6-羟基多巴胺诱导PC12细胞帕金森病模型中CaBP1表达的研究

目的应用蛋白质组学技术研究6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导PC12细胞帕金森病（PD）模型中钙结合蛋白1（CaBP1）的表达。方法在建立6-OHDA诱导PC12细胞帕金森病模型的基础上，分别提取6-OHDA处理组和对照组细胞总蛋白，应用荧光差异双向凝胶电泳（DIGE）技术获得蛋白点的差异表达信息，运用基质辅助激光解吸／电离飞行时间质谱仪（MAID1-TDF MS）鉴定出差异蛋白质。结果DIGE分析发现6-OHDA组表达明显增高的一个蛋白质点，经质谱分析鉴定确认为CaBP1。结论6-OHDA诱导PC12细胞的帕金森病模型中CaBP1表达增高，提示CaBP1增高可能与PD的发病机制有关。     

单点注射6-羟基多巴胺成功建立帕金森病大鼠模型的实验研究

目的探讨成功建立帕金森病(Parkinson’s disease,PD)大鼠模型的快速有效方法。方法将Wistar大鼠92只,随机分为实验组(80只)及对照组(12只),采用脑立体定向术,实验组在大鼠右侧中脑腹侧被盖区(ventral tegmental area,VTA)注入6-OHDA,经阿朴吗啡(Apomorphine,APO)诱导表现为恒定左侧旋转且旋转圈数210 r/30 min的视为成功PD大鼠模型,对照组则在脑部相应位置注入生理盐水。免疫组化法观察成功模型毁损侧黑质酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元的形态及数量变化。结果 (1)行为学检测:模型组与对照组手术后分别死亡2只及1只,实验组78只大鼠中36只左侧恒定旋转圈数210 r/30 min,造模成功率为46.2%,并且维持时间长。(2)免疫组化:成功大鼠模型毁损侧黑质区TH阳性的神经元较对侧及对照组明显减少(P0.01)。结论大鼠中脑VTA单点注射6-OHDA制作PD大鼠模型,易于定位,操作简单,动物死亡率低,模型成功率较高,成本较低,是较快建立稳定PD大鼠模型的可行方法。     

6-羟多巴胺诱导帕金森病动物模型的分子作用机制研究进展

帕金森病（Parkinson＇s disease，PD）是一种以中脑黑质致密部多巴胺（dopamine，DA）能神经元进行性退变为主要病理特征的慢性神经系统变性疾病，这种选择性地损伤中脑DA能神经元的机制尚不清楚。大量实验显示PD致病的主要生化过程与氧化应激和线粒体功能障碍有关，近年来，动物模型和PD病人大脑组织学研究显示．凋亡可能是引起黑质DA能神经元死亡和丢失的最终原因。     

人14-3-3γ基因转移对帕金森病大鼠多巴胺能神经元的保护作用

目的 探讨14-3-3γ转基因疗法对帕金森病模型大鼠的治疗作用及可能机制. 方法 用携带人14-3-3γ基因的重组腺病毒(Ad)感染帕金森病大鼠模型纹状体后,采用免疫组化方法检测纹状体与黑质酪氨酸羟化酶(TH)的表达、免疫印迹技术检测Caspase 3及14-3-3γ蛋白的表达、高效液相色谱法检测纹状体DA及其代谢产物DOPAC含量变化,并对PD大鼠的旋转行为进行评分. 结果 Ad/14-3-3γ注射PD大鼠纹状体后14-3-3 γmRNA及蛋白均能过表达.Ad/14-3-3γ组黑质TH免疫反应阳性的细胞数和纹状体TH免疫反应阳性的神经纤维光密度值与正常对照侧的比值(0.47±0.12和0.61±0.14)显著高于PBS组(0.16±0.13和0.25±0.12)和LacZ组(0.15±0.09和0.27±0.11)(均P＜0.01).Ad/14-3-3 γ组注射侧大鼠纹状体区DA含量与对侧比值为0.37±0.14,显著高于PBS组(0.15±0.08,P=0.006)和LacZ组(0.19±0.11,P=0.007);其代谢产物DOPAC含量与对侧比值Ad/14-3-3γ组(0.34±0.12)也高于对照组(PBS组为0.13±0.10,LacZ组为0.16±0.09,均P=0.00).Ad/14-3-3γ组注射侧纹状体中Caspase-3的表达与对侧相比显著降低.行为学评估结果显示Ad/14-3-3γ组大鼠平均旋转次数在第2次注射后的第1周、第2周和第6周均低于PBS组和LacZ组(均P＜0.01);而PBS组和LacZ组相比,两组的旋转次数在上述三个时间点均差异无统计学意义(P=0.764,0.779和0.742). 结论 14-3-3γ对PD模型大鼠的多巴胺能神经元有保护作用,是PD基因治疗中非常有前景的候选基因.     

6-羟基多巴胺所致帕金森病大鼠模型稳定性的研究

目的 探讨立体定向注射6-羟基多巴(6-OHDA)建立帕金森病(PD)大鼠模型的方法及其稳定性.方法 利用脑立体定向技术将6-OHDA 注入大鼠右侧黑质致密部(SNc)及中脑腹侧被盖(VTA),经阿朴吗啡(APO)诱导表现为恒定左侧旋转且旋转圈数大于210 r/30 min,视为成功PD大鼠模型.免疫组化方法观察黑质、纹状体区酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元的形态及数量变化,以及高效液相法检测黑质纹状体多巴胺(DA)含量的变化.结果 ①旋转实验检测:80只大鼠中32只旋转圈数大于210 r/30 min,成功率为40%,并且至少可以维持12 w.②免疫组化结果:大鼠模型毁损侧黑质区和纹状体区TH阳性的神经元较对侧及对照组减少(P＜0.01).③高效液相法检测结果:4和12 w模型鼠右侧黑质纹状体中DA 含量均较对照组减少(P＜0.05).结论 6-OHDA 毁损法可有效建立模拟人类PD中晚期的大鼠模型,并且至少可以维持12 w,为研究PD治疗提供稳定的模型.     

6-羟多巴胺诱导帕金森病模型鼠黑质神经细胞凋亡的观察

目的　探索帕金森病 ( PD)发病过程中多巴胺能神经元可能的死亡方式。　方法　采用TUNEL法、流式细胞术及免疫组化方法检测 6-羟多巴胺 ( 6-OHDA)诱导 PD模型鼠中脑黑质神经细胞凋亡情况。　结果　TUNEL法及流式细胞术均观察到 PD模型鼠中脑黑质神经细胞凋亡样改变。在 2周、1个月、3个月模型鼠中 ,TUNEL法显示黑质神经细胞凋亡率分别为 ( 48.5± 5.5) %、( 1 1 .0± 3 .0 ) %、( 6.5± 3 .0 ) %,流式细胞术检测亚 G1期细胞百分率分别为 ( 57.3± 9.7) %、( 1 1 .7±3 .6) %、( 6.5± 1 .7) %,两种方法结果具有一致性。2周模型组与 1个月、3个月模型组比较 ,差异有显著性 ( P<0 .0 0 1 )。　结论　 6-OHDA诱导 PD模型鼠中脑黑质神经元存在以细胞凋亡为主的死亡方式 ,细胞凋亡在 PD发病中可能起关键作用。     

尼古丁抑制6-羟基多巴胺损伤诱导的纹状体炎症反应

目的 探讨尼古丁对6-羟基多巴胺(6-OHDA)损伤诱导的纹状体炎症反应的抑制作用. 方法 雄性SD大鼠分别接受尼古丁(0.2 mg/kg或2.0 mg/kg)或生理盐水腹膜腔内注射.注射7 d后,尼古丁高剂量治疗组、低剂量治疗组和模型对照组大鼠右侧纹状体内分别接受6-OHDA20 μg注射.免疫组织化学定量分析黑质多巴胺能神经元和纹状体CD3、CD4、CD8阳性淋巴细胞数.免疫荧光定量分析纹状体小胶质细胞对6-OHDA损伤的反应. 结果 6-OHDA注射4周后,模型对照组注射侧黑质酪氨酸羟化酶免疫阳性细胞为相应对照侧的25.27%;而在尼古丁低剂量和高剂量组注射侧分别为相应对照侧的64.97%和67.24%.各组各时间点6-OHDA注射侧纹状体有明显的T淋巴细胞浸润,其中约80%为CD8阳性T淋巴细胞.尼古丁治疗组浸润的T淋巴细胞数较模型对照组明显减少,而CD3和CD4阳性细胞占总T淋巴细胞的比例在各组和各时间点基本一致,尼古丁治疗组和模型对照组比较,差异无统计学意义.纹状体小胶质细胞特异标记物IBA1免疫荧光定量结果显示,尼古丁处理可显著抑制6-OHDA损伤诱导的小胶质细胞激活. 结论 尼古丁可抑制6-OHDA损伤诱导的炎症反应.而尼古丁对炎症反应的抑制作用可能是其保护多巴胺能神经元的机制之一.     

转Nanog基因对6-羟基多巴胺帕金森病大鼠脑核因子-κB表达的影响

目的探讨转Nanog基因对6-羟多巴胺(6-OHDA)诱导的帕金森病(PD)大鼠A脑内核因子(NF)-κB表达的影响。方法取SD大鼠随机分成正常对照组、6-OHDA+磷酸盐缓冲液(PBS)组、6-OHDA+PNL组与6-OHDA+Nanog组,各组又分注射后1、14 d亚组。除正常对照组外,采用脑立体定向注射技术,6-OHDA+PBS组注入PBS,6-OHDA+PNL组注入空载体,6-OHDA+Nanog组注入转Nanog基因载体。各组动物注射阿朴吗啡(APO)后观察各时间点大鼠的旋转行为改变;行脑免疫组织化学染色,观察黑质多巴胺(DA)能神经元数量变化、纹状体NF-κBp65的表达改变;激光扫描共聚焦显微镜技术检测NF-κBp65表达的定位。结果注射后14 d,6-OHDA+Nanog组大鼠APO诱发的旋转效应明显低于6-OHDA+PNL组与6-OHDA+PBS组(P<0.05);除正常对照组外,其他各组大鼠注射后14 d黑质TH阳性细胞数普遍较注射后1 d减少(P<0.01),但6-OHDA+Nanog组损毁侧黑质存活的TH阳性细胞数明显高于6-OHDA+PNL组与6-OHDA+PBS组(P<0.01),且其注射侧纹状体NF-κBp65阳性细胞数低于注射后1 d组(P<0.05)、注射后14 d的6-OHDA+PNL与6-OHDA+PBS组(P<0.05)。除正常对照组外,注射后各组各时程均可见NF-κBp65的阳性表达,并呈现核内转移现象。结论转Nanog基因可抑制6-OHDA诱导的PD大鼠模型脑内NF-κB的活化,同时具有神经元保护作用。     

弓形虫信号转导蛋白14-3-3基因的克隆与表达

目的　体外扩增弓形虫RH株信号转导蛋白1433(Toxo1433)基因编码序列,构建原核表达质粒,并表达Toxo1433。　方法　收集、纯化弓形虫RH株速殖子,提取RNA,在设计合成的引物中引入EcoRI和XhoI酶切位点。应用RTPCR扩增Toxo1433基因片段,插入原核表达质粒pET28a中,重组子双酶切、PCR和测序鉴定,转化大肠杆菌BL21并以异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。　结果　从弓形虫RH株RNA中扩增出803bp的Toxo1433基因片段,构建重组质粒pET28a/1433;IPTG诱导,SDSPAGE显示表达产物的大小约30.7kDa,Western印迹鉴定为Toxo1433。　结论　成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取了1433基因,构建了pET28a/Toxo1433重组质粒,并获得高效表达。     

刚地弓形虫14-3-3蛋白真核表达载体的构建与表达

目的构建并表达刚地弓形虫RH株14-3-3蛋白的真核表达载体。方法用生物信息学方法对弓形虫14-3-3蛋白的理化性质和结构进行预测。以弓形虫RH株总RNA为模板,逆转录PCR(RT-PCR)扩增目的基因片段,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建重组质粒pcDNA3.0/14-3-3,经PCR、双酶切和测序鉴定正确后,用脂质体法转染人宫颈癌(HeLa)细胞,蛋白印迹(Western blotting)分析表达产物。结果根据14-3-3蛋白基因片段序列和氨基酸序列预测,该蛋白分子为酸性可溶性蛋白,主要以同源或异源二聚体存在,有5个氨基酸保守序列区。RT-PCR的扩增产物约为800 bp,构建的真核表达质粒pcDNA3.0/14-3-3插入片段经测序,片段长度为801 bp,与GenBank中刚地弓形虫14-3-3蛋白基因序列(登录号为AB012775.1)同源性为99%。Western blotting分析结果显示,在转染pcDNA3.0/14-3-3的细胞中,有14-3-3蛋白表达,相对分子质量(Mr)约为30 000,且表达量显著高于转染空质粒和未转染的细胞。结论构建了真核表达载体pcDNA3.0/14-3-3,并能在真核细胞内表达。     

帕金森病大鼠行为学模型实用性研究

目的探讨帕金森病（PD）大鼠行为学模型的实用性及黑质神经元的凋亡特征。方法注射6-羟基多巴胺（6-OHDA）制备大鼠模型,5周后用自制梯子和跑步机模型测试大鼠行为学指标。冰冻切片HE染色观察大鼠黑质神经元的形态特征,对比其凋亡情况。结果在梯子实验中,PD模型大鼠与正常对照组和假手术组大鼠相比,行走速度下降,行走时间延长（P〈0．05）,行走失误率显著增加（P〈0．01）;在跑步机实验中,PD模型大鼠较正常对照组持续爬行时间显著缩短,一定时间内的跌落次数增加（P〈0．01）。组织学观察PD模型大鼠注射药物侧黑质神经元显著减少,凋亡细胞显著增多,胞质染色加深。结论本文造模大鼠在自制梯子和跑步机实验中的行为学改变与黑质神经元凋亡程度相一致,此实验方法可以初步用于PD大鼠模型的鉴定。     

14-3-3蛋白在心肌细胞缺氧预处理中的表达及意义

目的:研究14-3-3蛋白在心肌细胞缺氧预处理中的表达及意义。方法:实验用SD新生大鼠(1～3d龄),雌雄不拘,无菌取出乳鼠心脏,经分离附着组织,胰蛋白酶消化,纯化制成心肌细胞。在培养的第4天随机分为3组:正常对照组、缺氧/复氧(A/R)组、缺氧预处理(APC)组。各组分别进行以下指标观察:①心肌细胞搏动频率;②细胞存活率(MTT法);③培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性;④透射电镜观察细胞超微结构;⑤Western Blotting法检测14-3-3蛋白的表达变化。RT-PCR法检测14-3-3蛋白η、σmRNA的表达变化。结果:A/R组和APC组的14-3-3蛋白表达均上调,分别是正常对照组的(3.61±0.37)倍和(5.52±0.49)倍,A/R组和APC组与正常对照组比较、A/R组与APC组比较,均P<0.01。A/R组、APC组心肌细胞14-3-3η亚型mRNA分别为正常对照组的(1.82±0.30)倍、(2.93±0.52)倍,差异均有统计学意义(P<0.01);APC组与A/R组比较,差异亦有统计学意义(P<0.01)。A/R组、APC组心肌细胞14-3-3σ亚型mRNA表达量分别为正常对照组的...     

14-3-3η蛋白的生物信息学分析及原核表达

目的分析巨噬细胞不同极化状态下14-3-3η mRNA表达及其生物信息,并构建14-3-3η蛋白原核表达载体,为研究其在巨噬细胞活化中的作用提供实验基础。方法提取C57BL/6小鼠骨髓原代巨噬细胞mRNA,反转录后用实时定量聚合酶链式反应(PCR)检测14-3-3η mRNA水平的改变。运用Prot Param tool、SOPMA等在线软件对14-3-3η氨基酸序列进行分析。以小鼠巨噬细胞cDNA为模板,采用PCR的方法扩增14-3-3η基因,插入pGEX-4T-3载体中,双酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化入大肠杆菌BL21菌株,用异丙基硫代半乳糖苷诱导其原核表达并纯化,SDS-PAGE法和Western blotting法对融合蛋白进行鉴定。采用Graphpad prism 5软件进行统计分析。样本比较均采用配对t检验。结果 M1型巨噬细胞14-3-3η表达降低,M2型趋势相反。生物信息学表明14-3-3η蛋白其二级结构中主要为α-螺旋(占62.60%)且疏水性较差(疏水系数为-0.607)。酶切和测序结果提示重组质粒pGEX-4T-3-14-3-3η构建成功。SDS-PAGE和Western blotting结果表明融合蛋白谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-14-3-3η成功表达和纯化。结论本实验对14-3-3η进行了初步的生物信息学分析,成功表达并纯化融合蛋白GST-14-3-3η,为14-3-3η在巨噬细胞极化上的功能研究奠定了实验基础。     

14-3-3蛋白影响肿瘤放射敏感性的机制研究进展

14-3-3蛋白是一组常表达于真核生物中的小分子蛋白质,随着近年来对其功能研究不断加深,相关研究发现其在肿瘤的发生发展及放射敏感性中具有重要意义,其机制可能与14-3-3蛋白对DNA损伤后修复、细胞周期调控、信号转导等多种途径有关。本文就14-3-3蛋白对不同肿瘤放射敏感性的影响进行综述。     

6-羟多巴胺诱致大鼠早期黑质多巴胺能神经元凋亡的实验研究

目的　探讨在 6 羟多巴胺 (6 OHDA)作用下SD大鼠黑质神经元极早期的凋亡发生率以及相应的时程变化。　方法　使用 6 OHDA立体定向注射于SD大鼠纹状体区 ,分别在 6、12、2 4、4 8、72、96h、1周及 2周时采用原位末端标记法检测黑质细胞的凋亡 ,并使用流式细胞仪检测其凋亡率 ,同时运用免疫组化的方法观察相应时间纹状体区多巴胺能神经纤维的含量的变化。　结果　在6 OHDA作用后 6h即可检测到黑质细胞的凋亡 ,在 4 8h达到高峰 ,凋亡率为 (6 4± 0 2 ) % ,在 2周时为 (1 0± 0 1) %。同时 ,随着黑质细胞的凋亡 ,纹状体区多巴胺能神经纤维的含量逐渐减少 ,2周时减少约 70 %。　结论　进一步证明了黑质细胞凋亡是早期帕金森病模型大鼠黑质细胞死亡的主要方式之一 ,是纹状体区酪氨酸羟化酶 (TH)减少的主要原因。     

浸润性乳腺癌组织中14-3-3σ、p73α蛋白表达及临床意义

目的探讨表皮细胞特异性标志物14-3-3σ、p73α蛋白在浸润性乳腺癌发生发展中的作用。方法选择我院手术切除的浸润性乳腺癌组织标本94份（浸润癌组）,导管原位癌15份（原位癌组）,上皮不典型增生15份（不典型增生组）,导管内乳头状瘤15份（乳头状瘤组）,乳腺增生症20份（增生症组）,乳腺癌旁5 cm组织10份（癌旁组）,采用免疫组化PV-9000两步法检测各组14-3-3σ、p73α蛋白表达情况,并分析两者间及与浸润性乳腺癌临床病理特征的相关性。结果浸润癌组14-3-3σ蛋白阳性率明显低于其余各组,p73α蛋白阳性率明显高于其余各组,P均〈0.05。14-3-3σ蛋白阳性表达与乳腺癌腋窝淋巴结转移、HER-2受体、组织学分级、TNM分期相关,p73α蛋白与腋窝淋巴结转移、ER受体、PR受体、TNM分期相关。14-3-3σ与p73α蛋白表达呈负相关。结论 14-3-3σ和p73α蛋白与浸润性乳腺癌的发生发展相关,两者联合检测可为乳腺癌早期诊断和治疗提供参考。     

14-3-3蛋白与心脑血管疾病研究进展

14-3-3蛋白家族是一组可溶性酸性蛋白质,广泛存在于各种真核细胞之中且高度保守,能够特异地结合含有磷酸化丝氨酸或苏氨酸靶蛋白,参与多种信号转导途径.现主要就14-3-3蛋白家族与心肌损伤、糖尿病性心肌病、脑缺血、血管增生、动脉粥样硬化及血栓形成等心脑血管疾病关系的研究进展进行综述.     

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3的纯化及抗体制备

目的制备日本血吸虫(中国大陆株)信号蛋白Sj14-3-3的多克隆抗体与单克隆抗体。方法将合Sj14-3-3重组蛋白的凝胶条带冻干磨粉,免疫家兔,制备抗Sj14-3-3多克隆抗血请;用电洗脱纯化的Sj14-3-3免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤技术制备抗Sj14-3-3单克隆抗体。测定所得抗体效价及特异性鉴定。结果获得大量纯化的表达产物;制备的多克隆抗血清双扩效价达1:8～1:64。获得1株能稳定分泌抗Sj14-3-3单抗的杂交瘤细胞株4D9,单抗亚类为IgG1。此株单抗能与重组Sj14-3-3蛋白发生特异性反应。结论获得了高度敏感、特异的抗Sj14-3-3多克隆抗血清及稳定分泌抗Sj14-3-3单抗的杂交瘤细胞。     

大鼠帕金森病发病过程中黑质细胞凋亡及其相关基因表达

目的观察帕金森病(Parkinson disease,PD)发病过程中黑质细胞凋亡变化规律,观察相关黑质细胞凋亡基因p53、Bax、热休克蛋白(HSP)的表达。方法通过脑立体定位注射6-羟基多巴胺(6-0HDA)的方法建立大鼠PD模型,采用TUNEL方法、免疫组织化学、尼氏染色等方法,选择术后1、7、14、21 d为研究时点,观察大鼠PD模型形成过程中尼氏细胞、黑质细胞凋亡的数量及相关基因变化情况,并检测黑质细胞p53、Bax、HSP表达情况。结果用TUNEL法发现黑质细胞存在细胞凋亡,与对照组存在显著性差异(P<0.05),各时点黑质细胞凋亡数逐渐增加,尼氏细胞则逐渐减少,随时间增加而升高,p53和HSP则在1 d为最高,其后很快下降,但都高于对照组(P<0.05),Bax蛋白表达逐渐减少。结论PD发病过程中黑质细胞凋亡参与其中,呈现一定变化规律,并受到p53、Bax和HSP的影响。     

脑多巴胺转运蛋白SPECT显像在帕金森病临床诊断中的研究

目的　探讨脑99mTc TRODAT 1SPECT多巴胺转运蛋白 (dopaminetransporter,DAT)显像对帕金森病 (PD)临床诊断的价值。 方法　选择PD患者 2 2例 ,健康对照组 5例 ,口服过氯酸钾 40 0mg ,30min后静脉注射99mTc TRODAT 1 ,2 5mCi,放射化学纯度 >93 % ,注射后 4h行SPECT显像。结果　健康对照组SPECT扫描示双侧基底节DAT显像结果正常 ,即DAT核素密度集中于双侧基底节呈红色 ,尾状核头部密度更高 ,呈“八”字形 ,左右基本对称。PD组SPECT扫描示双侧基底节DAT分布、位点、形态变异 ,数量减少 ,体积变小 ,以PD症状对侧为著。结论　DAT数量减少是PD发病的重要环节之一 ,DAT显像是PD实验室早期诊断依据之一