一种新的大丽轮枝菌基因敲除载体的构建

[目的]研究大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)致病基因的功能,构建一个便于筛选敲除转化子的高效基因敲除载体.[方法]通过普通PCR技术扩增得到绿色荧光蛋白基因(GFP),连接到pMD18-T载体上,测序验证,利用限制性内切酶HindⅢ将目的片段切下,连接到敲除载体pRF-HU2的多克隆位点上.通过电击转化法将载体转化到农杆菌EHA105中,利用农杆菌介导法(ATMT)转化到大丽轮枝菌.[结果]成功得到一种新的携带GFP筛选标记的大丽轮枝菌敲除载体,通过GFP基因的筛选,T-DNA随机插入转化子在荧光显微镜下呈现绿色,相反敲除转化子在荧光显微镜下不呈现绿色.[结论]构建了一种大丽轮枝菌基因新的高效敲除载体,利用该载体大大节省了筛选转化子所用的时间,为大丽轮枝菌功能基因的验证提供了技术平台.     

黄瓜枯萎病病株镰孢菌的分离与鉴定

采集来自哈尔滨、长春、沈阳、北京、保定、银川、西宁及杭州等8个地区黄瓜大棚内的43株枯萎病病株,采用常规组织分离法,共分离获得478株镰孢菌。根据形态学鉴定,确定它们属于7种镰孢菌,其中尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)占77.62%,锐顶镰孢菌(Fusarium acuminatum)占0.21%,木贼镰孢菌(Fusariumequiseti)占3.97%,腐皮镰孢菌(Fusarium solani)占15.48%,半裸镰孢菌(Fusarium semitectum)占1.46%,轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)占0.84%,以及层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)占0.42%。对所有菌株进行致病性测定。结果表明,只有尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)具有致病性,发病率为71.43%;而其他菌株均未发病,表明其他菌株为非致病菌株。     

大丽轮枝菌VdLac基因克隆与功能分析

为探讨漆酶基因VdLac在大丽轮枝菌中的功能,克隆该基因并利用农杆菌介导的遗传转化方法和PEG介导的原生质体转化方法对VdLac进行敲除和功能回复,获得敲除和互补突变体。以野生型JY为对照,对敲除突变体和互补突变体进行生物学功能测定。结果显示,VdLac基因全长1 978bp,cDNA序列全长1 713bp,编码570个氨基酸组成的蛋白质;VdLac基因缺失突变体(△VdLac)对硝化压力更敏感,其在CM培养基上仍可产生漆酶,但产生漆酶的能力降低;表明大丽轮枝菌漆酶基因VdLac不影响菌株的营养生长、产孢、致病力以及黑色素合成。     

反向遗传学及在稻瘟菌和镰孢菌功能基因研究中的应用

稻瘟菌是危害水稻生产的世界性病原菌,也是研究植物与病原菌互作系统的重要模式生物.镰孢菌是危害小麦等重要农作物的主要病原菌,且能产生真菌毒素而对农产品造成污染.随着稻瘟菌和镰孢菌全基因组测序成功,如何利用基因组序列来鉴定和分析基因功能成为当前主要挑战.反向遗传学方法为进一步研究稻瘟菌基因功能提供了重要基础.综述了基因敲除、插入突变、基因沉默以及定向诱导基因组局部突变等一些热点反向遗传学方法及其在稻瘟菌和镰孢菌功能基因组分析中的应用进展.     

尖孢镰孢菌室内生物药剂筛选

在室内选用了6种生物药剂对尖孢镰孢菌进行了毒力测定。结果表明:在供试的药剂中,抑菌效果较好的药剂有低聚糖素、春雷霉素、克菌康,其中低聚糖素对尖孢镰孢菌的抑菌效果最好,EC50为18.20mg·L-1,春雷霉素次之,EC50为20.49mg·L-1。     

陕西大丽轮枝孢菌系营养体亲和性及致病性研究

应用Ｎｉｔ突变体技术，对陕西９种寄主作物上的３８个大丽轮枝孢丽系进行了营养体亲和性研究。结果表明，３８个菌系中２个未产生Ｎｉｔ突变体，２个未产生Ｎｉｔ１和Ｎｉｔｍ突变体，其余３４个菌系产生了Ｎｉｔｌ突变体，其中８个又产生了Ｎｉｔｍ突变体。对３４个菌系进行营养体亲和性测定结果分为４个亲和群（ＶＣＧ）。不同亲和群菌系致病力和寄主来源存在差异。     

刀孢轮枝菌产红色素条件及稳定性研究

分离了一株在PDA上强烈产生红色素的小叶杨(Populus simonii)内生菌, ITS-nrDNA序列分析及形态学初步鉴定为:刀孢轮枝菌(Lecanicillium psalliotae)。其产红色素是一种水溶性色素,在513 nm处有强吸收峰,该色素在以葡萄糖为碳源的培养基中生长迅速,培养至23 d色素达到最大的浓度2.73 mg·mL^-1,随后浓度逐渐下降。氧化剂H₂O₂和还原剂Na₂SO₃浓度逐步增大对色素有减色反应,色素在中性和碱性条件下红色加深,紫外光下长时间放置无大变化,但在紫外光照射3 h时色素达到最大色度,温度对色素稳定性的影响较小。金属离子Ca²⁺、Fe²⁺、Cu²⁺和Zn²⁺对色素影响较大,能改变色素颜色。该色素浓度为2.11 mg·mL^-1时,对Escherichia coli和Pseudomonas syringa pv. actinidia拮抗作用明显。     

亚细亚镰孢菌产碱性蛋白酶与致病力的相关性

选择了6个不同致病力的亚细亚镰孢菌菌株,提取纯化碱性蛋白酶,利用蛋白酶活性电泳的方法对其进行特性分析,研究其致病力与其产碱性蛋白酶的相互关系。亚细亚镰孢菌产生的碱性蛋白酶最适反应温度为30~40℃,最适反应pH值为7.5~8.5,属于丝氨酸蛋白酶类型。菌株致病力强弱与其产碱性蛋白酶活性呈极显著正相关。亚细亚镰孢菌产生的碱性蛋白酶可能与真菌的致病力有关。     

鸡舍环境镰孢菌的定量研究

[目的]对鸡舍空气和周围基质(饲料、粪便、灰尘、土壤)中镰孢菌(Fusarium)的浓度和分布进行定量研究,为控制从业人员和禽类Fusarium感染及预警提供科学依据。[方法]采用6级Anderson空气微生物采样器和曝皿法采集空气中样本,采用无菌袋随机采取周围基质中样本,进行实验室培养、计数、纯化。[结果]共得到镰孢菌分离株717株,以灰尘中Fusarium的浓度最高(2.8×105~1.5×106cfu/g,平均为8.8×105cfu/g)。[结论]空气中的镰孢菌分布与土壤中和灰尘中镰孢菌相关性较大。     

镰孢菌代谢产物浓度的定量测定方法

针对大豆根腐主要病原菌之一的镰孢菌进行的其代谢产物定量研究结果表明,在一定条件下,在PSC和土壤浸提液 大豆汁培养液中随接菌量的增加,其培养滤液的电导率也随之增加,说明随代谢产物浓度的增加电导率值也随着增加,二者呈高度正相关;在其“接种”不同浓度代谢产物的盆栽试验中,随代谢产物电导率(浓度)增加,其导致的大豆根部变褐程度也呈规律性加重,表明可以用培养滤液电导率值表示培养滤液中代谢产物的相对浓度。     

梭菌氢酶基因部分片段的同源克隆及敲除载体的构建

为从分子水平探索典型铁还原菌-梭菌的铁还原能力与其氢酶产氢之间的关系,以从水稻土中分离得到一株具有高铁还原能力和高产氢能力的梭菌为材料,通过同源克隆获得长度为761bp氢酶基因的部分序列。生物信息分析发现,该基因片段覆盖氢酶的活性中心,是氢酶的主要功能结构域。采用Overlap PCR的方法构建含有四环素抗性基因的氢酶基因敲除载体(pMD-19-HTH),以期进一步构建氢酶基因缺失的梭菌突变体,为分析氢酶产氢与铁还原的关系奠定基础。     

拟轮枝镰孢ATMT突变体库的构建及分析

【目的】通过建立适用于拟轮枝镰孢（Fusarium verticillioides）的农杆菌介导遗传转化体系,构建绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记的拟轮枝镰孢ATMT（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation）突变体库,并对突变体库进行筛选分析,为研究拟轮枝镰孢在玉米果穗上的侵染途径和致病的分子机制打下基础。【方法】筛选头孢噻肟钠（cefotaxime sodium,Cefo）和氨苄青霉素钠（ampicillin sodium,Amp）对根癌农杆菌AGL-1的抑菌浓度和拟轮枝镰孢对潮霉素B（hygromycin B）的敏感浓度;以含有绿色荧光蛋白基因（GFP）、潮霉素抗性基因（HPH）的穿梭质粒为载体,通过ATMT构建GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库;利用潮霉素抗性筛选、GFP的特异性引物进行PCR检测和荧光显微镜观察,检测分析T-DNA插入情况及转化子稳定性;从突变体库中随机挑选9个转化子菌株并进行分析,对其产孢量、分生孢子萌发率、致病力等进行测定。【结果】通过农杆菌抑菌试验发现当Cefo/Amp的浓度为150/150 μg·mL ^-1时,AGL-1生长受到抑制;当潮霉素B的浓度为150 μg·mL ^-1时,拟轮枝镰孢完全丧失生长能力。利用优化后的ATMT转化获得了2 465株GFP标记的拟轮枝镰孢转化子;转化子在不含潮霉素B的PDA培养基上连续转接5代再转到含潮霉素B的培养基上仍能正常生长,说明HPH成功插入野生型基因组且稳定遗传;利用GFP特异性引物对转化子进行PCR检测,测序结果显示与NCBI中GFP（登录号：LC420351.1）的同源性为99.26%,表明GFP已成功整合到野生型基因组中;转化子菌丝和孢子在荧光显微镜下观察均呈现绿色,而野生型菌株未观察到任何荧光,表明GFP转移到拟轮枝镰孢野生型菌株基因组中,且能够成功表达。对部分转化子分析发现,与野生型相比转化子54的产孢量明显增多,约为野生型的1.9倍;转化子24的分生孢子萌发率在相同时间内明显下降;转化子13的致病力增强,病害级别达到9级,转化子33和16致病力减弱为3级,转化子4致病力最弱为1级,部分转化子生物学性状未发生明显变化。 【结论】构建了农杆菌介导GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库,筛选分析获得了产孢量、孢子萌发率、致病力发生变化的突变体,为进一步研究拟轮枝镰孢侵染玉米果穗的途径和致病的分子机制打下了基础。     

豌豆早期结瘤素基因PSSYMl0的克隆及其表达载体的构建

采用PrimStar HS DNA聚合酶从碗豆基因组DNA中扩增出了碗豆早期结瘤素基因PsSYM10.序列分析结果表明,所克隆的基因与GenBank公布的同源基因在碱基和氛基酸序列上的相似性分别为98.6%和99.7%.将PsSYM10基因与结瘤相关基因PsENOD12,凝集素基因PsLectin串联组合,构建成了双元表达载体.     

hrpZ_(Psg12)基因植物表达载体的构建及花粉管通道法转化玉米的初步研究

利用hrpZPsg12转化玉米,以期得到对玉米病害具有广谱抗性的新种质材料,为抗病育种提供新的种质资源。以植物表达载体pCAMBIA3301为基础载体,采用PCR法从克隆载体pGM-hrpZPsg12克隆来自丁香假单胞菌大豆致病变种(P.syringae pv.glycinea)的hrp ZPsg12基因,两端分别引入XhoⅠ酶切位点,构建了1个具有卡那霉素和除草剂草丁膦抗性标记的植物表达载体pCAMBIA3301-hrpZPsg12,并通过热激法转入到大肠杆菌DH5α中。采用花粉管通道法将构建好的植物表达载体的重组质粒导入玉米优良自交系"综31"中。结果表明:对得到的575株转化植株经PCR检测有45株呈阳性,阳性转化率为7.83%。     

花生FAD2基因CRISPR/Cas9多靶点敲除载体构建

ω-6脂肪酸脱氢酶控制花生中油酸向亚油酸的转化,该酶由AhFAD2基因编码。为了研究AhFAD2基因的功能,本研究根据前期已经克隆得到的AhFAD2基因序列,设计了gRNA前导序列,并构建了CRISPR/Cas9基因编辑载体,通过双酶切和Sanger测序确定载体构建成功。AhFAD2基因CRISPR/Cas9载体的构建为接下来的遗传转化及研究该基因的功能奠定了基础。     

CRISPR-Cas9技术敲除甜瓜eIF4E基因表达载体的构建

【目的】构建甜瓜eIF4E基因的CRISPR-Cas9植物基因编辑系统的gRNA 表达载体。为研究eIF4E基因功能奠定基础。【方法】以新疆主栽甜瓜皇后为材料,在eIF4E基因的第一个外显子区设计gRNA引物,以载体pP1C.4为模板,扩增获得sgRNA克隆框,使用EcoR I、Xba I双酶切pP1C.4载体,利用DNA重组酶构建重组载体pP1C.4-eIF4E。【结果】经菌落PCR检测和测序,gRNA 已经成功连接到植物基因敲除载体pP1C.4。【结论】构建了植物基因敲除载体pP1C.4-eIF4E,pP1C.4-eIF4E能对eIF4E基因进行定向编辑。     

基于宿主诱导的基因沉默技术创制抗拟轮枝镰孢玉米自交系

【目的】拟轮枝镰孢（Fusarium verticillioide）是一种主要的病原真菌,侵染玉米可以导致穗粒腐病、茎腐病、苗期根腐病及引起种子腐烂。由拟轮枝镰孢引起的病害不仅影响玉米的产量和品质,而且其病原菌代谢过程中产生的伏马菌素等多种真菌毒素严重威胁了人畜安全。通过宿主诱导的基因沉默（host-induced gene silencing,HIGS）技术创制抗拟轮枝镰孢的玉米种质,为玉米抗病育种提供新的优异抗源。【方法】通过同源克隆方法克隆可能与拟轮枝镰孢生长发育相关的关键基因,并通过体外转录获得相应的dsRNA片段;将不同基因的dsRNA与拟轮枝镰孢的分生孢子悬浮液预混后,用于后续的体外RNA沉默试验;对感病玉米自交系西502的种子进行消毒与接种,在培养皿中28℃避光培养48 h,调查种子的发病程度;在混有dsRNA的孢子悬浮液中加入葡萄糖,25℃培养24 h后,在显微镜下观察孢子萌发与菌丝生长情况;将三叶期的西502幼苗转移至预混dsRNA的孢子悬浮液中进行培养,7 d后观察苗期根腐病发病状况;通过种子鉴定与苗期鉴定体系,逐步筛选具有显著抑制效果的沉默靶标基因;合成筛选出的重点靶标基因片段,构建沉默载体并转化感病玉米自交系西502;对转基因株系的种子接种鉴定,验证转化玉米株系的抗性;提取接种后转基因种子的总RNA,对拟轮枝镰孢的靶标基因进行荧光定量分析,确定HIGS株系的沉默效果。【结果】从拟轮枝镰孢中克隆出18个与其生长发育相关的候选基因;通过种子接种鉴定,发现11个候选基因被沉默后,种子的发病等级极显著降低;进一步筛选出6个沉默后影响拟轮枝镰孢的孢子萌发和菌丝生长的候选靶标基因deo、Ras2、Dpdc、Hsp90、Frp1和Atg15;通过苗期接种鉴定,最后筛选出3个在体外具有显著抑制效果的沉默靶标基因deo、Atg15和Frp1;进而将3个靶标基因的特异区段人工融合成一段序列并构建沉默载体,获得转基因植株;鉴定发现转基因植株的T₂代种子对拟轮枝镰孢的抗性显著增强,且3个靶标基因的表达量均显著下降。【结论】拟轮枝镰孢基因deo、Atg15、Frp1与其生长发育密切相关,且沉默后能够显著提升玉米对拟轮枝镰孢的抗性。     

苹果树腐烂病菌GTP-环化水解酶II基因敲除载体构建及其突变体的表型分析

【目的】利用反向遗传学方法构建苹果树腐烂病菌（Valsa mali）中表达GTP-环化水解酶II基因Vmgtp1的敲除载体,通过同源重组的方法进行基因敲除分析目标基因的功能,为全面解析苹果树腐烂病菌致病的分子机制奠定基础,并为有效控制苹果树腐烂病的方法技术和药剂研制提供理论依据。【方法】通过对笔者实验室苹果树腐烂病菌转录组数据的分析比对得到GTP-环化水解酶II基因Vmgtp1（暂命名）,该基因在接种5 d后,在病组织中表现出一定的上调表达,推测该基因可能与苹果树腐烂病菌致病相关。采用Double-joint PCR方法,将目标基因Vmgtp1的上游片段UP、下游片段DOWN及筛选标记潮霉素磷酸转移酶基因（hph）进行片段融合。对得到的PCR产物及质粒pHIG2RHPH2-GFP-GUS进行双酶切,通过T4连接酶,将片段UP-HPH-DOWN连接到质粒pHIG2RHPH2-GFP-GUS上,转化到JM109菌株中,挑取阳性克隆,提取质粒,得到含有hph的Vmgtp1敲除载体,再利用PEG介导的遗传转化获得抗潮霉素的突变体,然后用4对引物对突变体进行PCR检测及Southern Blot验证得到敲除突变体,最后对敲除突变体及野生型菌株03-8进行菌落颜色、菌落大小、繁殖体产生情况等表型分析和接种在离体苹果烫伤枝条上观察病斑大小的致病性检测,对检测数据用SPSS软件进行差异显著性分析。【结果】通过上述方法成功构建了表达GTP-环化水解酶II基因的Vmgtp1敲除载体,并利用PEG介导的遗传转化方法在苹果树腐烂病菌中进行了转化,共获得101个能够在含潮霉素PDA培养基上生长的突变菌株,经过PCR及Southern Blot对101个突变菌株进行分析验证,得到1个敲除突变体,编号为ΔVmgtp1-90。在PDA培养基上,敲除突变体ΔVmgtp1-90与野生型菌株03-8相比,ΔVmgtp1-90菌落平均生长速率为11.33 mm?d-1,03-8平均生长速率为24.67 mm?d-1,突变体菌落生长速率明显变慢,颜色变浅,气生菌丝稀疏;ΔVmgtp1-90光照培养40 d仍无繁殖体的产生,而03-8光照条件下培养15 d后就能产生繁殖体,30 d后有分生孢子从繁殖体上溢出。致病性检测试验发现,接种ΔVmgtp1-90菌株7 d后,富士苹果枝条上病斑的平均直径为9.3 mm,与之相比,接种03-8的苹果枝条病斑平均直径为24.8 mm,ΔVmgtp1-90致病性显著减弱。【结论】通过基因敲除和遗传转化获得苹果树腐烂病菌中表达GTP环化水解酶II Vmgtp1的敲除突变体ΔVmgtp1-90,比较Vmgtp1突变体与野生型菌株的表型及致病性差异,发现Vmgtp1可能参与调控苹果树腐烂病菌菌丝生长和繁殖体的产生过程,并且可能在苹果树腐烂病菌致病过程中起作用,但是是否起主要作用还有待进一步研究。