人内皮高表达脂多糖相关因子1强制表达模型的建立及对ECV304细胞增殖的影响

目的设计和构建新基因内皮高表达脂多糖相关因子1(EOLA1)诱导表达载体,建立EOLA1强制表达模型,观察其对细胞增殖的影响。方法逆转录聚合酶链反应扩增EOLA1开放阅读框片段,引入NoⅠt和XhoⅠ酶切位点,定向亚克隆入可调控真核表达的载体pOPRSVⅠ,测序验证后共转染pOPRSVⅠ-EOLA1和pCMVLacⅠ质粒于ECV304细胞,经潮霉素和G418筛选,获得稳定转染细胞株。对异丙硫半乳糖苷(IPTG)诱导和非诱导的稳定转染细胞株进行计数,绘制细胞生长曲线。结果成功构建了EOLA1可调控真核表达载体pOPRSVⅠ-EOLA1。诱导后第4天,EOLA1稳定表达的ECV304细胞数量为(44±17)×104个,显著多于未诱导细胞的数量(27±11)×104个(P<0.01)。结论强制高表达EOLA1蛋白具有促进ECV304细胞增殖的作用。     

人内皮细胞高表达脂多糖相关因子1蛋白的纯化

目的探讨通过金属螯合亲和层析的方法获得高纯度的人内皮细胞高表达脂多糖相关因子1(EOLA1)蛋白的可行性。方法采用蛋白抽提试剂破菌方法抽提包涵体蛋白,初步纯化后在变性条件下用组氨酸标签结合树脂进行亲和层析,以透析方法复性,对纯化样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹法、肽质量指纹谱鉴定。结果EOLA1蛋白在大肠杆菌中的表达主要以包涵体形式存在,初步纯化的包涵体中蛋白纯度>75%,亲和层析纯化后获得的蛋白纯度高达90%以上,肽质量指纹谱分析目的蛋白与理论蛋白肽段覆盖率较高。结论所应用的EOLA1蛋白纯化和复性方法简便有效,能够获得足量的高纯度EOLA1蛋白,有助于下一步制备EOLA1单克隆抗体及对相关基因进行功能研究。     

人内皮高表达脂多糖相关因子1蛋白亚细胞定位研究

目的 了解人内皮高表达脂多糖相关因子1(EOLA1)蛋白在内皮细胞中的亚细胞定位情况.方法 体外培养人脐静脉内皮细胞株ECV304,另构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-EOLA1融合蛋白表达质粒.用脂质体分别将空质粒pEGFP-N2和融合蛋白表达质粒EGFP-EOLA1转染入ECV304细胞.继续培养48 h,取细胞,用蛋白质印迹法鉴定EGFP及EGFP-EOLA1融合蛋白的表达;采用激光共聚焦显微镜和免疫电镜技术,观察细胞中EOLA1蛋白的亚细胞定位情况.结果 经酶切和测序鉴定证实重组质粒EGFP-EOLA1构建成功.蛋白质印迹法检测结果显示,EGFP和EGFPEOLA1融合蛋白在转染细胞中成功表达.激光共聚焦显微镜下见转染空质粒的ECV304,绿色荧光遍布整个细胞,但无细胞核聚集现象;转染融合蛋白表达质粒的ECV304,绿色荧光也呈全细胞分布,且在胞核内明显聚集.透射电镜下见转染空质粒的细胞内无免疫沉积物,转染融合蛋白表达质粒的细胞质基质中有免疫沉积物.结论 EOLA1蛋白定位在ECV304细胞核与细胞质基质中,作为信号转导因子发挥作用.     

胃动素受体多克隆抗体的制备及其受体在人胃的表达

目的制备胃动素受体多克隆抗体和研究该受体在人胃中的组织定位。方法通过合成肽耦联钥孔戚血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin,KLH)制备抗体,以ELISA方法测定效价。用含有GPR38基因(胃动素受体)的质粒转染293细胞株,以RT-PCR方法鉴定。Westernblot和免疫组织化学法检测转染的293细胞和组织中胃动素受体的表达。结果制备的兔抗人的多抗效价达1∶500000,有较好的特异性。成功转染293细胞,该细胞能够瞬时表达胃动素受体,而该受体在人胃窦胃体的黏膜腺上皮中表达。结论应用合成肽-KLH成功地制备了胃动素受体的兔抗人多克隆抗体,用该抗体检测到人胃窦胃体黏膜上皮细胞存在胃动素受体的表达。     

人源类溶菌酶蛋白4的多克隆抗体制备及其表达分析

目的:以原核表达的人源类溶菌酶蛋白4(LYZL4)为免疫原制备多克隆抗体,检测LYZL4在睾丸组织中的定位,为阐明其生理功能提供依据。方法:将LYZL4编码基因克隆于原核表达载体pET32a,IPTG诱导重组LYZL4(r LYZL4)表达。分别使用Ni-NTA树脂和甲壳素亲和层析纯化rLYZL4,采用双层琼脂平板扩散法检测杀菌活性。以Ni-NTA树脂纯化产物为免疫原制备兔抗rLYZL4多克隆抗体,通过ELISA测定抗体效价,Western印迹检测抗体特异性后,检测LYZL4蛋白在人体各组织的分布及其在精子和精浆中存在情况,免疫组化确认LYZL4在人睾丸组织中的定位。结果:原核表达系统可有效表达rLYZL4,其对溶壁微球菌及大肠杆菌无杀灭活性。制备的兔抗rLYZL4多克隆抗体具有很高的效价和特异性,在睾丸、附睾及人精子蛋白提取物中可检测到LYZL4存在,在生精小管中,LYZL4定位于圆形精子细胞及长形精子细胞的顶体上。结论:本研究成功以原核表达的rLYZL4制备了该蛋白的多克隆抗体,确认LYZL4在睾丸和附睾有表达,并定位于精子顶体上,提示其可能与顶体结构或功能相关。     

人髓样细胞触发受体-1原核表达载体的构建和表达及多克隆抗体的制备

目的 构建人髓样细胞触发受体-1(TREM-1)原核表达载体使其表达并制备多克隆抗体。方法 采用特异性引物扩增人TREM-1胞外段cDNA,经酶切、连接、构建到原核表达载体pET28a(+),将构建的重组表达质粒转化入E.coli BL21( DE3)菌株,采用IPTG诱导表达、Ni-NTA 柱亲和层析纯化目的蛋白、SDS-PAGE分析蛋白纯度,将纯化的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对其进行纯化及鉴定。结果 序列测定证实构建的重组表达载体pET28a(+)-TREM-1含有人TREM-1编码序列,其序列分析与Genbank中公布序列对比一致,质粒在E.coli中诱导表达相对分子质量(Mr)为21.80 kDa的目的蛋白,SDS-PAGE分析表明纯化后的目的蛋白达到电泳纯,双向琼脂扩散法检测抗体效价为1:16,ELISA法检测抗体效价为1:25 600,Western blot分析显示抗体能特性结合人TREM-1重组蛋白。结论 成功构建高表达重组人TREM-1蛋白的原核表达载体及制备高效价兔抗人TREM-1多克隆抗体。     

人细胞核自身抗原精子蛋白的重组表达及多克隆抗体制备

目的:获得纯化的人细胞核自身抗原精子蛋白(hNASP)及其多克隆抗体,为其功能研究做准备。方法:提取人睾丸组织总RNA,用自行设计的引物,PCR扩增hNASP的一段序列,PCR产物经TA克隆后,通过BamHⅠ和HindⅢ双酶切克隆到pET-28 a(+)中。在E.coliBL21中,用异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达H is融合蛋白。样品超声处理后,经镍离子亲和树脂进行亲和层析纯化。用纯化的重组蛋白免疫家兔获取多克隆抗体。结果:对表达重组蛋白的质粒进行DNA测序以及表达的重组蛋白经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,证实获取了目的蛋白。ELISA证实免疫家兔后获得高效价的抗体。结论:用上述原核生物表达的方法可以得到纯化的hNASP蛋白,用纯化的蛋白免疫家兔也能获得高效价的抗体。     

抗内毒素类脂A单链抗体基因的克隆,表达和初步鉴定

为探索Ｇ杆菌脓毒症的治疗问题，应用基因工程技术从本所制备的分泌抗内毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞中提到ｍＲＮＡ，然后反转录成ｃＤＮＡ第一链，用特异性轻、重锭引物扩增反应产物，获得重链（３４０ｂｐ）和轻链３２０ｂｐ基因片段，经纯化后将轻链和重链基因用一多肽连接物连接，构成单链抗体基因片段。此单链抗体基因经再次ＰＣＲ扩增后克隆入ＰＣＡＮＴＡＢ５噬菌粒中再转化于感受态的ＴＧ１大肠杆菌中，通过噬菌体抗体库技术     

抗内毒素类脂A单链抗体基因的克隆、表达和初步鉴定

为探索 G 杆菌脓毒症的治疗问题,应用基因工程技术从本所制备的分泌抗内毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取 mRNA,然后反转录成 cDNA 第一链,用特异性轻、重链引物扩增反应产物,获得重链(340bp)和轻链(320bp)基因片段,经纯化后将轻链和重链基因用一多肽连接物连接,构成单链抗体基因片段。此单链抗体基因经再次 PCR 扩增后克隆入 PCANTAB_5噬菌粒中再转化于感受态的 TG_1大肠杆菌中,通过噬菌体抗体库技术筛选重组噬菌体,结果在 TG_1细菌中表达了9G_6单链抗体基因。ELISA 阻断试验初步证明了该单链抗体能阻断其亲本单克隆抗体对内毒素的结合。提示:抗内毒素单链抗体可为脓毒症的治疗提供一条途径。     

抗内毒素类脂A单链抗体基因的克隆、表达和初步鉴定

为探索Ｇ－杆菌脓毒症的治疗问题，应用基因工程技术从本所制备的分泌抗内毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取ｍＲＮＡ，然后反转录成ｃＤＮＡ第一链，用特异性轻、重链引物扩增反应产物，获得重链（３４０ｂｐ）和轻链（３２０ｂｐ）基因片段，经纯化后将轻链和重链基因用一多肽连接物连接，构成单链抗体基因片段。此单链抗体基因经再次ＰＣＲ扩增后克隆入ＰＣＡＮＴＡＢ５噬菌粒中再转化于感受态的ＴＧ１大肠杆菌中，通过噬菌体抗体库技术筛选重组噬菌体，结果在ＴＧ１细菌中表达了９Ｇ６单链抗体基因。ＥＬＩＳＡ阻断试验初步证明了该单链抗体能阻断其亲本单克隆抗体对内毒素的结合。提示：抗内毒素单链抗体可为脓毒症的治疗提供一条途径。     

改良型TAT-VP3融合蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体的制备

目的 表达、纯化改良型TAT-VP3融合蛋白,并制备其多克隆抗体.方法 利用原核表达载体PGEX-6P-1/改良型TAT-VP3在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达,经GST标签纯化树脂纯化蛋白,并用PreScission Protease酶切除标签,以纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,获得改良型TAT-VP3融合蛋白的多克隆抗体.用ELISA进行效价检测,Western blotting鉴定其特异性.结果 诱导表达并纯化了改良型TAT-VP3融合蛋白,纯度大于90%,蛋白浓度为1.2 mg/ml.制备了该蛋白的多克隆抗体,ELISA表明多克隆抗体效价为1∶32 000,Western blotting证明多克隆抗体的特异性良好.结论 成功纯化出改良型TAT-VP3融合蛋白,并制备出高效价、高特异性的多克隆抗体,为进一步研究该蛋白的体内外抗肿瘤活性及作用机制奠定了基础.     

SLC35 F2抗体制备与非小细胞肺癌组织中SLC35 F2蛋白表达检测

目的 制备SLC35F2多肽抗体,鉴定其性能,检测其对应蛋白在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达.方法 通过蛋白质序列分析,选4段氨基酸序列合成多肽,混合免疫家兔,制备抗SLC35F2多肽抗体,经纯化、效价检测、特异性鉴定后,将抗体用于NSCLC标本免疫组织化学染色.结果 获得兔抗人SLC35F2多肽抗体,效价1:10<"5,Western blot可特异识别41 KD的SLC35F2蛋白,免疫组织化学示细胞胞质特异性染色.129例NSCLC的组织微阵列免疫组织化学染色显示,SLC35F2蛋白表达在90.7%(117/129)肺癌标本为++到+++;而仅在17.1%(22/129)癌旁正常肺组织为++,其余为-或+;SLC35F2蛋白表达在NSCLC组织中高于癌旁正常肺组织(P<0.01);NSCLC病理分期与SLC35F2的升高表达存在低度相关(r=0.175).结论 用多肽免疫家兔制备抗SLC35F2抗体具有较高的效价和特异性,SLC35F2在NSCLC中表达高于癌旁正常组织.     

新一代多克隆抗体抑制异种细胞免疫反应的研究

目的 研究新一代兔抗人免疫细胞多克隆抗体(newRALG)对异种细胞免疫反应的抑制作用.方法 应用活化的淋巴细胞和单核细胞致敏新西兰兔后获得newRALG.将PKH-26标记的猪血管内皮细胞(PEC)和正常人单个核细胞(PBMC)建立混合培养体系,培养液中分别加入newRALG、正常兔IgG、Thymoglobulin和Scavenger受体(SR)阻断剂Poly G,培养后收集PBMC,然后分别加入异硫氰基荧光素(FITC)标记的鼠抗人CD14、CD40、CD80、CD86和HLA-DR单克隆抗体.通过流式细胞术检测单核细胞对PEC膜的吞噬作用;通过淋巴细胞与PEC的混合培养体系,加入newRALG,以观察淋巴细胞的增殖反应和newRALG对增殖反应的阻断作用.结果 PBMC与PKH-26标记的PEC共培养后,PBMC中的CD86+单核细胞表达PKH-26,进一步研究发现PKH-26阳性的CD86+单核细胞不但表达CD14、CD86和HLA-DR,同时上调共刺激分子CD40和CD80的表达水平.正常兔IgG(作为阴性对照)对单核细胞吞噬PEC膜无阻断作用,Thymoglobulin具有较低的阻断效果,newRALG与Poly G相似,均具有较高的阻断作用.正常未经刺激的人淋巴细胞不具备增殖能力,经灭活的PEC刺激后,人淋巴细胞具有高水平的免疫增殖反应.正常兔IgG不能阻断PEC对人淋巴细胞的免疫增殖反应;Thymoglobulin的抑制作用随浓度的降低而增强;高浓度的newRALG不能抑制人淋巴细胞的免疫增殖反应,但低浓度的newRALG则显示出强大地抑制人淋巴细胞免疫增殖反应的作用.结论 单核细胞在异种免疫反应过程中发挥重要作用;newRALG可有效抑制单核细胞的吞噬功能和淋巴细胞的免疫增殖反应,从而有效的抑制异种移植排斥反应.     

大黄酸对转化生长因子诱导内皮细胞纤溶酶原激活物抑制物1表达的影响

目的 探讨大黄酸对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导人脐静脉内皮细胞纤溶酶原激活物抑制物1（PAI-1）mRNA表达和蛋白合成的影响。以阐明大黄酸对内皮细胞的保护作用。方法 以人脐静脉细胞系ECV-304为研究对象，Northern blot检测PAI-1mRNA的表达。流式细胞仪法检测PAI-1蛋白的合成。免疫沉淀法和Western blot检测p44/p42丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）活性。结果 大黄酸可以快速抑制TGF-β1诱导的内皮细胞PAI-1mRNA的表达，且呈明显的剂量依赖效应。如果作用时间延长，则对蛋白的合成同样具有明显抑制作用。进一步的研究还发现，大黄酸对TGF-β1激活的p44/p42MAPK活性具有明显下调作用。结论 大黄酸对TGF-β1诱导的PAI-1高表达的抑制作用可能是其保护内皮细胞功能从而防治糖尿病及其血管并发症的作用机制之一。     

缺氧诱导因子-1α基因转染人间充质干细胞的体内促血管生成作用

目的研究将缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因转染人间充质干细胞（hMSCs）的体内促血管生成作用，为促进组织工程骨血管化提供新的方法和策略。方法构建pIRES3／HIF-1α逆转录病毒载体，制备含目的基因的重组逆转录病毒，感染hMSCs。用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）法检测转基因hMSCs表达HIF-1α的水平，用免疫组织化学法检测转基因hMSCs在缺氧和常氧条件下HIF-1α蛋白的存在情况。体内促血管生成的实验分为两组：实验组采用转基因hMSCs，对照组采用未转基因的hMSCs。两种细胞分别接种到13d的鸡胚绒毛尿囊膜（CAM），3d后将CAM制片，在显微镜下观察并摄像。用图像分析方法测量并分析血管面积。结果转基因hMSCs中HIF-1α mRNA表达较未转基因的hMSCs明显增高。转染HIF-1α基因的hMSCs，缺氧条件下细胞核内HIF-1α能稳定存在；常氧条件下细胞核内HIF-1α不能稳定存在。图像分析结果显示实验组CAM较对照组CAM血管面积明显增多，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论HIF-1α基因能稳定转染到hMSCs并得到强制表达。转染HIF-1α基因的hMSCs有明显的促血管生成作用，对于促进组织工程骨的血管化有重要作用。