一种富集即食肉制品中单核细胞增生李斯特氏菌的方法

研究一种能够有效富集即食肉制品中单核细胞增生李斯特氏菌的方法,用于提高肉制品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测灵敏度和检出限。通过对样品预处理缓冲液种类和浓度、样品过滤条件、微孔滤膜材质和孔径、滤膜洗脱液种类及浓度的选择,确定即食肉制品富集单核细胞增生李斯特氏菌的条件。通过敏感性和特异性试验,与国标方法的对比验证试验,确定其准确性和灵敏性。结果显示样品预处理缓冲液选择李氏增菌肉汤LB3和Hanks的混合液(1:1),2℃低温条件下静置60 min后,于4℃10000 r/min离心10 min去除脂肪和大分子蛋白质,采用Φ50 mm 0.8μm聚醚PES微孔滤膜抽滤富集目标菌于Φ55 mm 50 mL具塞平底玻璃杯中,滤膜用10m L洗脱液(5 mL Hanks+5 mL LB3)洗脱即得到样品富集待测液。采用该方法用于即食肉制品中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测效果最佳。建立了最佳的富集即食肉制品单核细胞增生李斯特氏菌的方法,提高了方法的检出限和灵敏度。     

基于适配体识别的侧向层析法快速检测单核细胞增生李斯特氏菌

构建了一种快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的适配体试纸条。以单核细胞增生李斯特氏菌核酸适配体为识别分子,纳米金为显色信号,基于双适配体夹心原理,制备了用于检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌的适配体试纸条,并对制备条件如适配体浓度、胶体金溶液pH值、纳米金-适配体复合物和链霉亲和素-纳米金复合物的包被量等进行了优化。结果显示,在优化条件下,该试纸条对单核细胞增生李斯特氏菌的裸眼可视检测限为10~3cfu/mL,且具有很高特异性。可实现样品中单核细胞增生李斯特氏菌的快速定性检测。     

微滴数字PCR定量检测乳制品中单核细胞增生李斯特氏菌

选取单核细胞增生李斯特氏菌iap基因为靶基因,利用微滴数字PCR(ddPCR)技术对乳制品中单核细胞增生李斯特氏菌进行定量检测。实验结果表明,本方法能够对含菌量在5×10~3～5×10~6CFU/mL之间的巴氏乳样品进行准确定量检测,检测下限和定量检测下限分别为5×10~2CFU/mL和5×10~3CFU/mL,检测的准确性和灵敏性均优于qPCR检测。     

基于双启动引物特异性检测单核细胞增生李斯特氏菌的PCR方法

以单核细胞增生李斯特氏菌iap基因为靶基因,利用一新型PCR引物设计方法--双启动引物(Dual-priming oligonucleotide,DPO),建立了特异性检测单核细胞增生李斯特氏菌的DPO-PCR方法,测试了DPO-PCR方法退火温度不敏感性、特异性及灵敏度,并在实践检测中进行了初步应用。结果显示:该方法检测单核细胞增生李斯特氏菌的灵敏度为1.51×102CFU/mL;退火温度不敏感性测试中,与常规PCR引物相比,DPO引物在48~68℃退火温度范围内均能够高效率地扩增靶基因;特异性测试中,DPO-PCR方法能特异地检测出目标菌,与其他菌株无非特异性扩增反应,比常规PCR方法显示出更强的特异性。实践应用证明,利用DPO-PCR方法对130份样本进行检测,共计检出9份单核细胞增生李斯特氏菌阳性样本,经国标法(GB/T 4789.30-2008)复检,两者检测结果一致,显示出良好的实用性,为单核细胞增生李斯特氏菌的快速准确检测提供了新方法。     

一种快速富集生乳中沙门氏菌的方法

目的:确定一种可以快速富集生乳中沙门氏菌的方法条件,可用于生乳沙门氏菌的快速检测。方法:通过对缓冲液种类及浓度,去除脂肪、蛋白质等干扰物质方式,洗脱液种类及浓度的研究,确定生乳快速富集沙门氏菌条件,并将该方法与国标方法进行对比验证实验,确定其准确性和灵敏性。结果:缓冲液选择0.01 mol/L PBS,采用滤纸过滤、离心和0.22μm微孔滤膜过滤相结合的方法去除脂肪和大分子蛋白质,洗脱液选择5 mL PBS+5 mL TTB混合液,沙门氏菌的富集分离效果最佳。经实验验证,按照该方法检测灵敏度可达到10 cfu/mL,高于国标方法。结论:建立了最佳的快速富集生乳中沙门氏菌的方法条件,使沙门氏菌检测时间从(4~7)d缩短至50 min,敏感性和特异性较好。     

可视化跨越式滚环扩增技术检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌

建立一种新型的单核细胞增生李斯特氏菌检测方法,即通过可视化跨越式滚环等温扩增（saltatory rolling circle amplification,SRCA）技术检测单核细胞增生李斯特氏菌。根据单核细胞增生李斯特氏菌hlyA基因序列设计引物,进行特异性验证,对灵敏度和人工污染样品的检出限进行测定。通过检测70?种实际食品样品对SRCA方法的敏感性、特异性和符合率进行评价。结果表明：所有单核细胞增生李斯特氏菌呈阳性结果,非单核细胞增生李斯特氏菌呈阴性结果,说明该方法特异性良好。SRCA方法的灵敏度为8.9×100?fg/μL,是传统聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）方法的1?000?倍,检出限为2.8×100?CFU/g,是传统PCR方法的1/1?000。在实际样品的检测中,SRCA方法与GB?4789.30—2016《食品微生物学检验?单核细胞增生李斯特氏菌》方法进行比较,其敏感性、特异性和符合率分别为100%、97.01%和97.14%。可视化SRCA技术具有操作简便、设备简单、特异性强、灵敏度高、检出限低、检测成本低等优点,适合在基层单位和中小型食品企业中推广应用。     

多方法分离鉴定食品中单核细胞增生李斯特菌

参加中国检验检疫科学研究院编号为ACAS-PT1343 (2022)的能力验证,该能力验证考核能否从人工污染的样品中检出单核细胞增生李斯特菌检验。对随机人工污染样品22-D378、22-G483进行单核细胞增生李斯特菌检验,采用国标法、酶联免疫法和荧光定量PCR技术3种检测方法,探讨食品中单核增生李斯特菌的快速检测及鉴定。试验结果表明,编号22-D378样品检出单增李斯特菌,22-G483未检出。在国标方法的基础上,辅助酶联免疫和荧光定量PCR技术进行检测,缩短了检测时间,特异性和敏感性均较好,3种方法互相补充可确保试验结果的准确性。     

环介导等温扩增法检测动植物源性单核细胞增生李斯特氏菌

目的采用环介导等温扩增技术检测动植物源性单核细胞增生李斯特氏菌。方法在北京市范围内各业态餐厅购买600份凉菜样品为研究对象,以单核细胞增生李斯特氏菌的hlyA基因为目标基因,设计4条特异性引物,使用环比等温扩增法(loop-to-isothermal amplification, LAMP)创建凉菜中单核细胞增生李斯特氏菌快速检测方法并将其应用于鉴定凉菜中分离的单核细胞增生李斯特氏菌。结果通过细菌分离培养法对600份凉菜进行检测,一共检测分离出37株致病菌菌株,其中包括7株单核细胞增生李斯特氏菌、10株沙门氏菌和20株大肠埃希氏菌,单核细胞增生李斯特氏菌的检出率为1.2%。用LAMP对样品中的菌株进行测定,7株凉菜中分离的单核细胞增生李斯特氏菌为阳性,其他菌株为阴性。通过LAMP方法检测动植物源性凉菜中分离的单核细胞增生李斯特氏菌平均检出限为2.2*10 CFU/μL、特异性为100%。动物源性凉菜中的致病菌含量较高。结论环介导等温扩增法具备灵敏、快速、操作简便的特点,适合用于餐饮行业的现场快速检测领域。     

基于微间隙生物芯片检测单核细胞增生李斯特菌

目的建立一种可快速检测食品中单核细胞增生李斯特菌的方法。方法以微间隙生物芯片阵列电极为基础电极,采用双抗夹心酶联免疫反应,结合酶的生物催化银沉淀反应,放大电化学分析信号,用于单核细胞增生李斯特菌的检测。结果该方法特异性好,对其他菌株无交叉反应。单核细胞增生李斯特菌在10~5~10~8 CFU/m L浓度范围内变化时,电导与菌浓度成线性关系(R~2=0.993),最低检出限为105 CFU/mL。结论该方法具有灵敏度高、检测时间短、特异性好等优点,在食品检测中有较好的应用价值。     

链置换恒温扩增快速检测单核细胞增生李斯特氏菌

目的开发单核细胞增生李斯特氏菌快速、简便、准确的链置换恒温扩增(strand displacement amplification,SDA)检测方法。方法根据单核增生李斯特菌特异性基因prfA基因片段,设计链置换扩增特异性引物,建立单核细胞增生李斯特菌SDA快速检测方法,同时对设计的引物的特异性和灵敏度进行研究。结果所建立的单核细胞增生李斯特菌SDA扩增方法灵敏度达到了7.0×10~2 CFU/mL,检验技术可以特异性地扩增单核增生李斯特菌。结论本试验所建立的单核细胞增生李斯特菌SDA检验技术具有快速、简便、特异性强的特点,具有在进出口实验室推广应用前景。     

食品中单核细胞增生李斯特菌微滴数字PCR定量检测方法建立

目的 建立食品中单核细胞增生李斯特氏菌的微滴式数字聚合酶链式反应（ddPCR）快速定量检测方法。方法 筛选单核细胞增生李斯特氏菌的特异性引物和探针,通过对目标菌纯菌液及人工污染样品的检测,比较ddPCR方法和平板计数法的定值效果,对ddPCR结果进行特异性、灵敏性和重复性分析。结果 本研究建立的单核细胞增生李斯特氏菌ddPCR检测方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性。单核细胞增生李斯特氏菌纯菌液中定量限（LOQ）和检出限（LOD）均为136 CFU/mL,在鱿鱼圈和香肠样品中定量限分别为240 CFU/g和155 CFU/g。ddPCR在各梯度水平上变异系数均小于25%,ddPCR和平板计数定值对数值相对偏差均小于30%。结论 本研究建立的ddPCR方法能够快速、准确、灵敏、特异地定量检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌。     

工厂中环境和海产品加工前后的微生物学检验

检测了2个海产品加工厂的环境及加工前后海产品样品的菌落总数(个/cm2,个/g或个/mL)、李斯特氏菌和单核细胞增生李氏菌数(每100cm2,100g或100mL样品的MPN数),其结果如下:2个工厂对应样品的菌落总数及其分布规律相接近,但李斯特氏菌和单核细胞增生李氏菌的出现率和数量却相差很大;单核细胞增生李氏菌数都低于或远低于李斯特氏菌,且单核细胞增生李氏菌与李斯特氏菌的数量和分布呈正相关;加工后海产品中的李斯特氏菌和单核细胞增生李氏菌可能来自原料和加工过程;环境中李斯特氏菌和单核细胞增生李氏菌主要来自原料.     

单核细胞增生李斯特菌液相芯片检测方法的建立

建立单核细胞增生李斯特菌液相芯片检测方法。本研究将单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体(mAb930)与聚苯乙烯微球偶联,结合双抗体夹心技术建立单核细胞增生李斯特菌液相芯片检测方法。测定不同浓度的抗体与微球偶联率。通过L25(56)正交设计试验优化方法的反应条件,并进行灵敏度和特异性试验。应用建立的方法及国家标准检测方法同时检测200份食品样品,比较检测结果。结果显示,较优实验条件即多抗工作浓度为1:100、生物素标记的羊抗兔IgG工作浓度为1:500、SA-PE的工作浓度为10μg/mL、生物素标记的抗体与SA-PE反应时间为30 min。该方法灵敏度可达103 CFU/mL;与其他常见食源性致病菌无交叉反应。与国家标准方法检测单核细胞增生李斯特菌的结果基本相符,液相芯片法检测各种样品的假阳性率低于0.77%。该方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可快速检测食品中的单核细胞增生李斯特菌,能够应用于实际样品的检测。     

双抗夹心ELISA方法检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌

采用0.5% 福尔马林灭活的单核细胞增生李斯特氏菌作为免疫原免疫日本大耳兔,获得抗单核细胞增生李斯特氏菌多克隆抗体,并以此多克隆抗体作为捕获抗体,以抗单核细胞增生李斯特氏菌Internalin A(InlA)单克隆抗体作为检测抗体,建立快速、特异的检测该菌的双抗夹心ELISA 方法。结果表明：该方法对单核细胞增生李斯特氏菌纯培养液的最低检测量为1.7 × 105CFU/mL。在检测食品样品的实验中,食品样本对本方法干扰较小,运用选择性增菌液进行前增菌可提高该方法的准确性。     

双重荧光定量PCR检测沙门菌和单核细胞增生李斯特菌方法的建立

目的建立双重荧光定量PCR方法,快速检测沙门菌和单核细胞增生李斯特菌。方法通过设计特异性引物和探针,扩增沙门菌的fimY基因和单核细胞增生李斯特菌的hly基因,采用倍比梯度稀释法检测该体系的灵敏度,以另外7株肠道致病菌评价检测体系的特异性;建立了沙门菌和单核细胞增生李斯特菌感染小鼠的检测模型以验证方法的适用性。结果建立了同时检测沙门菌和单核细胞增生李斯特菌的双重荧光定量PCR方法,从DNA提取到检测完毕仅需2.5 h。检测两种病原菌的灵敏度分别为11和12.8 copies/μl,特异性为100%,符合率为93.3%。结论该法缩短了检测时间,并有良好的灵敏性和特异性,在疾病防控及食品卫生行业中很有应用前景。     

实时荧光PCR法和国标法检测乳粉中单增李斯特菌的比较研究

目的 提升实验室检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌的速度和准确性。方法 依据《GBS4789.30-2016S食品安全国家标准S食品微生物学检验S单核细胞增生李斯特氏菌检验》和能力验证作业指导书对食品中单核细胞增生李斯特氏菌进行检测, 同时利用实时荧光PCR法对能力验证中的2个样品进行快速筛查,采用VITEK2 Compact30全自动微生物鉴定系统鉴定可疑菌落。结果 GB 4789.30国标法和实时荧光PCR快速筛查法检测,结果均为样品CODE:FC02220028单核细胞增生李斯特氏菌阳性, 样品CODE:FC02220098阴性。结论 本实验室参加了中国食品药品质量检定研究院组织的食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力验证,取得了满意的结果。     

FTA滤膜用于PCR检测单核细胞增生李斯特氏菌的研究

建立单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria moncytones,LM)快速、敏感、特异的PCR检测方法.利用FTA滤膜提取模板DNA,采用PCR特异性扩增单增李斯特菌的溶血素基因(HIyA),并评价该方法的特异性与灵敏性.引物能特异性的扩增单增李斯特的HIyA基因,而其他细菌的扩增结果均呈现阴性:利用FTA滤膜提取模板直接检测单增李斯特具有较高的灵敏度,灵敏度为l 02 cfu/mL.利用FFA滤膜提取模板,操作简便,成本低且具有较高的灵敏度,为食品中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测提供新的手段.     

改良FTA-PCR快速检测单核细胞增生李斯特氏菌研究

目的：建立快速、特异、灵敏的单核细胞增生性李斯特氏菌的PCR 检测方法。方法：以单核细胞增生李斯特氏菌的hlyA 基因作为靶序列设计一对引物,运用改良的FTA-PCR 法对单核细胞增生李斯特氏菌进行鉴定和检测。结果：扩增产物为136bp 的片断,此方法较原有方法灵敏度增强,可达到1.1 × 102CFU/ml。结论：改良的FTA 卡法特异性强、灵敏度高,有效缩短了检验周期,从传统的7～14d 缩短到1～1.5d。     

食品中单核细胞增生李斯特氏菌实时浊度(LAMP)检测方法的建立

建立单核细胞增生李斯特氏菌实时浊度LAMP检测方法。根据单核细胞增生李斯特氏菌hly A基因设计4条特异性引物,采用环介导等温扩增方法 (LAMP)建立单核细胞增生李斯特氏菌快速检测方法。建立的LAMP方法具有高度特异性,经对14株细菌进行扩增,单核细胞增生李斯特氏菌为LAMP阳性,其他菌株均为LAMP阴性。建立的LAMP方法对培养的单核细胞增生李斯特氏菌的检测下限为32 CFU/m L,可在60 min内完成扩增反应。用建立的LAMP方法对160份不同食品进行检测,共检出5份LAMP阳性样本,与传统培养方法结果一致。该方法与传统方法相比,可节省大量时间,且对试验仪器和操作人员的要求低,具有良好的实用性。     

乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果分析

摘要：目的 对本实验室单核细胞增生李斯特氏菌检测能力进行验证,以提高或保证实验室能力验证工作中对单核细胞增生李斯特氏菌检测结果的准确性。方法 按照样品的作业指导书开启样品,按照GB 4789.30-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》进行检验,同时用MALEI-TOF-MS质谱仪对可疑菌进行鉴定,对2种方法结果进行比对。结果 FC02220009样品检出单核细胞增生李斯特氏菌;FC02220080样品未检出单核细胞增生李斯特氏菌。国标方法和MALDI-TOF-MS方法鉴定结果一致。结论 为保证检验结果准确可靠,避免假阴性出现,可多种鉴定手段同时进行。