滚环扩增在乙型肝炎病毒cccDNA检测中的应用

目的 建立慢性乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)的滚环扩增(RCA)方法 .方法 以27例慢性乙型肝炎患者的肝组织cccDNA和血清松弛环状DNA(rcDNA)为研究对象.根据中国患者HBV基因序列特点设计4对引物,分别可与HBV cccDNA的正、负链结合.在Phi29 DNA聚合酶的作用下,获得线性多拷贝cccDNA扩增产物,以该产物为模板获得cccDNA全序列;通过对模板的系列稀释鉴定RCA方法 的灵敏度;以RCA产物为模板扩增肝组织cccDNA的反转录酶区基因,并与同时扩增的同时间采集的同一患者血清中的rcDNA序列进行比较.结果 成功建立了HBV cccDNA全序列的RCA方法 ,最低可检测到10个拷贝的cccDNA分子,并获得了所有扩增cccDNA的全基因序列.27例患者中,18例患者的肝组织CCCDNA和血清rcDNA反转录酶区的序列完全一致,9例患者中共检出 84个不同的核苷酸位点,平均每个患者9.3个,84个不同核苷酸中只有5个引起了氨基酸的改变.结论 滚环扩增方法 对肝组织HBV cccDNA的检测具有较好的灵敏度.该方法 的建立对深入了解cccDNA在HBV致病机制中的作用以及评价抗病毒疗效有重要意义.     

血清病毒检出核苷(酸)类似物耐药突变的慢性乙肝患者PBMCs中HBV cccDNA基因突变特点分析

目的分析经核苷(酸)类似物治疗并已在血清病毒中产生耐药基因突变的慢性乙肝患者外周血单个核细胞(PBMCs)中HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)反转录酶(RT)区的基因突变特点。方法收集2010年7月-2011年8月于解放军302医院住院的慢性乙肝患者30例,均经6个月以上的核苷(酸)类似物抗病毒治疗并已在血清中检测到耐药相关突变。采集与血清检测同一时间点的全血标本30份并分离PBMCs,提取总DNA,以不降解质粒的ATP依赖的DNA酶(PSAD)消化+滚环扩增+跨缺口PCR方法扩增HBV cccDNA的RT区,分析9个位点的核苷(酸)类似物耐药相关变异。结果 30份样本中,16例检出HBV cccDNA,检出率为53.3%,PBMCs中HBV cccDNA检出率与HBeAg阳性率、血清ALT水平及血清HBVDNA载量均无显著相关性。在16例HBV cccDNA检出者中,B基因型5例,占31.3%,C基因型11例,占68.8%,与血清HBV基因分型结果一致。但是,与血清HBV均检出耐药突变株不同,16例PBMCs cccDNA中检出的病毒均是无核苷(酸)类似物耐药相关突变的野生株。结论在经核苷(酸)类似物治疗的慢性乙肝患者血清中HBV DNA产生耐药突变的情况下,PBMCs中HBV cccDNA仍以原始野生株为优势种群,推测PBMCs可能是体内HBV野生株的"存储库"。     

单引物耐热链替代扩增HBV X区方法的初步探讨

目的 :以HBVX区为模型 ,对单引物耐热链替代扩增 (SDA)反应的影响因素进行初步探讨。SDA是一种等温的体外核酸扩增技术 ,其主要依据限制性内切酶识别并切割半硫酸磷酸化DNA未修饰链 (即打缺口 )以及 5′→ 3′外切酶缺陷的DNA聚合酶在切口处聚合延伸并替代下游链的特性 ,这种“打缺口—聚合 替代”不断循环往复 ,达到靶序列的扩增。方法 :以HBV为模型 ,设计一条典型的SDA引物 (含 5′悬端、BsoBⅠ酶切位点及 3′端靶序列互补区 ) ,采用耐热BsoBⅠ BstDNA聚合酶 5 3℃恒温反应体系 ,微孔板杂交检测最终产物。结果与结论 :对SDA反应的重要的影响因素进行了初步探讨 ,并实现了SDA对模板的线性扩增     

HBV—DNA套式一次PCR方法的建立

应用乙型肝炎病毒ＤＮＡ Ｃ基因区的一对外引物（ＨＢＣ１和ＨＢＣ２，护增片段长度为５６６ ｂｐ）及一对内引物（ＨＢＣ３和ＨＢＣ４，护增片段长度为３０１ ｂｐ）对不同稀释度的ＨＢＶ－ＤＮＡ（ａｄｒ亚型）进行套式一次ＰＣＲ扩增，结果表明灵敏度可达到１０ａｇ水平。此方法快速、简便、灵敏、特异，与分子杂交的灵敏度相当。     

HBV(ayw)转基因小鼠HBV复制中间体的检测

目的建立稳定、高灵敏度化学发光Southern blotting检测系统,检测HBV(ayw)转基因小鼠肝脏及其他组织的HBV复制水平。方法采用地高辛标记HBV探针,利用pTHBV1047质粒检测杂交系统的灵敏度及重复性;提取第27代HBV(ayw)转基因小鼠肝、肾、脾和肌肉组织总DNA,经HindⅢ酶切后电泳、转膜,利用高灵敏度化学发光杂交Southern blotting检测各组织中HBV复制中间体的水平。结果地高辛标记的化学发光检测系统灵敏度达0.1pg,且杂交系统稳定可靠。HBV(ayw)转基因小鼠基因组DNA中检测到整合的外源HBV DNA,但低于HepG2.2.15细胞的HBV复制水平。肝、肾、脾和肌肉组织中都有HBV复制中间体存在,以肝组织中含量最高。结论第27代HBV(ayw)转基因小鼠染色体含有稳定的HBV基因整合,为复制型HBV转基因小鼠。     

定量聚合酶链反应检测HBV感染患者血清HBV DNA的临床意义

采用信号引物能量转换定量聚合酶链反应（PCR）检测104例不同HBV感染患者血清HBV DNA含量。结果：不同HBV感染患者HBV含量范围在10^4.49-10^9.93拷贝／ml，其中急性乙肝含量显著低于慢性乙肝、乙肝后肝硬变和原发性肝癌患者的含量（P＜0.05和P＜0.01)；HBeAg( )患者的含量显著高于HBeAg(-)／抗－HBe( )患者的含量（P＜0.001)；相关分析显示：血清HBV DNA含量与血清ALT水平无明显相关。结论：HBV感染的慢性化可能与血清HBV DNA含量高有关，肝损伤与血清HBV DNA含量无明显关系；e系统血清传换后，HBV并未停止复制，只是复制水平降低，应用定量PCR检测血清HBV DNA含量有助于HBV感染患者预后的判断和重新评价HBV感染的自然史及HBVM的临床意义。     

肝功能正常的慢性乙肝病毒感染者肝组织病理分析

目的：分析肝功能正常的慢性乙肝病毒感染者肝组织病理变化情况。方法：选择肝功能正常的慢性乙肝病毒感染者244例,进行肝穿刺病理检查、肝功能、血清HBV-DNA及乙肝血清学标志物检测。根据HBeAg、HBV-DNA检测结果,分析其与肝组织炎性分级、分期的关系。结果：244例中,炎症分级（G）≥2者48例,占19.7%;纤维化分期（S）≥2者54例,占22.1%;HBeAb组病理炎症分级及纤维化分期均显著或非常显著重于HBeAg组（P〈0.05,P〈0.01）;HBV-DNA阴性组和HBV-DNA阳性组肝组织炎症分级和纤维化分期差异不显著（P〉0.05）。结论：多数肝功能正常的慢性乙肝病毒感染者有一定程度的肝组织损害,部分患者需抗病毒等治疗。     

接受拉米夫定治疗的慢性乙肝患者HBV反转录酶区新变异rtM204Q的表型特点分析

目的分析乙肝病毒(HBV)反转录酶(RT)区YMDD功能域新变异rtM204Q的表型特点。方法从1例接受拉米夫定(LAM)治疗的慢性乙肝患者血清中提取HBV DNA,扩增HBV全长RT区基因,PCR产物直接克隆到pGEM-Teasy载体中,随机挑选40个克隆进行DNA序列测定并分析耐药相关变异。将Xho I/Sph I双酶切后的RT片段与载体连接成含HBV 1.1倍基因组长度的重组载体。采用FuGENE HD试剂盒,将构建的含野生株和变异株的重组载体转染至人肝癌细胞系HepG2细胞。转染4h后加入不同浓度的核苷(酸)类药物[LAM终浓度为0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L;阿德福韦酯(ADV)终浓度为0、0.033、0.1、0.33、1、3.3μmol/L;恩替卡韦(ETV)终浓度为0、0.001、0.01、0.1、1、10μmol/L;替诺福韦酯(TDF)终浓度为0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L],隔天换药,连续作用4d后收集细胞上清,采用实时荧光定量PCR技术检测不同药物浓度下HBV DNA的复制水平,以分析变异株的表型特点。结果对从患者血清获得的37个克隆进行测序分析,结果显示13个(35.1%)为野生型,11个(29.7%)为rtM204Q突变型,2个(5.4%)为rtM204I突变型,10个(27.0%)为rtA181T突变型,1个(2.7%)为rtA181T+rtM204Q突变型。后4种变异株的复制力分别是野生株复制力的89.95%、46.28%、55.77%和34.44%(P<0.05)。前2种变异形式的表型耐药分析结果显示,rtM204Q对LAM的敏感性为野生株的1/75.68,而rtM204I对LAM的敏感性不及野生株的1/1000。rtM204Q和rtM204I株对ADV、ETV和TDF均敏感。结论 HBV RT区新的YQDD基序变异在一定程度上抑制病毒复制力,对LAM的敏感性降低,提示这可能是一个新的LAM耐药相关变异。     

HBsAg阳性母亲死胎肝组织中 HBV表达

目的探讨乙型肝炎病毒通过产妇传播在胎儿肝组织中表达的情况。方法采用我院行中期妊娠引产,HBsAg阳性产妇分娩的死胎30例。取肝组织用SP法检测死胎肝组织中HBcAg。结果孕妇血清乙型肝炎标志物小三阳及大三阳的母亲分娩的死胎肝组织中HBcAg阳性,分别为5/12(41.6%)及14/18(77.8%)。两者HBcAg阳性率比较,有显著性差异(P<0.01)。结论母亲静脉血乙型肝炎标志物大三阳是乙型肝炎病毒通过母婴传播在胎儿肝组织中表达的高危因素。     

用原位聚合酶链反应检测肝癌石蜡包埋组织中的HBV—DNA

为研究乙型肝炎病毒(HBV)感染和肝细胞癌(HCC)之间的关系,我们建立了原位聚合酶链反应(ISPCR)并检测26例HCC石蜡包埋组织中的HBV—DNA。结果显示,HBV DNA在肝癌组织和癌旁肝组织的阳性率分别为84.6％(22/26)、91.3％(21/23)。ISPCR技术既显示了PCR技术的高敏性和特异性,又能在细胞内定位,是研究HBV与HCC关系的一项有价值的技术。     

乙型肝炎患者不同血清标志物HBV DNA的表达及意义

 目的探讨血清HBV DNA水平与HBV标志物(HBVM)表现模式的相关性.方法血清HBV DNA定量检测采用PCR ELISA法,HBVM采用ELISA法.结果在HBVM阳性的366例血清中,有199例HBV DNA阳性,占54.4%.血清HB-/ml占65.2%;HBsAg、抗-HBe、抗-HBc阳性者HBV DNA-HBc阳性者HBV DNA阳性率占95.2%,≥106 copiessAg、HBeAg、抗阳性率占29.1%,≥106 copies/ml占17.6%.结论血清HBVM阳性患者中约55.0%的血清HBV DNA阳性,且HBeAg阳性患者中HBV DNA含量及阳性率均明显高于抗-HBe阳性者;在抗-HBs、抗-HBc阳性或HBsAg阴性者血清内也有HBV DNA阳性者.     

慢性乙型肝炎患者血清HBV全长序列分析及复制力评价

目的 分析乙型肝炎患者HBV全长基因组序列并对其复制力进行评价.方法 从慢性乙型肝炎患者血清中提取HBV病毒DNA,PCR扩增HBV全长基因组,克隆到pGEM-Teasy载体中,每个样品挑选5～10个克隆测序,分析基因型以及全长基因组耐药相关的突变位点,并对个别位点进行定点突变.将克隆到pGEM-Teasy载体中的全长HBV基因组经BspQ Ⅰ/Sca Ⅰ双酶切后,转染入肝癌细胞系HepG2、Huh7.转染3d后榆测上清HmAg表达量及细胞内HBV复制中间体核心颗粒DNA载量,分析全长HBV基因组的复制力(1.0倍HBV复制模型).结果 从2份慢性乙型肝炎患者血清中成功获得5条HBV全长克隆,来自同一份血清的克隆核苷酸,其一致性为98%～100%,提示HBV存在准种特性.测序结果 表明5条HBV全长基因均为C型.通过定点突变又获得3个全长克隆.经序列分析发现,HBV反转录酶区存在A181V/S、L229M、V84M、M204I氨基酸位点的突变,前C/C区存在T1753C、A1762T、G1764A和G1896A核苷酸位点的突变.复制力分析提示上述位点突变后病毒复制力均有不同程度下降,L229M还可以进一步降低A181V突变株的复制力.结论 自行建立的无载体1.0倍HBV复制模型可在细胞内分泌抗原蛋白以及装配子代病毒,完成生活周期,这为下一步分析HBV的耐药表型打下了基础.此外,还可指导临床制定更加合理的抗病毒策略,筛选针对已出现或将来可能出现的耐药突变的新型抗病毒药物.     

慢性乙型肝炎及其合并脂肪肝患者各级纤维化声触诊组织量化技术测值的对比研究

目的:探讨脂肪肝对乙型肝炎(乙肝)患者声触诊量化技术(VTQ)测值的影响。方法:回顾性分析行肝穿刺活检的311例慢性乙肝患者VTQ值和311例慢性乙肝合并脂肪肝患者VTQ值。根据肝纤维化病理分级分别对上述2类患者分组(S0、S1、S2、S3、S4),并对其同级别纤维化的VTQ均值行独立样本t检验。结果:慢性乙肝患者无肝纤维化分级S0级,其S1~S4级的VTQ值与慢性乙肝合并脂肪肝相比差异均无统计学意义(均P0.05)。结论:慢性乙型肝炎与慢性乙型肝炎合并脂肪肝患者同级别纤维化VTQ值无明显差异。     

乙肝病毒相关的慢性肝病中病毒血清标志物状态分析

目的调查分析乙肝病毒（HBV）相关的慢性肝病（CLD）[包括慢性乙型肝炎（CHB）、肝硬化（LC）、肝细胞癌（HCC）]中HBV血清标志物不同状态的构成比及其临床意义。方法对2006年1月-2007年12月于广州南方医院住院的2 482例CLD患者的临床资料进行统计分析。结果1 226例CHB中,HBeAg阳性、HBeAg阴性的病例分别占64.4%、35.6%;362例LC和894例HCC中,HBeAg阳性、HBeAg阴性、HBsAg阴性的病例分别占27.1%、66.0%、6.9%和16.4%、75.1%、8.5%。对每一种CLD而言,血清标志物不同状态的男女构成比无显著差异;HCC的男女比值显著高于CHB和LC。CHB中,HBeAg阴性患者的平均年龄显著高于HBeAg阳性者;而LC、HCC中,不同血清标志物状态的患者平均年龄均无显著性差异。HBeAg阴性与HBeAg阳性的CHB病例中,丙氨酸转氨酶（ALT）各区段构成比无显著性差异;而在LC、HCC中,随着HBeAg阳性、HBeAg阴性、HBsAg阴性方向的变迁,ALT低水平区段的构成比均逐渐增加。结论HBV血清标志物状态在慢性肝病中存在着不同的构成比并具有相应的临床意义。     

终末期肝病患者HBV xDNA检测及其意义

目的：探讨HBVxDNA与终末期肝病的关系。方法：收集肝癌肝硬化等不同肝病患者血清及肝组织标本，提取标本核酸，经PCR扩增HBVxDNA，琼脂糖电泳显示产物，Southern—blot杂交验证PCR扩增的可靠性。结果：49例血清中检出HBVxDNA22例，肝组织中检出34例。HBsAg阳性及阴性患者中，血清检出率分别为66．7％及18．2％（P〈0．01），肝组织检出率分别为81．5％及54．5％（P〈0．01）。20例血清和组织中可同时检测到HBVxDNA，14例仅在肝组织中检出，2例仅见于血清中。结论：HBVxDNA与终末期肝病的发生密切相关。