蛋氨酸脑啡肽对树突状细胞表型及功能的影响

目的:通过体外细胞株研究蛋氨酸脑啡肽(Methionine-enkephalin,MENK)对树突状细胞(Dendritic cell,DC)功能调节的机制,为进一步阐明蛋氨酸脑啡肽的免疫活性提供依据。方法:应用扫描电镜技术、酸性磷酸酶活性检测、流式细胞仪检测技术、酶联免疫吸附试验检测DC表型和功能的各种指标。结果:本实验应用小鼠髓系DC2.4细胞株,电镜观察DC的超微结构,可见10-12mol/L蛋氨酸脑啡肽处理组DC突起增多,形态上更加成熟;DC表面MHCⅡ、CD86和CD40的表达增加;酸性磷酸酶活性降低;DC白细胞介素12(IL-12)的表达增加(P0.05)。结论:本实验结果证明了适宜浓度的蛋氨酸脑啡肽促进小鼠髓系DC2.4的表型及功能的成熟。     

猪苓多糖刺激/诱导小鼠树突状细胞成熟

研究猪苓多糖对小鼠骨髓树突状细胞(DC)表型及功能成熟的影响。从小鼠骨髓中分离单个核细胞(MNC),用rmGM-CSF、IL-4培养5 d后,实验组加入猪苓多糖(50μg/ml),空白对照组加等量RPMI 1640,阳性对照组加LPS(1μg/ml),3组分别同时作用48 h。扫描电镜观察其体外培养过程中的形态特征,流式细胞仪(FACS)分析其表型特征,混合淋巴细胞反应(MLR)检测其功能。用猪苓多糖刺激的小鼠骨髓MNC具典型的DC形态;细胞表达I-A/I-E、CD11c和分泌IL-12能力比空白对照组增加,具有极强的激发MLR的能力,显示成熟DC的特征。猪苓多糖可以促进体外培养的小鼠骨髓DC的成熟,促进DC诱导的免疫应答启动。     

阿司匹林对树突状细胞成熟及免疫功能的体外研究

研究阿司匹林在体外对小鼠树突状细胞(mDC)成熟及免疫功能的影响。在骨髓来源未成熟树突状细胞培养过程中,加入不同剂量(1mmol/L、2mmol/L)的阿司匹林,观察DC形态。流式细胞仪检测各组mDC表面共刺激分子CD86、CD80的表达;台盼蓝染色测细胞活力;混合淋巴细胞反应(MLR)检测mDC对T淋巴细胞刺激能力;ELISA法检测MLR上清液中细胞因子。与对照组比,阿司匹林处理的DC(aspirin-DC)表面CD80、CD86表达明显降低(P<0.01);对T淋巴细胞刺激能力减弱;MLR上清液中炎性因子(TNF-α、IL-1β)明显减少(P<0.01)。结果:在体外培养过程中给予阿司匹林干预能够抑制mDC的成熟及功能,呈剂量依赖性;阿司匹林对DC功能的抑制可能是阿司匹林抑制炎症反应,治疗冠心病的机制之一。     

大鼠外周血及骨髓来源树突状细胞的培养及鉴定

目的培养及鉴定大鼠外周血及骨髓来源树突状细胞(DC)。方法分离大鼠外周血及骨髓单个核细胞,加入20 ng/m L粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、10 ng/m L白细胞介素4(IL-4)培养10 d。流式细胞术检测CD80、CD86、主要组织相容性复合体Ⅱ(MHCⅡ)、整合素分子OX62的表达确定未成熟DC。成熟的DC在加入以上剂量的GM-CSF、IL-4处理基础上,再加入4μg/L肿瘤坏死因子α(TNF-α)处理,流式细胞术检测CD80、CD86、MHCⅡ、OX62的表达,光镜及透射电镜检测细胞形态。结果流式细胞术检测结果表明,外周血来源的DC OX62表达较高、骨髓来源的DC的OX62表达较低,经TNF-α诱导后,外周血来源的成熟DC和骨髓来源的成熟DC的OX62水平均明显增加。两种方法提取的DC光镜下形态无差别,电镜下可见外周血来源的成熟DC的突起明显多于骨髓来源的成熟DC。结论外周血更容易获得和诱导高纯度的成熟DC。     

不同细胞因子诱导的小鼠骨髓树突状细胞亚群与小鼠脾脏树突状细胞亚群的比较

目的对粒-单集落刺激因子(GM-CSF)/白介素4(IL-4)或脱氧氟胸腺嘧啶配体(Flt3-L)体外诱导的小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)亚群和正常小鼠脾脏DC亚群进行比较,探索诱生DC的特性。方法分离Balb/c小鼠骨髓细胞,分别加入含GM-CSF/IL-4或Flt3-L的培养液,体外培养7d,倒置显微镜观察细胞形态,并用流式细胞术检测CD11c、MHCⅡ、CD4、CD8α、CD45RA及Sirp-α分子;利用免疫磁珠从小鼠脾脏细胞中分离DC。结果两组细胞因子均可在体外诱导小鼠骨髓细胞分化发育为未成熟的DC;倒置显微镜下观察可见BMDCs表面有树突状突起,具有典型的DC形态学特点,与Flt3-L诱导的BMDC相比GM-CSF/IL-4诱导的DC体积大,树突长;但是,流式细胞术检测发现Flt3-L体外诱导的BMDCs与小鼠脾脏DC亚群更为相似。结论 GM-CSF/IL-4及Flt3-L均可在体外诱导小鼠骨髓细胞分化发育为DC,且Flt3-LDC亚群与脾脏DC亚群相似,有可能成为体外研究脾脏来源DC的一种方法。     

IL-17A 协同GM-CSF 和LPS 促进骨髓细胞衍生树突状细胞的分化和成熟研究

目的:探讨IL鄄17A 对小鼠骨髓细胞衍生树突状细胞分化和成熟的影响。方法:分离小鼠骨髓细胞,加入含GM-CSF(20 ng/ ml)RPMI1640 完全培基培养8 d,诱导小鼠骨髓单个核细胞向DC 分化,加入LPS(1 滋g/ ml)继续培养36 h,进一步诱导DC 成熟,同时在骨髓细胞衍生诱导DC 分化及成熟的不同阶段加入不同浓度的rmIL-17A(10、100 ng/ ml),采用流式细胞术检测DC 表面共刺激分子的表达,ELISA 方法检测DC 培养上清中IL-12p40 和IL-10 水平。结果:rmIL-17A 可促进GM-CSF 诱导骨髓细胞衍生DC 表面共刺激分子CD40、CD80、CD86 和MHC域的表达,且具有剂量依赖性,其中以高浓度rmIL-17A刺激组的CD40 及MHC域表达增加最显著;在LPS 诱导DC 成熟阶段加入rmIL-17A,骨髓细胞衍生DC 共刺激分子CD40、CD80、CD86 和MHC域的表达均明显增加,并且随着rmIL-17A 浓度的增加,CD86 和MHC域的表达水平也随之增高;同时与未加rmIL鄄17A 的对照组相比,低浓度rmIL-17A 组LPS 刺激骨髓细胞衍生DC 分泌IL-12p40 和IL鄄10 水平均显著增加(P <0.001),高浓度rmIL-17A 组IL-12p40 水平显著增高(P<0.001),但IL-10 水平没有变化。结论:IL-17A 可促进GM-CSF 诱导的骨髓细胞衍生DC 前体细胞表型发展,并能协同LPS 诱导骨髓衍生DC 的分化和成熟。     

小反刍兽疫病毒对鼠源树突状细胞成熟分化的影响

目的研究和探讨小反刍兽疫病毒(PPRV)对小鼠骨髓来源的树突状细胞(BM-DCs)成熟和分化功能的影响。方法从小鼠骨髓中分离得到DCs,经过IL-4和GM-CSF诱导成熟;流式细胞术检测DCs表面共刺激分子表达及吞噬FITC-Dextran的能力;ELISA检测细胞因子IL-6、IL-12p40、IL-1β和IL-10的表达水平。结果利用LPS和PPRV处理DCs 24 h,发现与阳性对照LPS组相比,PPRV作用后显著抑制了CD40和MHC-Ⅱ的表达(P<0.05);滴度适度的PPRV可以显著增加CD40、CD80和CD86的表达,显著升高IL-6和IL-10的分泌(P<0.05),吞噬FITC-Dextran的能力并无显著差异,各组之间也无影响,且不同比例的PPRV对DC存活率无显著影响(P>0.05)。结论 PPRV在一定滴度范围内具有潜在的促进小鼠DC成熟的功能,为免疫学研究奠定基础。     

尿酸对树突状细胞成熟及免疫功能的影响

 目的：观察尿酸（UA）对体外培养的小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDCs）成熟及免疫功能的影响。方法：体外分离培养小鼠骨髓来源的DC，使用GM-CSF、IL-4、LPS，并加入UA诱导培养DC。用流式细胞仪技术检测BMDCs细胞表面分子表达，用MTT法检测BMDCs与同基因小鼠T淋巴细胞的混合淋巴细胞反应；ELISA法测定DC培养上清IL-12的水平。结果：通过鉴定体外成功诱导培养出BMDCs。尿酸浓度为400mg/L或200 mg/L时能增强DC细胞表面CD11c、CD83、CD86、IA/IE分子表达率；提高IL-12分泌水平（P＜0.05）； DC与T淋巴细胞比例分别为5∶1、10∶1、20∶1时，能增强DC刺激T细胞增殖能力（P＜0.05）；尿酸浓度为70 mg/L时，细胞表面分子表达、IL-12分泌水平、刺激T细胞增殖作用与对照组比较均无明显差别（P＞0.05）。结论：对体外培养诱导扩增的BMDCs， UA可促进分化与成熟，提高表面共刺激分子表达；增强其刺激T细胞增殖能力和IL-12分泌水平。UA的作用与浓度密切相关。     

4种细胞因子组合方式对小鼠树突状细胞分化发育的影响

目的观察在体外培养时4种细胞因子(CK)组合方式对小鼠骨髓源树突状细胞(DC)分化、增殖、发育的影响.方法用不同的CK定向诱导小鼠骨髓细胞分化为DC,通过流式细胞仪(荧光抗体双标记法)测定CD11c+细胞比例、MHC-Ⅱ类分子的表达及在脂多糖(LPS)刺激后CD86表达的变化.结果GM-CSF+IL-3+SCF促进DC分化、增殖的能力明显高于其他3组(P＜0.05).该组CK所诱导的DC在LPS刺激后,CD86表达增加的幅度明显低于GM-CSF+IL-4组(P＜0.01).结论GM-CSF、IL-3和SCF对于促进小鼠骨髓细胞向DC定向分化、增殖有协同作用,分化后的DC多数处于发育早期,DC前体所占的比例较大.     

丁酸钠诱导的未成熟树突状细胞的免疫学功能研究

目的： 探讨丁酸钠对人外周血来源的树突状细胞（DC）的成熟状态和免疫学功能的影响。方法： 通过粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白细胞介素4（IL-4）结合丁酸钠体外诱导人外周血来源的DC，6 d后结合不同成熟因子诱导成熟，并以流式细胞仪、FITC标记的Dextran的内吞检测、混合淋巴细胞反应（MLR）、ELISA法分别检测DC的表面标志、内吞能力、DC刺激淋巴细胞增殖能力和白细胞介素12（IL-12）分泌量的改变。结果： 丁酸钠可以抑制DC成熟，使DC具有较强的抗原吞噬能力，而刺激淋巴细胞增殖能力和IL-12的分泌能力下降。结论： 丁酸钠可以抑制DC成熟，诱导不成熟DC生成，在移植免疫耐受方面具有较好的应用前景。     

转化生长因子β1抑制树突状细胞的成熟及下调TLR4的表达

目的：研究转化生长因子β1（TGF-β1）对小鼠来源树突状细胞（DC）功能的影响。 方法: 在培养体系中同时应用GM-CSF和TGF-β1培养的TGF β-DC，用脂多糖（LPS）观察其对外源刺激的反应，流式细胞仪（FCM）检测细胞表型，应用BrdU ELISA法通过96 h混合淋巴细胞反应（MLR）检测其同种异基因刺激能力，ELISA法测IL-12 p70的分泌水平，分别用半定量RT-PCR法和FCM检测Toll-like受体4（TLR4）表达。 结果: TGF β-DC与常规培养的未成熟DC（imDC）相比，CD80、CD86、I-Ab、CD40表达更低。LPS对TGF β-DC的促成熟作用反应不明显，其表面共刺激分子升高的幅度不大，异基因的刺激能力提高不显著，且IL-12 p70的分泌下降。RT-PCR与FCM都显示TGF β-DC较imDC弱表达TLR4。 结论: TGF β1能抑制DC共刺激分子的表达，TGF β-DC能抵抗LPS的促成熟作用，并可能与其TLR4表达下降有关。     

人外周血分离树突状细胞前体分离培养及其分化成熟过程中生物特征的变化

用从人外周血分离、纯化、扩增树突状细胞的方法,对树突状细胞成熟过程中的功能分化作初步探讨.以酵母菌、HRP吞噬实验测试树突状细胞的内吞能力;以同种混合淋巴细胞反应检测细胞的免疫刺激能力.结果显示,在GM-CSF或GM-CSF与IL-4联合培养2～3天后,树突状细胞无或仅有极弱的吞噬酵母菌能力,但能活跃内吞HRP.培养5天的树突状细胞内吞HRP能力减弱.但能有效的刺激T细胞增殖,GM-CSF与IL-4联合作用后的树突状细胞,其内吞HRP能力及刺激T细胞能力均强于单用GM-CSF培养的树突状细胞.由此可见,树突状细胞在分化成熟的不同阶段表现出不同的功能,GM-CSF与IL-4联合培养能明显增强树突状细胞功能.     

香加皮羽扇豆烷乙酸酯(CPLA)对树突状细胞分化成熟的影响

目的：探讨香加皮羽扇豆烷乙酸酯（CPLA）对人外周血单个核细胞（PBMC）来源的树突状细胞（DC）在体外分化成熟及免疫活性的影响。方法：从人外周血分离单个核细胞，与细胞因子GM—CSF、IL-4共培养，于第5天加入DC的促成熟刺激剂TNF-α（阳性对照组）或CPLA。倒置显微镜和透射电镜下观察DC的形态；应用流式细胞术检测成熟DC的表面标志CD1a、CD83、CD80和CD86的表达情况；用ELISA检测DC培养上清中IL-12和IFN-γ的含量；用MTT法测定DC刺激T细胞增殖的能力。结果：培养10d后，经CPLA刺激的PBMC呈现出典型DC的形态学特征；成熟DC的特征性表面分子CD1a、CD83、CD80和CD86表达水平均明显上调（P〈0．05）；细胞培养上清中IL-12和IFN-γ含量明显增高（P〈0．05）；刺激T细胞增殖的能力明显增强（P〈0．05）。结论：CPLA可诱导PBMC来源的DC分化成熟，并可促进其细胞因子的分泌，增强DC的免疫调节活性。     

Disease-modifying capability of murine Flt3-ligand DCs in experimental autoimmune encephalomyelitis

Dendritic cells (DCs) bridge the innate and adaptive immune response, are uniquely capable of priming na?ve T cells, and play a critical role in the initiation and regulation of autoimmune and immune-mediated disease. At present, in vivo expansion of DC populations is accomplished primarily through the administration of the recombinant human growth factor fms-like tyrosine kinase 3 ligand (hFL), and in vitro DCs are generated using cytokine cocktails containing GM-CSF +/- IL-4. Although hFL has traditionally been used in mice, differences in amino acid sequence and biological activity exist between murine FL (mFL) and hFL, and resultant DC populations differ in phenotype and immunoregulatory functional capabilities. This study developed and characterized mFL-generated DCs and determined the therapeutic capability of mFL DCs in the autoimmune disease experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Our findings demonstrate that mFL and hFL expand splenic DCs equally in vivo but that mFL-expanded, splenic DCs more closely resemble normal, resting, splenic DCs. In addition, a novel method for generating mFL-derived bone marrow-derived DCs (BM-DCs) was developed, and comparison of mFL with hFL BM-DCs found mFL BM-DCs to be less mature (i.e., lower MHC Class II, CD80, and CD86) than hFL BM-DCs. These immature mFL DCs up-regulated costimulatory molecules in response to maturation stimuli LPS and TNF-alpha. Mature mFL BM-DCs were immunogenic and exacerbated the clinical disease course of EAE.     

Analysis of the CCR7 expression on murine bone marrow-derived and spleen dendritic cells

About 40% of bone marrow-derived dendritic cells (BM-DCs) generated from stem cells of C57BL/6 (B6.WT) mice differentiate in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) without further stimuli to mature DCs. These cells are characterized by high levels of major histocompatibility complex class II, CD40, and CD86 on their surface. Recent studies have revealed that tumor necrosis factor (TNF) is crucial for maturation of BM-DCs. However, once matured, the phenotype of mature TNF-negative C57BL/6 (B6.TNF-/-) and B6.WT BM-DCs is comparable. Both expressed high levels of CD40 and CD86 and were positive for mRNA of the chemokine receptor (CCR)7. To extend our studies, we generated a monoclonal antibody (mAb) specific for mouse CCR7. This mAb allowed us to analyze the surface expression of CCR7 during maturation of B6.WT and B6.TNF-/- BM-DCs in the presence of GM-CSF and stimulated with TNF or lipopolysaccharide (LPS) and to compare it with the CCR7 expression on ex vivo-isolated splenic DCs with or without additional stimulation. Our results showed that CCR7 expression on murine BM-DCs is an indication of cell maturity. Incubation with LPS induced the maturation of all BM-DCs in culture but increased the number of mature CCR7+ splenic DCs only marginally.     

TRAF6在人PBMC来源的树突状细胞成熟中的作用

目的: 探讨肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)在不同成熟度树突状细胞(DCs)中的表达及其对DCs免疫刺激活性的影响。方法: 重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和重组人白细胞介素4(IL-4)体外诱导的人外周血单个核细胞来源的DCs,经TNF-α、LPS和细胞因子鸡尾酒法诱导成熟,分别以流式细胞术、ELISA和混合淋巴细胞反应(MLR)检测DCs的表面标志、IL-12分泌和刺激淋巴细胞增殖能力。Western blotting和real-time PCR分别检测各组TRAF6蛋白水平及mRNA的表达。结果: 各组DCs均表达TRAF6,成熟状态最佳的鸡尾酒诱导下DCs的TRAF6蛋白表达最高。高表达TRAF6的DCs可促进IL-12的分泌,增强刺激淋巴细胞增殖的能力。结论: TRAF6是调节DCs激活和成熟的关键因素。     

TLR5 ligation by flagellin converts tolerogenic dendritic cells into activating antigen-presenting cells that preferentially induce T-helper 1 responses

Dendritic cells (DCs) differentiated in the presence of IL-10 preferentially induce regulatory T-cells and tolerance. Whether the tolerogenic properties displayed by these DCs (Tol-DCs) can be overcome has not been fully explored. Here we show for the first time that Tol-DCs express higher levels of TLR5 mRNA, but not TLR4 or TLR9 mRNA relative to DCs differentiated with GM-CSF and IL-4 (BM-DCs). In response to flagellin, a natural TLR-5 ligand, Tol-DCs produced IL-12 but not IL-10. Unlike Tol-DCs stimulated with LPS, which produce high levels of IL-10 and fail to generate a cognate inflammatory response in CD4⁺ T-cells, flagellin-stimulated Tol-DCs promoted the differentiation of CD4⁺ T cells with a T-helper 1 phenotype. The divergent T-cell outcomes induced by Tol-DCs in response to different TLR-ligands highlights not only their plasticity, but also points to TLR5 ligation as a potential strategy to overcome tolerance in environments that are otherwise conducive to immune unresponsiveness.     

HCV C-Fc基因转染的小鼠树突状细胞促进混合淋巴细胞反应的作用

目的：观察HCVC-FC基因电穿孔法转染的小鼠树突状细胞(DC)功能的改变。方法：分离小鼠骨髓单个核细胞与rmGM-CSF和rmIL-4培养1wk，对培养的细胞进行形态学观察．并用FACS检测细胞表面DEC205的表达。以通过质粒pcD一NA3HCV C—Fc电穿孔法转染培养的DC，用间接免疫荧光染色测定转染细胞中HCV C—FC的水平；用混合淋巴细胞反应检测电穿孔法转染细胞的功能。结果：培养1wk后，得到具有典型DC形态的细胞，以质粒pcDNA3HCV c-FC为载体电穿孔法转染DC后，转染细胞中可检测到较高水平的HCVC—Fc2与对照组相比较以电穿孔法转染的细胞能明显刺激混合淋巴细胞反应：结论：小鼠骨髓单个核细胞加GM-CSF和IL-4培养1wk，可生成大量的DC。质粒pcDNA3HCV c-Fc转染培养的DC对T细胞刺激作用显著增强。     

Two populations of ovine bone marrow-derived dendritic cells can be generated with recombinant GM-CSF and separated on CD11b expression

Whereas studies on dendritic cells in rodents rely largely on bone marrow-derived dendritic cells (BM-DCs), no data are available about BM-DCs in sheep, a species that is largely used for immunology and transplantation studies. We have developed a culture protocol to produce ovine BM-DCs, using 6x(His)-tagged recombinant GM-CSF which was purified from baculovirus-infected insect cells. When ovine bone marrow progenitors were cultured in the presence of recombinant GM-CSF, large numbers of CD11c-positive cells were generated after 6-7 days. The phenotypic appearance of BM-DCs was assessed by flow cytometry and electron microscopy. Two DC subsets were identified that expressed different levels of MHC class II molecules, differed in receptor-mediated endocytosis, and could be separated on CD11b expression. When separated cells were incubated with microbial products, they react differently to those that are considered the TLR2 and TLR4 agonists in other species. Indeed, although CD11b^int/hi cells were partially resistant to maturation induced by lipoteichoic acid or lipopolysaccharide, MHC class II upregulation was observed on CD11b^dull cells. Moreover, these cells had strong stimulatory capacity for CD4 T cells when assayed in allogeneic reactions. This protocol will help analyzing ovine DC interactions with pathogens, and enables future studies on the development of vaccines.     

腺病毒介导HSP70-HBsAg嵌合基因转染树突状细胞及生物学特性分析

目的 分析携带热休克蛋白70(HSP70)和乙肝表面抗原(HBsAg)嵌合基因的腺病毒表达载体感染人外周血诱导培养树突状细胞(DC)后其生物学特性的改变.方法 从正常人外周血中分离单个核细胞,经Ad-HSP70-HBsAg感染刺激后.在含细胞因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-4(IL-4)、肿瘤坏死因子(TNF-α)的培养液体中体外诱导培养DC;采用荧光倒置显微镜、RT-PCR、流式细胞仪(FACS)和混合淋巴细胞反应(MLR)试验对人外周血来源的DC进行生物学特性分析.结果 Ad-HSP70-HBsAg感染后的DC能够有效表达示踪蛋白GFP和转录基因HSP70-HBsAg,病毒感染组和对照组的DC在细胞形态、DC细胞表面分子表达和刺激同种异体的人外周血幼稚型T细胞增殖能力的方面无明显差别.结论 Ad-HSP70-HBsAg可有效转染DC,感染后的病毒对DC的生长和生物学特性无显著影响.