再灌注损伤评估中发挥重要的作用。     

Bcl-2和Bax在前列腺癌不同周期时相的表达

目的 探讨凋亡相关基因Bel-2和Bax在前列腺癌不同周期时相的差异表达及意义.方法 应用改良的胸腺嘧啶核苷和高压笑气双阻断法把前列腺癌细胞系PC-3同步在不同的周期时相,应用流式细胞术检测同步化的效率.进而应用RT-PCR及Western blot方法检测不同周期时相Bcl-2和Bax在mRNA和蛋白水平的表达.结果 前列腺癌细胞系PC-3的M、G1、S和G2期细胞同步化效率分别为92.1%、87.0%、80.2%和75.9%;Bcl-2在不同周期时相均有表达且存在差异,G1期表达水平最高,S、M和G2期表达水平显著降低,mRNA和蛋白水平表达具有一致性;Bax在各周期的mRNA水平及蛋自水平表达没有明显差别.结论 细胞周期对凋亡相关基因Bel-2的表达有显著影响,对Bax无影响,对于采用Bcl-2途径治疗前列腺癌具有指导意义.     

胃癌细胞周期G1/S转换期基因表达谱的分析

目的检测胃癌细胞在DNA合成前期/DNA合成期(G1/S)交界点基因表达谱的变化,探讨胃癌细胞由G1期进入S期相关基因的调控作用。方法应用胸腺嘧啶核苷(thymidine)-偌考达唑(nocodazole)及双胸腺嘧啶核苷(doublethymidine)法分别阻断胃癌细胞株(MKN45)于DNA合成后期/有丝分裂期(G2/M)及G1/S交接点释放后收集标本,应用cDNA微阵列基因芯片检测细胞周期中G1早期、G1末期、S早期及S晚期的基因表达谱,专业软件进行聚类分析。结果检测到4个时间点均可信的2001个基因,其中959个基因出现上调或下调。147个基因在G1末期出现上调,其功能涉及DNA代谢、转录与翻译、翻译后修饰、泛素化、信号转导等,这些过程在不同环节上影响细胞周期。结论多基因参与胃癌细胞周期G1期至S期的转换,且为其转换所必需,部分参与以上过程的基因与胃癌过度增殖有关。     

Dexamethasone suppresses vascular smooth muscle cell proliferation.

BACKGROUND: Experimental studies in vivo have demonstrated that dexamethasone inhibits neointimal hyperplasia following arterial injury. The mechanisms of this inhibition have not been clearly defined. Our objective was to test the hypothesis that dexamethasone directly suppresses smooth muscle cell (SMC) proliferation by inhibiting cell cycle progression and the expression of key cell cycle-dependent genes. METHODS: Cultured rat aortic SMC were treated with incremental concentrations of dexamethasone and cell number was determined after 72 h. To determine if dexamethasone inhibited cell cycle progression, cells were synchronized, then restimulated to enter the cell cycle, and treated with or without dexamethasone. DNA synthesis was determined 24 h after restimulation by measuring [3H]thymidine incorporation. To define the point of action of dexamethasone in the cell cycle, synchronized SMC were treated with dexamethasone (10(-7) M) at various time points after entry into the cell cycle. Flow cytometry and Northern blots were performed to examine cell cycle progression and the expression of smooth muscle cell cycle-dependent genes c-fos, c-myc, and thymidine kinase (TK). RESULTS: Dexamethasone treatment induced a concentration-dependent inhibition of SMC proliferation and DNA synthesis. The cell cycle progression of synchronized SMC from G1 into S phase was inhibited by dexamethasone, even when added as late as 16 h after restimulation. The expression of TK was suppressed by dexamethasone, while c-fos and c-myc were not affected. CONCLUSIONS: Dexamethasone inhibits the proliferation of SMC in a concentration-dependent fashion. This inhibition is associated with a block in cell cycle progression late in G1 phase of the cell cycle. Consistent with this finding, dexamethasone does not alter the expression of the early cell cycle-dependent genes c-fos and c-myc, but significantly inhibits the expression of TK, a marker of late G1 phase.     

RNAi沉默PLCε基因对膀胱癌BIU-87细胞株的增殖调控作用

目的 探讨RNA干扰技术沉默PLCε基因表达对膀胱癌BIU-87细胞株增殖的抑制作用.方法 构建靶向PLCε基因特异性shRNA重组质粒pGenesil-PLCE,经脂质体介导转染BIU-87细胞株,蛋白质印迹法、RT-PCR方法检测PLCε在癌细胞蛋白及mRNA水平的表达,噻唑盐法观察重组质粒对BIU-87细胞增殖的抑制作用,免疫细胞化学染色分析增殖细胞核抗原(PCNA)含量改变,流式细胞仪检测细胞周期分布.结果 构建的重组质粒pGenesil-PLCε能明显抑制PLCE基因表达,且能明显抑制BIU-87细胞增殖;转染重组质粒0、24、48和72 h后细胞增殖抑制率分别为2.01%、32.85%、39.78%、37.19%,重组质粒组与对照组、阴性质粒组比较,差异有统计学意义(P<0.01).细胞内PCNA表达下调了33.08%;G0/G1期细胞(71.50±4.48)%与空白对照组(40.75±2.30)%、阴性质粒组(40.00±1.76)%比较明显增多,G2/M期细胞(8.16±0.51)%与空白对照组(31.20±1.76)%、阴性质粒组(35.94±1.58)%相比减少.差异均有统计学意义(P<0.01),细胞阻滞于G0/G1期,细胞增殖状态受到明显抑制.结论 PLCε基因在促进膀胱癌细胞增殖中发挥莺要作用,可能成为膀胱癌生物学治疗潜在的分子靶点.     

多囊蛋白1氨基端肽对常染色体显性多囊肾囊肿衬里上皮细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨多囊蛋白1氨基端肽（PC-1NTP）对常染色体显性多囊肾病（ADPKD）肾囊肿衬里上皮细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响.方法 用噻唑蓝（MTT）法检测PC-1NTP对ADPKD囊肿衬里上皮细胞增殖的影响.用流式细胞仪分析细胞周期与凋亡状况.用荧光定量PCR检测细胞中细胞周期素cyclinD1、p21WAF1、bax、bcl-2和小染色体维护蛋白2（MCM-2）的mRNA表达.结果 PC-1NTP使ADPKD囊肿衬里上皮细胞G0/G1期细胞百分比显著增多,S期细胞百分比显著减少,并明显抑制其增殖和凋亡;同时细胞中p21和bcl-2 mRNA表达明显增高（P＜0.01）,cyclinD1、bax和MCM-2的mRNA表达明显减弱（P＜0.01或P＜0.05）.结论 PC-1NTP能明显抑制ADPKD囊肿衬里上皮细胞的增殖和凋亡,减慢细胞周期进程,其作用机制可能是通过调节G1/S关卡调节因子cyclinD1/p21WAF1和凋亡调节蛋白bcl-2/bax的表达实现的.PC-1NTP有希望成为治疗ADPKD的可选药物.     

阿司匹林对肝癌细胞生长的抑制作用及其机制

目的 观察阿司匹林(AS)对肝癌细胞SMMC-7721生长的作用,并探讨其作用机制.方法 采用噻唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度阿司匹林对肝癌细胞细胞生长的抑制作用以及流式细胞仪检测不同浓度阿司匹林对肝癌细胞细胞周期的影响;免疫组织化学方法检测阿司匹林对肝癌细胞细胞增殖核抗原(PCNA)、环氧合酶-2(COX-2)表达的影响;并用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定COX-2基因的表达.结果 肝癌细胞经不同浓度的阿司匹林作用后,其生长抑制率明显升高(P<0.05),且与阿司匹林浓度有关和作用时间相关.细胞周期检测结果显示,经不同浓度阿司匹林作用后的SMMC-7721细胞,细胞周期发生明显变改.表现为随着阿司匹林浓度的增加,S期细胞比例下降明显,G0/G1期及G2/M期细胞比例则上升(10-2、10-3moL/L AS组与对照组比较P<0.05).免疫细胞化学染色显示,阿司匹林能下调肝癌细胞COX-2、PCNA的表达.RT-PCR检测表明,COX-2基因表达电泳条带与对照组比较辉度明显降低,其中10 mmol/L阿司匹林组最低,说明随着阿司匹林浓度增加,COX-2表达逐渐减少,阿司匹林能下调SMMC-7721细胞表达COX-2基因.结论 阿司匹林能有效抑制肝癌细胞SMMC-7721的生长,这种作用可能是其通过抑制细胞增殖,与抑制COX-2、PCNA的表达有关.     

LRIG1基因表达下调对胶质瘤细胞周期及凋亡的调控作用

目的 探讨富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白1(LRIG1)基因表达下调后对胶质瘤细胞的周期及凋亡的影响及其机制.方法 将携带针对LRIG1基因特异性RNA干扰序列及非特异性shRNA编码序列的质粒载体分别转染GL15细胞株,用G418(600 mg/L)筛选出稳定株后,Western blot法检测LRIG1蛋白表达的改变,PI(0.05 g/L)与Rnasine(0.5 g/L)标记后流式细胞仪检测对照组与实验组细胞的周期差异,Annexin V-FTTC/PI双标后用流式细胞仪观察两组细胞凋亡的改变.结果 成功获得干扰LRIG1基因的GL15细胞稳定株,实验组较对照组LRIG1基因表达下降54.7%.流式细胞仪分析显示,实验组的G2/M期细胞百分率较对照组明显增高(P＜0.01),实验组细胞的凋亡比例明显低于对照组(P＜0.01).讨论抑制LRIG1表达后,GL15细胞的抗凋亡能力明显增强并能使细胞阻滞在G2/M期.     

Systemic Lupus Erythematosus: the involvement of PI3K/Akt/mTOR pathway in cellular cycle and in early apoptosis

ObjectivePI3K/Akt/mTOR signaling pathway plays a critical role in many cellular functions. Until now there are no data regarding this signaling pathway and p27kip1 status in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of patients with Systemic Lupus Erythematosus (SLE). Therefore, we proposed to analyze in SLE PBMCs the activity of Akt, the expression level of their substrate p27kip1 and the relationship with cell cycle progression as well as the contribution of mTOR to the increased apoptosis of SLE PBMCs.MethodsAkt and mTOR activities were evaluated by measuring their phosphorylation level, using immunoblotting. The expression level of p27kip1 in PBMCs and lymphocytes was analyzed by immunoblotting and FACS. Quantification of apoptosis and the cell cycle distribution were performed using FACS.ResultsThe phosphorylation level of Akt at Thr308 was statistically significant higher while the expression level of p27kip1 was two times lower in SLE than in HC PBMCs. The percentage of lymphocytes accumulated in S and G2/M cell cycle phases are significantly increased in SLE than in HC. Statistical analysis demonstrated that p27kip1 expression level correlated with the percentages of lymphocytes in cell cycle phases. Moreover, in SLE lymphocytes, p27kip1 expression level was indirectly correlated with apoptosis. The phosphorylation level of mTOR was similar in SLE and HC PBMCs, probably due to the therapy. In SLE lymphocytes, where an increased apoptosis was found, mTOR activity was inverse correlated with apoptosis.ConclusionsIncreased activity of Akt, observed in SLE lymphocytes, explains the reduced expression of its substrate p27kip1. This defect seems to be involved in SLE lymphocytes passage by G1/S cell cycle checkpoint. Therefore, SLE lymphocytes accumulate in S and G2/M cell cycle phases towards apoptosis or proliferation. The inverse correlation of mTOR activity and apoptosis rather suggested an anti-apoptotic role of this kinase.