AKT信号通路通过亚低温对大鼠局脑缺血再灌注损伤神经元的保护作用

目的通过检测AKT及Bcl-2蛋白的表达,探讨亚低温对局脑缺血再灌注后神经元存活的影响。方法用线拴法制作大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）局脑缺血再灌注模型,将36只SD大鼠随机分成假手术组、常温缺血再灌注组和亚低温缺血再灌注组,缺血组分别缺血6h再灌注4h、24h、72h、1w（n=4）后处死,亚低温组于缺血后13~14min实施病灶侧亚低温持续4h。免疫组织化学法检测AKT、Bcl-2蛋白的表达,电镜检测自噬小体。结果不同缺血时间再灌注4h,亚低温组比常温组缺血侧半暗带AKT表达水平显著增高（P〈0.05）,Bcl-2表达明显降低（P〈0.01）;亚低温组自噬小体明显减少。结论病灶侧亚低温通过促进缺血半暗带脑组织AKT表达,抑制Bcl-2表达,从而抑制神经元凋亡,抑制自噬的产生,从而对神经元起保护作用,促进脑缺血后神经功能恢复。     

异丙酚对大鼠脑缺血再灌注损伤诱导型一氧化氮合酶表达的抑制作用

目的 观察异丙酚预先给药对大鼠全脑缺血再灌注后海马CA1区诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达的影响,在分子水平上探讨异丙酚对迟发性脑神经元损伤保护作用机制.方法 采用Pulsinelli-Brierley四血管阻断法制备全脑缺血模型.应用免疫组织化学方法和原位杂交技术检测海马CA1区iNOS的表达.结果 同缺血再灌注对照组相比,异丙酚预处理组大鼠海马CA1区iNOS表达明显降低,存活的神经元数目明显增加,差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）.结论 异丙酚可能通过抑制iNOS表达而对脑缺血再灌注迟发性神经元损伤有一定的保护作用.     

虎纹捕鸟蜘蛛毒素对全脑缺血大鼠海马神经元细胞形态及bax、bcl-2 mRNA和蛋白表达的影响

目的:观察蛛网膜下腔注射虎纹捕鸟蜘蛛毒素(HWTX-I)对全脑缺血再灌注大鼠海马神经细胞线粒体和CA1区锥体细胞形态、凋亡相关因子bax和bcl-2 mRNA及蛋白表达的影响。方法:SD大鼠随机分为假手术组、生理盐水组及HWTX-I组,采用改良的Pulsinelli四血管阻断全脑缺血损伤结合蛛网膜下腔置管术模型,对大鼠海马神经细胞线粒体进行超微结构及Nissl染色形态学观察,免疫组织化学法检测Bax、Bcl-2蛋白表达,RT-PCR法检测baxb、cl-2 mRNA表达。结果:(1)HWTX-I能够使全脑缺血大鼠海马神经细胞线粒体基本维持正常形态。(2)HWTX-I能稳定全脑缺血大鼠海马CA1区锥体细胞分布。(3)HWTX-I能够下调全脑缺血再灌注大鼠海马组织bax mRNA及蛋白表达,上调bcl-2 mRNA及蛋白表达。结论:蛛网膜下腔注射HWTX-I对全脑缺血再灌注所致的大鼠海马神经元损伤有明显的保护作用。     

还原型谷胱甘肽对脑缺血大鼠海马神经元泛素蛋白结合物表达的影响

目的 探讨游离锌(Zn2+)和泛素蛋白结合物在大鼠脑缺血/再灌注损伤后海马神经元内的变化,以及还原型谷胱甘肽(GSH)干预的影响.方法 取雄性SD大鼠90只,随机均分为假手术对照(sham)组,脑缺血/再灌注(I/R)组,还原型谷胱甘肽+脑缺血/再灌注处理(GSH)组.I/R组按Pulsinelli的四血管阻塞法建立大鼠前脑缺血/再灌注模型,Sham组大鼠进行相同的手术处理,但不进行四血管阻塞.GSH组大鼠于造模前30min给予GSH(1.2g/kg)腹腔注射,Sham组和I/R组在相同时刻注射等量生理盐水.分别在脑缺血/再灌注后6、24、72h三个时间点从各组取大鼠,断头取脑,取海马CA1区进行相应处理后用于后续检测.应用FluoroJade B染色法检测神经元变性死亡的数目,TSQ荧光染色检测神经元内Zn2+变化,Western blotting检测海马神经元内泛素蛋白结合物的表达变化.结果 脑缺血/再灌注后6、24h时点,各组大鼠海马CA1区神经元均未见Fluoro-Jade B荧光染色阳性细胞;72h时点,sham组仍未见阳性细胞,GSH组阳性细胞数目(48.6±10.8个/0.2mm2)明显少于I/R组(96.7±13.3个/0.2mm2,P＜0.01).脑缺血/再灌注后72h时点,与sham组比较,I/R组大鼠CA1区细胞内游离Zn2+聚集增加,GSH组神经元游离Zn2+聚集较I/R组有所减少.脑缺血/再灌注后6h时点,I/R组海马CA1区神经元泛素蛋白结合物的表达(10.25±1.23)较sham组(3.68±0.46)和GSH组(7.20±0.97)明显增多(P＜0.01),后两组比较有统计学差异(P＜0.01).结论 GSH可通过螯合神经元内游离Zn2+和降低泛素蛋白结合物聚集对大鼠脑缺血/再灌注损伤发挥保护作用.     

异丙酚预处理对全脑缺血再灌注大鼠脑组织S100β和神经元特异性烯醇化酶的影响

目的探讨异丙酚预处理对全脑缺血再灌注大鼠脑组织S100β及神经元特异性烯醇化酶（NSE）含量的影响，评价异丙酚对脑组织的保护作用。方法30只雄性SD大鼠，随机分为假手术组（A组）、单纯脑缺血再灌注组（B组）和缺血前2h异丙酚预处理组（C组），每组10只，C组动物在缺血前腹腔注射异丙酚100mg／kg，采用线栓法制作全脑缺血再灌注模型，于脑缺血再灌注后24h评估并记录动物的神经行为学评分，测定大鼠脑组织S100β和NSE含量。结果异丙酚预处理组神经行为学评分较单纯脑缺血再灌注组高（P〈0．05），假手术组评分也明显高于单纯脑缺血再灌注组（P〈0．05），异丙酚预处理组脑组织中S100β和NSE含量明显低于单纯脑缺血再灌注组（P〈0．05）。结论异丙酚可以降低脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织S100β和NSE的含量，减轻神经损害，缺血前2h异丙酚预处理可以改善大鼠脑缺血再灌注损伤后的神经行为学评分，有明显的脑保护作用。     

脑缺血选择性海马CA1区神经元损害的实验研究

目的　探讨缺血性脑神经元损伤的机制。方法　采用Pulsinellis Brierley四管阻塞脑缺血模型观察大鼠全脑缺血 2 0min再灌流 8h(早期 )的c fos基因表达及再灌流 7d(晚期 )海马CA1区迟发性神经元损害。结果　缺血再灌流早期免疫组化显示 :海马CA1区极小c fos表达 ,而齿状回、海马CA3区、杏仁核大量c fos表达。缺血再灌流晚期镀银染色显示 :海马CA1区神经元及其突触终末呈黑色溃变 (坏死 ) ,而齿状回、海马CA3区、杏仁核呈金黄色正常相。相邻切片HE染色示 :缺血组海马CA1区核完整的锥体细胞数 (5± 2 .6个 2 0 0um)与其对照组 (4 0± 2 .9个 2 0 0um)比较差异有显著意义 (P <0 .0 1)。结论　脑缺血诱导的c fos基因表达对缺血易损的海马CA1区迟发性神经元坏死可能起直接的调节作用。     

兔肺动脉栓塞再灌注肺泡细胞凋亡及调控基因的实验研究

目的 探讨兔肺动脉栓塞／再灌注损伤中的细胞凋亡及其基因调控机制。方法 健康新西兰白兔36只，雌雄不拘，运用5F Berman球囊堵塞左下肺动脉，然后球囊放气，复制肺动脉栓塞缺血再灌注模型，随机分为6组：对照组，假手术组，肺栓塞1h组、肺栓塞2h组，肺栓塞2h再灌注1h组、肺栓塞2h再灌注2h组。实验结束取肺组织，测定肺组织湿干比，采用流式细胞分析法检测肺组织细胞凋亡率和免疫组织化学法检测肺上皮细胞Bax、Bcl-2、Fas／FasL蛋白表达的变化。结果兔肺动脉栓塞时肺组织细胞凋亡明显增加，再灌注后1h、2h凋亡细胞继续增加，并随着再灌注时间延长而增加（P〈0．05），Bax、Fas及FasL蛋白表达在肺动脉栓塞缺血及再灌注后明显增加（P〈O．01）。肺泡上皮细胞凋亡指数与肺组织湿干比、Bax、Fas、FasL蛋白表达之间存在非常显著的正相关关系（r=0．721，0．806，0．820，0．820；P〈0．01），与Bcl-2、Bcl-2／Bax比值呈显著负相关关系（r=-0．602，-0．829；P〈0．01）。结论肺动脉栓塞／再灌注中诱导肺组织细胞凋亡增加，肺组织细胞凋亡和Bax、Bcl-2，Fas、FasL系统活化可能参与了肺栓塞缺血再灌注肺损伤的发生。     

大鼠脑缺血再灌注的磁共振扩散加权成像研究

目的：采用磁共振扩散加权成像（DWI）评价大鼠脑缺血早期再灌注的动态变化,观察缺血早期再灌注对脑梗死的保护作用。方法：选取16只SD雄性大鼠,采用线栓法制作右侧大脑中动脉闭塞（MCAO）脑缺血模型,随机分为缺血再灌注组（缺血2h后再灌注）及对照组（永久性缺血）,每组8只。分别于制作MCAO模型后30min、2h、6h、12h及24h行MRI扫描。计算并比较缺血再灌注组与对照组大鼠每次扫描的脑梗死体积、脑梗死体积的增长率、脑梗死最大层面梗死区域的ADC值和rADC值。磁共振检查结束后处死大鼠,断头取脑行HE染色,并与DWI结果进行比较。结果：缺血再灌注组和对照组大鼠MCAO后DWI均显示右侧大脑中动脉供血区异常高信号,ADC图上为低信号。MCAO后2h、6h、12h及24h的DWI图上缺血再灌注组体积增长率均低于对照组,仅12h及24h时差异有统计学意义（P〈0.05）。MCAO后30min缺血再灌注组与对照组梗死区ADC值及rADC值差异均无统计学意义（P〉0.05）,但2h、6h、12h及24h时缺血再灌注组梗死区ADC值及rADC值均明显小于对照组（P〈0.05）。缺血再灌注组与对照组大鼠MCAO后HE染色均显示脑梗死灶体积与相应DWI层面差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：DWI是评价超早期脑梗死再灌注的敏感方法,为脑梗死的疗效评价提供客观依据。     

大鼠急性心肌缺血再灌注心肌细胞凋亡与Bcl—2／Bax蛋白的表达

目的：为了证实急性心肌缺血再灌注过程中存在着不同程度的心肌细胞凋亡现象,初步研究心肌细胞凋亡与Bcl-2/Bax蛋白表达的关系。方法：电镜观察心肌细胞的超微结构变化,抽提心肌组织DNA琼脂糖凝胶电泳,TUNEL法原位标记凋亡的心肌细胞,免疫组化技术和图像分析技术检测心肌细胞内Bcl-2/Bax蛋白表达。结果：缺血及再灌注组电镜观察心肌细胞出现典型凋亡超微结构特征,TUNEL染色可见不同程度的心肌细胞凋亡阳性反应,DNA电泳显示在缺血再灌注2h组出现明显的DNA ladder,再灌注较在缺血组心肌细胞中Bcl-2表达明显降低（P＜0．05）,而Bax表达明显增高＊（P＜0．05）,结论：急性心肌缺血及再灌注能诱导不同程度的心肌细胞凋亡,Bcl-2/Bax基因对心肌细胞凋亡的发生有着重要的调控作用。     

转化生长因子活酶激酶抑制剂减轻脑缺血再灌注损伤的研究

目的：探讨转化生长因子活酶激酶抑制剂TAK1抑制剂5Z-7-oxozeaenol对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法：线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型。健康雄性SD大鼠36只（250~320g）,随机分为6组：假手术组、缺血组、溶剂组和5Z-7-oxozeaenol低剂量、中剂量和高剂量组。再灌注24h后进行神经功能评分（NBS）,TI＇C染色测定梗死面积,TUNEL染色检测神经细胞凋亡,并检测大鼠脑组织匀浆中SOD、MDA、TNF-α、IL-1β变化。结果：与缺血组相比,5Z-7-oxozeaenol高剂量组脑梗死容积明显减少,神经行为学评分提高,缺血半暗区神经细胞凋亡数减少（P〈0.05）,SOD活性明显升高,MDA、TNF-α、IL-1β含量明显降低（P〈0.05）。结论：转化生长因子活酶激酶抑制剂对大鼠脑缺血再灌注损伤有明显的保护作用,其机制可能与抑制TAK1活化、抑制细胞凋亡有关。     

大鼠局灶脑缺血和(或)再灌流模型中IL-1β的表达及其与白细胞浸润的关系

目的　探讨白细胞介素 1(IL 1)在脑缺血和 (或 )再灌流中的动态变化及其与白细胞浸润的关系。方法　采用大鼠大脑中动脉梗塞模型 ,分别用免疫组织化学方法检测IL 1β、酶组化方法检测髓过氧化物酶 (MPO)的动态变化 ,用图象分析进行定量分析。结果　显示缺血 3h及再灌流 0 .5hIL 1β表达增高 (P <0 .0 5 )并逐渐增高 ,2 4h达高峰 (P <0 .0 1) ,在持续缺血 12 0h仍有意义 ,而再灌流 12 0hIL 1β恢复至缺血前水平 (P >0 .0 5 )。缺血组和缺血再灌流组IL 1β与MPO水平呈非常显著正相关 (P <0 .0 1)。结论　提示缺血脑区IL 1β是由局部神经元、星形细胞和血管内皮细胞合成 ,其介导的缺血再灌流损伤与白细胞浸润有密切关系 ,说明在脑缺血和 (或 )再灌流损伤中 ,高浓度的IL 1β是一个重要因素。     

右美托咪啶对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用

目的探讨右美托咪啶对大鼠急性肝缺血再灌注损伤（ischemiareperfusioninjury,IRI）的保护作用。方法sD大鼠32只,随机分为对照组（S组）、缺血-再灌注组（IR组）、右美托咪啶组（Dex组）、右美托咪啶＋育亨宾组（Dex＋Yoh组）,每组8只。IR组制备大鼠肝缺血再灌注模型。Dex组通过尾静脉以5μg／（kg·h）的速度持续泵注右美托咪啶1h,余同IR组。Dex＋Yoh组静脉输注右美托咪啶前10min,静脉注射育亨宾1mg／kg,其余同Dex组。分别测定血清AST、ALT活性,肿瘤坏死因子-α（TNF-α、自细胞介素-6（IL-6）浓度,肝组织超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量,光镜观察肝组织的病理学变化。结果与S组比较,IR组血AST、ALT、TN-α、IL-6,肝组织MDA水平显著增加,SOD水平下降（P〈0．05）;与IR组比较,Dex组血AST、ALT、TNF-α、IL-6下降（P〈0．05）,肝组织SOD水平升高,MDA水平下降（P〈0．05）,Dex＋Yoh组无显著变化（P〉0．05）;形态学上,病理损伤程度与生化指标相符合。结论右美托咪啶能减轻肝缺血再灌注损伤,其机制可能是激活d,肾上腺素受体,抑制氧自由基反应和炎性因子的释放。     

兔肾缺血-再灌注损伤后叶间动脉血流动力学变化与肾小管上皮Bcl-2表达的相关性

目的 探讨兔肾缺血-再灌注损伤后叶间动脉血流动力学变化及其与肾小管上皮Bcl-2表达的相关性.材料与方法 建立兔肾缺血-再灌注损伤模型,采用彩色多普勒血流显像(CDFI)和脉冲多普勒(PW)检测缺血-再灌注组(I/R组,n=24)兔和假手术组(S组,n=24)兔恢复血流后2h、8h、24h肾叶间动脉血流参数,包括收缩期峰值流速(Vmax)、舒张末期流速(Vd)、时间平均峰值流速(Tamax)、搏动指数(PI)和阻力指数(RI);以HE染色分析肾组织病理损伤程度;采用免疫组化SABC法检测肾小管上皮细胞中Bcl-2蛋白表达水平.结果 I/R组在2h时较S组无明显血流动力学改变,随着缺血-再灌注时间J延长,Vmax、PI、RI逐渐增大,24h时达高峰,其中RI24h较8h差异有统计学意义(P＜0.05);病理切片显示I/R组24h时肾小管上皮细胞坏死脱落程度最重;S组Bcl-2蛋白呈弱阳性表达,随着缺血-再灌注时间推移而逐渐上升,24h达高峰;叶间动脉Vmax、PI、RI与Bcl-2表达呈显著正相关(r=0.572、0.416、0.647,P＜ 0.05).结论 在兔肾缺血-再灌注中,肾叶间动脉血流动力学变化与肾小管上皮Bcl-2表达呈明显正相关,彩色多普勒超声对评价兔肾缺血-再灌损伤程度有较高价值.     

肾缺血再灌注损伤对大鼠肾脏CD44表达的影响

目的观察大鼠肾缺血再灌注损伤（RIRI）对肾脏CD44表达的影响。方法健康Wistar大鼠48只,体重300～350g,随机分为4组（n=12）：假手术组（sham组）只分离肾动脉不夹闭;肾缺血60min再灌注1h组（I/R1h组）,双肾缺血60min再灌注1h;肾缺血60min再灌注4h组（I/R4h组）,双肾缺血60min再灌注4h;肾缺血60min再灌注24h组（I/R24h组）,双肾缺血60min再灌注24h。实验结束处死大鼠,抽血检测血清CD44含量,光镜观察肾脏组织形态学改变,免疫组化检测肾脏CD44分子的表达。结果光镜观察sham组肾组织肾小球较多,肾小管结构完整。I/R各组肾小球毛细血管扩张、淤血,部分肾小球纤维化,体积缩小,大量肾小管细胞水肿、变性,宫腔缩小,部分肾小管腔闭合。其中以I/R4h组形态学改变最明显。I/R各组血清CD44含量分别为（0.88±0.03）ng/ml、（10.22±3.01）ng/ml、（40.12±6.59）ng/ml、（8.12±1.59）ng/ml,肾组织表达分别为0.41±0.024、14.35±5.262、36.357±8.774、10.317±3.726,各组表达均较sham组升高,但是I/R4h组高于其他组（P〈0.05）。结论大鼠肾脏缺血再灌注后CD44表达增加,再灌注4h达到峰值,24h开始回落。     

高压氧对局灶性脑缺血再灌注大鼠紧密连接蛋白及血脑屏障通透性的影响

目的 探讨高压氧(HBO)对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织中紧密连接蛋白occludin、ZO-1蛋白表达及血脑屏障通透性的影响.方法 雄性Wistar大鼠,随机分成假手术组、脑缺血再灌注组、HBO+脑缺血再灌注组、HBO组.复制局灶性脑缺血再灌注模型,并于再灌注期间行0.25 MPa HBO治疗5次,在处死动物前1 h经尾静脉注射2%伊文思蓝(Evans blue,EB),采用EB法检测缺血再灌注后血脑屏障通透性的变化.应用免疫组织化学的方法观察缺血再灌注后脑组织中occludin蛋白的分布,再采用Western Blot法检测再灌注72 h后脑组织中occludin、ZO-1蛋白表达水平的变化.结果 脑缺血再灌注组较假手术组脑组织EB含量显著增高(P＜0.01),其中EB的渗出以4 h最为明显(1.14±0.07)U/mg.HBO+脑缺血再灌注组较脑缺血再灌注组脑组织中EB含量显著降低(P＜0.01),HBO组与假手术组相比脑组织中EB含量变化不明显(P＞0.05).Occludin蛋白的表达Oh时相比于再灌注后4、12、24、48、72 h时显著降低(P＜0.01).现灌注72 h时,HBO+脑缺血再灌注组较脑缺血再灌注组脑组织中occludin、ZO-1蛋白表达水平于再灌注72 h明显增加(P＜0.01);HBO组与假手术组相比脑组织中occludin、ZO-1蛋白表达变化不显著(P＞0.05).结论 HBO可明显增加脑缺血再灌注脑组织中紧密连接相关蛋白occludin、ZO-1的表达,从而降低血脑屏障通透性.

Abstract：

Objective To investigate effects of hyperbaric oxygen (HBO) on the occludin and ZO-1 in the brain tissues and permeability of blood brain barrier (BBB) after cerebral ischemia-reperfusion in mice. Methods Male Wistar mice were randomly divided into 4 groups; the sham group, the ischemia-reperfusion group (IR) , the HBO group and the IR + HBO group. Following development of the cerebral ischemia reperfusion model, 5 sessions of HBO at 0.25 Mpa were applied during the reperfusion period, and 2% Evens blue (EB) was injected into the tail veins an hour before the animals were executed. Following ischemia reperfusion, changes in the permeability of BBB were monitored with the EB method. Following ischemia reperfusion, the distributions of occludin and ZO-1 in the brain tissue were observed with immunohistochemical method, and the expressions of occludin, ZO-1, and the contents of EB were determined by Western Blot and spectrophotometer. Results When compared with that of the sham group, the levels of EB in the brain tissue for the IR group increased significantly, reaching peak at 4 h following IR injury (P＜0. 01). In the IR + HBO group, EB contents in the brain tissue decreased significantly, when compared with those of the IR group ( P＜ 0.01). However, no significant changes in the expression of occludin, ZO-1 and the content of EB in the brain tissue could be noted in the HBO, when compared with those of the sham group (P＞0.05). In the IR group, the expressions of occludin and ZO-1 at 4, 12, 24, 48, 72 h after reperfusion decreased significantly, when compared with those at 0 h( P＜0. 01). However, for the IR + HBO group, the expressions of occludin and ZO-1 at 72 h after reperfusion increased markedly (P＜0. 01). No obvious changes in the expression of occludin and ZO-1 could be noted in the brain tissue in the animals in the HBO group, when compared with those in the sham group (P＞0. 05). Conclusions HBO intervention could increase markedly the expressions of occludin and ZO-1 in the ischemia-reperfusion brain tissue, thus decreasing permeability of BBB.     

法舒地尔预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤细胞色素C和caspase-3表达的影响

目的研究法舒地尔对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤细胞色素C（CytC）和caspase-3蛋白表达的影响,探讨其脑保护机制。方法线栓法制作大鼠中动脉缺血再灌注损伤模型。成年雄性SD大鼠120只随机分成3组：假手术组（Sham组）、脑缺血再灌注模型组（Mod组）、法舒地尔干预组（Fas组）,再分为再灌注3h、12h、24h和48h,以及TTC染色组5个亚组,每组8只大鼠。缺血再灌注后进行神经功能缺损评分（NDS）,免疫组织化学方法检测脑组织中CytC蛋白、cas-pase-3的表达,TTC染色测量鼠脑梗死体积并计算百分比。结果①Sham组大鼠无神经功能缺损,NDS评分为0,TTC染色亦未见脑组织梗死;Mod组和Fas组大鼠均有明显的神经功能缺损,TTC染色亦可见明显的脑组织梗死;但与Mod组相比,Fas组神经功能缺损少、NDS评分低（P〈0.01）,脑梗死体积减小（P〈0.05）。②与Sham组相比,脑缺血再灌注后,Mod组和Fas组大鼠脑组织CytC和caspase-3的表达显著升高（P〈0.01）,其中CytC表达高峰出现在12h,caspase-3表达高峰出现在24h;Fas组和Mod组间比较显示Fas组CytC和caspase-3的表达又显著低于Mod组（P〈0.01）。结论①法舒地尔能减轻大鼠脑局灶性缺血再灌注引起的神经功能缺损,减小脑梗死体积。②部分抑制脑缺血再灌注引起的CytC和caspase-3表达增加可能是法舒地尔的脑保护机制之一。