干细胞样肝原始细胞的体外分化

目的：探讨干细胞样肝原始细胞集落体外分化的潜能。方法：分离孕13.5d的C57BL／6小鼠胎肝组织细胞并培养，第2天出现圆形成椭圆形干细胞肝原始细胞集落，随机挑取边界清楚的细胞集落分别培养，利用倒置相差显镜连续观察细胞生长过程中的形态学变化并用显微摄影记录结果，最后利用免疫细胞化学分析鉴定分化后细胞的性质。结果：干细胞样肝原始细胞集落在体外培养时可形成类似肝小叶的形状，集落中央大部分细胞分化成双核细胞，集落周边细胞仍为单核细胞，但体积明显增大，整个集中的细胞呈放射状排布。分化后，细胞群中的部分细胞表达成熟肝细胞标志白蛋白（albumin)，少部分细胞表达胆管上皮细胞标志细胞角蛋白19（cytokeratin19,CK19)，但所有细胞均不表达低分化肝细胞标志α－甲胎蛋白（α-fetoprotein,AFP)。结论：干细胞样肝原始细胞在体外具有我向分化能力，可分化为表达成熟肝细胞的胆管上皮细胞标志的细胞。     

胰腺成体干细胞的体外培养和鉴定

目的:用目前常用的干细胞分离方法对正常SD大鼠的胰腺成体干细胞进行分离、培养和鉴定,为胰腺癌干细胞的进一步研究奠定基础.方法:选取正常SD大鼠胰腺用胶原酶P消化分离,并用低血清无糖培养基纯化胰腺细胞,以RT-PCR,免疫组化和Western blot方法鉴定胰腺成体干细胞标志物巢蛋白(nestin)并通过RT-PCR证明细胞中存在ABCG2(ATP-binding cassette superfamily G member 2).结果:成功分离到所需胰腺成体干细胞,并通过以上3种方法证明分离所得细胞表达巢蛋白.结论:以胶原酶P作为消化液,低血清无糖培养作为分离方法能够成功的从正常胰腺中分离得胰腺成体干细胞.     

成体干细胞体外培养的安全性研究进展

一直以来,干细胞都是医学领域的研究热点,随着对干细胞特性的逐步认识,干细胞技术得到了突飞猛进的发展,在再生医学与组织工程等方面具有不可替代的应用前景。但是,随着研究的深入,人们发现多数肿瘤的发生与干细胞有着一定的关系,肿瘤细胞     

小鼠骨髓间质干细胞的体外培养与多向分化潜能的鉴定

【目的】建立小鼠骨髓间质干细胞（MSC）体外培养、纯化、扩增方法,并进行体外定向诱导条件下的多向分化潜能鉴定。【方法】取3～18月雄性C57BL/6J小鼠（共48只）骨髓细胞,贴壁培养后,用免疫磁珠法纯化,观察纯化后的细胞形态,对3、10、20代的MSC进行细胞生长曲线绘制;并检测细胞在不同诱导条件下向成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞的分化能力。【结果】小鼠MSC在体外可以诱导成成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞。MSC连续传代培养达30代以上,细胞的形态、抗原表达无改变,并保持多向分化潜能。【结论】该方法获得的MSC具有高度增殖、多向分化潜能、生物学特性稳定的特点。     

小鼠骨髓间质干细胞的体外培养与多向分化潜能的鉴定

 【目的】 建立小鼠骨髓间质干细胞(MSC)体外培养?纯化?扩增方法,并进行体外定向诱导条件下的多向分化潜能鉴定?【方法】 取3～18月雄性C57BL/6J小鼠(共48只)骨髓细胞,贴壁培养后,用免疫磁珠法纯化,观察纯化后的细胞形态,对3?10?20代的MSC进行细胞生长曲线绘制;并检测细胞在不同诱导条件下向成骨细胞?脂肪细胞?肌肉细胞的分化能力?【结果】 小鼠MSC在体外可以诱导成成骨细胞?脂肪细胞?肌肉细胞?MSC连续传代培养达30代以上,细胞的形态?抗原表达无改变,并保持多向分化潜能?【结论】 该方法获得的MSC具有高度增殖?多向分化潜能?生物学特性稳定的特点?     

小鼠胚胎干细胞体外发育分化模型

胚胎干细胞 (Embryonicstemcell ,EScell)是多潜能性细胞 ,它在体外既可维持不分化而无限增殖 ,又能参与胚胎发育分化为各种类型细胞和组织而形成器官 ;小鼠ES细胞可供的数量大、在体外培养条件可进行精确调控、实验比较经济加上现代基因及其他生物操作等技术 ,因此小鼠ES细胞体外发育分化系统被广泛地作为模型系统加以利用。小鼠ES细胞体外发育分化研究为推动其他哺乳类动物以及人的ES细胞研究 ,从而将更好地进行细胞、组织工程实验为人类细胞组织和基因治疗服务创造了有利条件。本文将ES细胞体外发育分化情况加以概述 ,以便更好地开展ES细胞体外研究     

皮肤干细胞体外培养与诱导分化

目的 探讨新生儿皮肤干细胞(ESCs)的培养方法,并研究新生儿皮肤干细胞的增殖及诱导分化.方法 用两步酶消化法分离新生儿脐带获得角质形成细胞,采用Ⅳ型胶原快速黏附法筛选ESCs并培养.在含细胞因子的条件培养基中加入人头发组织或猪软骨组织作为诱导物,对增殖的ESCs进行体外诱导培养,观察ESCs的分化状况.结果 培养的新生儿ESCs有克隆状生长现象,角蛋白K19免疫组化染色阳性,培养初期细胞有向毛发的毛根和毛干为中心聚集生长现象,并逐步分化成类似毛皮质的结构.结论 新生儿ESCs在含毛发组织为诱导物的条件培养基中逐步分化成类似毛干皮质的组织结构,这为体外构建毛发组织工程奠定了一定的理论基础.     

胎鼠、新生鼠和成年鼠神经干细胞的体外增殖和分化

目的比较个体发育不同阶段所得神经干细胞的体外增殖和分化情况。方法常规的神经干细胞分离培养方法，用免疫细胞化学方法鉴定细胞。结果从胎鼠所得的神经干细胞增殖能力最强，新生鼠的次之，成年鼠的较差。神经干细胞的分化更多地决定于培养条件。结论个体发育不同阶段所得的神经干细胞有不同的生物学特性。     

胚胎干细胞体外诱导分化的研究进展

自1981年英国的Evans等和美国的Martini21相继从小鼠囊胚的内细胞团分离建立胚胎干细胞系以来，胚胎干细胞体外诱导分化的研究就一直是各国学者感兴趣的课题。目前，已从胚胎干细胞体外诱导出卵黄囊、血岛、神经细胞、心肌细胞、血管和内皮等结构及细胞。利用胚胎干细胞体外诱导分化的成果可望发展出治疗多种疾病的新方法，将在人体早期发育、基因功能、药物开发、细胞治疗和组织器官替代治疗中发挥重要作用，并成为组织器官移植的新资源。[第一段]     

大鼠神经干细胞体外培养及分化

神经干细胞的研究是最近几年来神经科学及胚胎发育学的热点问题。人们通常认为成年哺乳动物的中枢神经系统组织是不可再生的，中枢神经系统损伤或神经系统退行性病变将只能由神经胶质爬行替代，遗留难以弥补的神经系统功能缺损。而神经干细胞特别是在成年哺乳动物中枢神经系统中发现的神经干细胞对以上观点产生了巨大的冲击。随着神经干细胞的研究深入，必将为神经系统损伤性、退行性疾病的彻底治愈，甚至神经移植治疗带来一次革命性突破。     

大鼠肝卵圆细胞的增殖模型建立和体外分离培养、诱导分化研究

目的 建立大鼠肝卵圆细胞(HOC)的增殖模型,探讨分离培养及鉴定HOC的方法.方法 采用2-乙酰氨基芴/部分肝切除术刺激建立成体大鼠肝卵圆细胞增殖模型,于肝切除术后第12天切取剩余肝脏,使用胶原酶Ⅳ消化分离和Percoll梯度离心纯化肝卵圆细胞,免疫荧光技术和KT-PCK分析法检测肝卵圆细胞标志物mRNA表达.行体外培养并添加干细胞生长因子(SCF)、肝细胞生长因子(HGF)和表皮生长因子(EGF)诱导其分化.结果 分离得到的肝卵圆细胞存活率达到90%,经c-kit免疫荧光显色,PCR 分析显示有CK19和白蛋白mRNA表达.生长因子诱导下有向胆管细胞和肝细胞分化的特性.结论 肝卵圆细胞分离纯化及鉴定方法和肝卵圆细胞成功培养,为进一步研究肝干细胞生物学特性和与肝癌的关系提供了物质基础.     

大鼠成体肝卵圆细胞分离培养及诱导分化的初步研究

目的 通过成体大鼠肝卵圆细胞分离培养获取纯净的干细胞并观察诱导分化前后从肝卵圆细胞到肝细胞的形态变化.方法 采用AAF/PH肝干细胞刺激模型,胶原酶Ⅳ消化分离和Percoll梯度离心纯化肝卵圆细胞的方法,用地塞米松、DMSO和EGF、HGF、SCF、LIF等生长因子联合应用诱导肝卵圆细胞增殖和分化为肝实质细胞.观察肝卵圆细胞到肝细胞形态变化过程,用免疫荧光技术,Western blotting分析检测了干细胞标志c-kit和RT-PCR分析法检测肝干细胞白蛋白和CK19 mRNA表达鉴定卵圆细胞.结果 分离得到的肝卵圆细胞活度达到90%,细胞形态包括大小和颜色呈不均质,卵圆细胞直径是肝细胞直径的1/4～1/6.诱导后出现大而圆的肝细胞,可见卵圆细胞到肝细胞的中间变化过程,新分离的肝卵圆细胞在生长因子诱导下有向肝细胞分化的特性.经c-kit免疫荧光染色显黄绿色荧光,Western blotting检测肝卵圆细胞有c-kit蛋白条带,而大鼠肝细胞及胆管细胞则未出现条带.PCR分析显示卵圆细胞有CK19和白蛋白mRNA表达.结论 新分离的肝卵圆细胞同时表达c-kit,CK19和白蛋白3种抗原,诱导分化出现一系列从卵圆细胞到肝细胞的形态学变化,这种现象证明分离的肝卵圆细胞就是肝干细胞,经诱导分化可以产生成熟的肝细胞,成为进一步研究肝干细胞生物学特性的基础.     

成鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的:探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养和向神经元样细胞分化的能力.方法:利用Percoll分离液(1.073×103g/L)梯度分离成年大鼠MSCs,采用3种不同的方法对其诱导分化,免疫细胞化学方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、星形胶质细胞特异性标志(GFAP)和神经前体细胞(Nestin)的表达.结果:成功进行了成年大鼠MSCs的原代和传代培养,3种诱导方法均能使MSCs分化为神经元样细胞,都能表达NSE、NF和Nestin,而不表达GFAP.结论:MSCs能在体外分离、扩增、传代,并能向非间充类细胞分化.     

小鼠神经干细胞的分离培养

目的 探讨小鼠神经干细胞的体外分离培养方法。方法 采用贴壁培养法,从成体小鼠大脑皮层分离并体外培养成体小鼠大脑皮层细胞,制成细胞悬液后将其置入DMEN/F12(1:1)液(包括15％FCS,bFGF20ng/ml,青霉素100u/ml和链霉素100u/ml)培养,获得细胞克隆。应用免疫组织化学技术检测克隆细胞巢蛋白(Nestin)的表达。结果原代及传代培养的细胞均可持续分裂增殖形成细胞克隆;克隆细胞表达巢蛋白(Nestin)。结论 分离的细胞在体外具有很强的增殖能力和自我更新能力,表达Nestin的为中枢神经系统的干细胞。     

Development of bone marrow mesenchymal stem cell culture in vitro

Objective  To review the in vitro development of bone marrow mesenchymal stem cells culture (BM-MSC).

Data sources  The data cited in this review were mainly obtained from articles listed in Medline and PubMed. The search terms were “bone marrow mesenchymal stem cell” and “cell culture”.

Study selection  Articles regarding the in vitro development of BM-MSCs culture, as well as the challenge of optimizing cell culture environment in two-dimensional (2D) vs. 3D.

Results  Improving the culture conditions increases the proliferation and reduces the differentiation. Optimal values for many culture parameters remain to be identified. Expansion of BM-MSCs under defined conditions remains challenging, including the development of optimal culture conditions for BMSC and large-volume production systems.

Conclusions  Expansion of BM-MSCs under defined conditions remains challenges, including the development of optimal culture conditions for BMSC and scale-up to large-volume production systems. Optimal values for many culture parameters remain to be identified.

     

人胎肝干细胞体外分离培养及脾内移植的初步研究

目的 将人胎肝于细胞脾内移植2/3肝切除的严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠,观察其在受体小鼠内定植、迁移及分化的可行性.方法 ①以临床上自然流产废弃的孕期16～24周健康胎肝为供体,分离纯化胎肝干细胞,并行光镜、电镜观察及免疫细胞化学和流式细胞检测鉴定.②人胎肝干细胞经脾内移植到2/3肝切除的SCID小鼠.③免疫组化检测15、30、60、90 d受体小鼠脾脏和肝脏的人Hepatocyte、α1-AT、AFP的定位和表达.PAS染色检测受体小鼠各时间点脾脏组织糖原表达.④RT-PCR检测30、60、90 d受体小鼠脾脏组织AFP和白蛋白(Alb)基因的表达.结果 ①镜下观察分离细胞体积较小、约为肝细胞的1/6～1/3,核与浆比例大,内质网、线粒体和核糖体不发达.免疫细胞化学和流式细胞检测分别显示分离的人胎肝干细胞表达AFP、Thy-1、C-kit和CD34、CK19.②各时间点免疫组化均可检测到肝干细胞移植小鼠的肝脏和脾脏组织人Hepatocyte、α1-AT和AFP阳性表达.PAS染色显示各时间点受体小鼠脾脏组织不同程度的糖原表达.③人胎肝干细胞移植后30、60、90 d受体小鼠脾脏组织表达人AFP和Alb基因.结论 人胎肝干细胞经脾内移植可在异体内存活、定植并向受体受损肝脏迁移,在受体内增殖和定向分化为肝细胞.     

大鼠表皮干细胞的分布与体外分离培养

目的 研究大鼠表皮干细胞的分布与体外分离培养.方法 用免疫组织化学技术研究大鼠表皮干细胞的分布;用DispaseⅡ、胰酶二步法消化新生大鼠皮肤,获得单细胞悬液,Ⅳ型胶原筛选,体外培养大鼠表皮干细胞,进行免疫组化鉴定,荧光标记流式细胞仪分析.结果 在表皮基底层、毛囊外根鞘区α 6-integrin、K15等表皮干细胞标记物染色阳性,而分化指标CD71染色阴性;CD34在表皮基底层阴性表达,而在毛囊隆突区阳性表达;体外分离的基底层表皮干细胞生长良好,具有较高的克隆形成率;干细胞标记物α 6-integrin、 K15呈阳性表达,流式细胞仪检测α 6-integrin达到84%,说明较为成功地体外分离培养出大鼠表皮基底层干细胞.结论 在表皮基底层、毛囊外根鞘区存在表皮干细胞.     

大鼠脂肪间充质干细胞体外培养及其分化研究

目的:建立大鼠脂肪间充质干细胞体外分离培养体系并研究其多向分化潜能。方法:取6周龄大鼠双侧腹股沟和附睾处脂肪,酶解法分离培养原代脂肪间充质干细胞,绘制第三代细胞生长曲线。成脂诱导4 d,成骨诱导培养18 d,分别通过油红O染色、碱性磷酸酶活性检测和钙盐沉积VonKossa染色来观察细胞成脂、成骨表型转化。结果:大鼠脂肪中能分离培养出一定量的脂肪间充质干细胞,其群体倍增时间为(60±3.2)h。在成脂诱导培养液作用下可分化为脂肪细胞;成骨诱导培养液作用下,可特异性表达成骨分化标志碱性磷酸酶,同时也具有矿化细胞外基质的能力。结论:脂肪间充质干细胞具有易于取材、大量分离培养和定向诱导成骨分化的特点,是骨组织工程理想的种子细胞的来源。     

成人体皮表皮干细胞的定位及分离培养

目的:研究表皮干细胞在成人体皮中的分布及其分离和培养.方法:用免疫组织化学方法检测成人体皮中β1整合素及角蛋白19的表达,对成人体皮中的表皮干细胞进行定位和定量;用Ⅳ型胶原分离培养成人体皮表皮干细胞,通过检测β1整合素及角蛋白19的表达水平及克隆形成率(以角质细胞为对照)对其进行鉴定.结果:β1整合素及角蛋白19的免疫组化阳性信号主要位于表皮的基底部及毛囊周围,阳性细胞在表皮中所占的数量较少,且在真皮中也有少量表达.体外培养,可见细胞呈克隆样生长、β1整合素及角蛋白19免疫组织化学染色呈阳性,且其克隆形成率为17.17%,明显高于对照组的6.83%(P＜0.05).结论:应用Ⅳ型胶原快速贴附法及成人成纤维细胞条件培养液,对成人体皮中表皮干细胞成功进行了分离培养,为表皮干细胞体外的大量扩增奠定了基础.