尿液外泌体蛋白质组学在糖尿病肾病无创性诊断中价值

目的筛选糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)患者与单纯2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)患者尿液外泌体中最优差异表达蛋白,探讨蛋白质组学在T2DM患者DN诊断中的价值。方法经肾脏穿刺活检组织病理检查确诊的DN患者12例,随机选取4例为DN筛选蛋白组,余8例DN患者为DN蛋白验证组;单纯T2DM不合并肾功能损害患者8例,随机选取4例为T2DM筛选蛋白组,余4例为T2DM蛋白验证组。分别收集DN筛选蛋白组与DN蛋白验证组患者肾脏穿刺活检前及T2DM筛选蛋白组与T2DM蛋白验证组患者晨起尿液标本,采用超高速离心联合0.22μm超滤法分离纯化尿液外泌体,应用透射电镜观测尿液外泌体形态特征,采用纳米颗粒跟踪分析尿液外泌体粒径;采用Western blot法检测4组尿液外泌体中经典外泌体识别蛋白ALIX、TSG101、Syntenin、CD9阳性表达情况;采用数据非依赖性采集质谱法鉴定4组患者尿液外泌体蛋白质及其表达量,分析DN筛选蛋白组与T2DM筛选蛋白组肾脏疾病生物途径相关的最优差异表达蛋白;比较DN蛋白验证组与T2DM蛋白验证...     

尿液外泌体miRNA与肾脏疾病关系的研究进展

外泌体是细胞分泌的细胞外囊泡结构,可通过其携带的miRNA、蛋白质、脂质等活性分子来调节受体细胞生物学活性,在细胞间的通讯交流过程中发挥重要作用。最新研究表明,多种肾脏疾病患者尿液外泌体miRNA含量均发生改变,其变化可反映肾功能,且具有作为肾脏疾病分子标志物的潜能。该文就尿液外泌体miRNA在肾脏疾病的水平及其诊断价值作一综述。     

外泌体在糖尿病肾病中的研究进展

糖尿病肾病(DN)为糖尿病常见的微血管并发症,是导致糖尿病患者终末期肾衰竭的主要原因,也是糖尿病的主要死因之一[1]。DN发病机制复杂多样,目前临床尚无有效手段能阻止DN的发生与发展。因此,深入了解其发病机制,对早期诊断和防治DN具有重要的临床意义。外泌体作为细胞与细胞间信号传递的重要载体,参与多种肾脏疾病的发生、发展,本文主要就外泌体在DN中的研究进展予以综述。     

外泌体miRNA与心血管疾病研究进展

心血管疾病主要发生在中老年人群中,它的发生率和病死率较高,目前中国每年约300万的人死于心血管疾病[1]。因而,对疾病做出早期诊断,有利于对患者进行早期治疗,促进患者早期康复。同时,了解疾病的病理过程和发病机制,有利于对疾病的进展以及预后作出判断。     

1型糖尿病患者血浆外泌体蛋白质组学分析

目的探讨1型糖尿病(T1DM)患者与健康者血浆外泌体中蛋白质组学的差异。方法收集T1DM患者与健康者血浆各6例,用试剂盒分离外泌体,提取蛋白,TMT标记后,采用高效液相色谱-质谱联用鉴定T1DM患者与健康者血浆外泌体中蛋白表达的差异,并进行生物信息学分析。结果共检测到可定量蛋白质948个,并确定其中37个在T1DM患者血浆外泌体中表达上调,122个表达下调。差异表达的蛋白质涉及多个生物进程,集中于凝血与补体级联反应、胆固醇代谢及沙门氏菌感染等信号通路。结论鉴定出159个在T1DM患者血浆外泌体表达具有差异的蛋白质,为进一步阐明T1DM发病机制及治疗靶点筛选提供了新的候选分子。     

2型糖尿病患者外周血miRNA表达谱差异研究

目的 对2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者外周血血清miRNA差异表达分析,为筛选出T2DM发生发展有关的miRNA分子标记物奠定基础,从而为T2DM预防、早期诊断和治疗方案提供指导。方法 采用GeneChip^TM miRNA 4.0 Array筛选3组受试者外周血血清(T2DM组、T1DM组、对照组)的差异miRNA,并对差异miRNA进行靶基因预测和靶基因信号通路富集分析(KEGG)。结果 T2DM组分别与对照组,T1DM组相比,hsa-miR-505-3p和hsa-miR-548an均上调,hsa-miR-296-3p,hsa-miR-3160-5p,hsa-miR-33a-5p,hsa-miR-572和hsa-miR-96-5p均下调。通过靶基因预测和Pathway分析,筛选出5个miRNA(hsa-miR-505-3p,hsa-miR-548an,hsa-miR-296-3p,hsa-miR-3160-5p,hsa-miR-33a-5p,hsa-miR-572和hsa-miR-96-5p)、7个基因(MTOR,SLC2A2,PRKCE,IRS2,IRS1,MAPK8,MAPK10)可能与2型糖尿病胰岛素抵抗相关。结论 该研究筛选出的5个miRNA和7个基因,可为2型糖尿病胰岛素抵抗的研究提供理论基础。     

2型糖尿病肾病患者尿液电导率测定分析

目的 分析2型糖尿病肾病患者尿液电导率的变化以评价肾脏的浓缩功能.方法 将142例2型糖尿病肾病患者按尿白蛋白排泄率分为A、B、C3组,D组为健康对照组(n=50),分别检测各组人群的尿液电导率,分析它们在各组人群中有何不同.结果 A组尿液电导率明显低于其他3组(P＜0.05),B组尿液电导率低于C、D两组(P＜0.05),C组尿液电导率低于D组(P＜0.05).结论 随着2型糖尿病肾病病情的进展,尿液电导率逐渐降低,尿液电导率可作为2型糖尿病肾病患者微循环障碍的临床观察指标,进而评价患者肾脏浓缩功能,为临床提供科学依据.     

外泌体miRNA在胰腺癌研究中的进展

外泌体是直径为30～100 nm的囊泡样小体,能通过与靶细胞的细胞膜融合、胞吞作用等方式将其携带的微小RNA(miRNA)、蛋白质等传递至靶细胞中,介导细胞间的信息交流并调控细胞的生理功能。近年研究发现,外泌体miRNA在胰腺癌(PC)的发生、发展及诊断中具有重要作用,有望为PC的诊断和治疗提供新的思路。文章结合国内外研究现状,对外泌体miRNA在PC中的作用进行综述。     

外泌体miRNA在产前诊断中的研究进展

外泌体是由活细胞分泌的一种微小囊泡,包含着蛋白质,mRNA和microRNA等多种生物活性物质,通过调控受体细胞各种生理病理功能,参与一系列的生物过程,如参与细胞免疫应答、炎症反应、细胞凋亡、指导肿瘤细胞生长发育等。外泌体miRNA作为外泌体生物活性物质在疾病的早期诊断、临床治疗及其预后发挥着重要作用,其在各领域的应用也成为研究热点。产前诊断主要针对胎儿出生前,对胎儿是否患有某种疾病的诊断,从而防止严重遗传病,先天性疾病或智力障碍患儿的出生。外泌体miRNA存在于血清和多种细胞外液中,也存在于羊水、胎盘和乳汁中。外泌体miRNA在产期诊断中的临床作用也引起越来越多研究者的关注。本文就外泌体miRNA在产前诊断中的应用前景做一综述。     

外泌体miRNA在缺血性脑血管病中作用的研究进展

缺血性脑血管病是导致全球人口死亡的三大疾病之一,近年来有关外泌体与缺血性脑血管病的关系逐渐成为研究的热点。外泌体是细胞膜向内凹陷释放的细胞外囊泡,携带多种蛋白质、脂质和核酸等生物活性分子,介导细胞间的物质传递与信号转导,参与机体多种生理、病理过程。外泌体可作为多种疾病诊断的生物标志物,在病情、预后、治疗效果评估中具有重要价值。本文就外泌体miRNA在缺血性脑血管病发病、诊断、治疗中应用的研究进展作一综述。     

2型糖尿病肾病患者尿液电导率水平变化的临床意义

目的探讨尿电导率(Cond)水平变化对2型糖尿病(T2DM)肾病患者病程进展的临床意义。方法选取武警后勤学院附属医院T2DM患者138例,按24h尿清蛋白定量(24h-UAE)将其分为正常蛋白尿(NUA)组、微量蛋白尿(LUA)组和大量蛋白尿(MUA)组3个组;然后对其中107例患者按肾小球滤过率重新分为糖尿病肾病(DN)组和糖尿病肾轻度损伤(DC)组。利用Sysmex UF-1000i流式尿液分析仪检测尿液Cond,利用ARKRAY AUTION MAX AX-4280分析仪检测尿液比重(SG),利用BNⅡ全自动蛋白分析仪检测尿液微量清蛋白(U-Alb)。结果MUA组Cond为(14.1±4.5)ms/cm,显著低于LUA组(15.7±4.3)ms/cm(P0.05),而LUA组Cond又显著低于NUA组(17.6±5.7)ms/cm(P0.05);MUA组SG为1.011(1.009~1.012),显著低于NUA组1.014(1.010~1.019)和LUA组1.015(1.010~1.020)(P0.05)。Cond与SG正相关(r=0.63,P0.05),与24h-UAE负相关(r=-0.183,P0.05)。DN组尿Cond水平为(13.2±4.3)ms/cm,显著低于DC组(15.0±4.4)ms/cm(P0.05),DN组与DC组间SG差异无统计学意义(P0.05)。Cond的ROC曲线下面积为0.612(0.502~0.723),当界值设定为11.85时,Cond诊断DN的灵敏度为43.8%,特异度为78.0%。结论尿Cond水平的变化可以反映2型糖尿病肾病的病程进展,但是不能作为其早期筛查指标。     

同种异体血液输注对创伤性失血患者血浆外泌体miRNA表达的影响

目的 通过观察异体输血对创伤性失血患者外泌体miRNA的差异表达,筛选出差异表达的外泌体miRNA,为后续靶基因和通路的研究奠定基础。方法 分别采集外伤患者在输异体血前和输血后外周血标本各3例,通过对血浆标本分离收获后的外泌体miRNA高通量测序,分析比较输血前后两组外泌体miRNA差异表达情况,同时以荧光定量PCR法进一步验证差异基因表达情况。结果 通过高通量测序分析,共测序到1570个miRNA存在差异表达,实验组比较对照组,上调的有1189个,下调的有381个,以倍数变化Foldchange≥2.0,P-value≤0.05作为差异miRNA筛选的阈值,筛选出显著变化的差异表达miRNA有14个,其中显著上调的miRNA有5个,分别为miR-499a-5p、miR-200a-3p、miR-372-3p、miR-novelchr12＿5583、miR-novel-chr22＿24253;显著下调的miRNA有9个,分别为miR-6852-5p、miR-452-5p、miR-1287-5p、miR-204-3p、miR-375-3p、miR-502-3p、miR-345-5p、miR...     

胃癌患者血清外泌体中DANCR表达及其临床意义

目的检测胃癌患者血清外泌体(exosome)中抗分化非编码RNA(DANCR)的表达水平并分析其临床应用价值。方法采用实时荧光定量RT-PCR检测胃癌细胞培养上清和胃癌患者血清exosome中DANCR表达水平,分析其与临床病理资料的相关性,绘制ROC曲线评价其诊断效能。结果 DANCR在人胃癌细胞系HGC-27中表达水平(4.43±0.37)明显高于胃黏膜上皮细胞(1.01±0.01),差异有统计学意义(P0.05)。HGC-27细胞培养上清exosome中DANCR表达水平(3.06±0.14)明显高于GES-1细胞(1.01±0.20),差异有统计学意义(P0.05)。DANCR在胃癌患者血清exosome中的平均含量[5.060(1.380,22.785)]较胃良性疾病患者[0.535(0.340,1.380)]和体检健康者[1.200(0.605,1.655)]明显升高(Z分别为-3.409,-4.229,P均0.01),且与肿瘤大小、TNM分期以及淋巴结转移相关。胃良性疾病患者与体检健康者相比,血清exosome中DANCR含量差异无统计学意义(Z=-1.308,P0.05)。胃癌患者血清exosome中DANCR的ROC曲线下面积(AUCROC)为0.777,95%可信区间(CI)为0.678~0.876,cut-off值2.50,敏感性为68.6%,特异性为84.4%。结论胃癌患者血清exosome中DANCR表达水平升高,有望成为胃癌诊断的新指标。     

青少年肥胖非酒精性脂肪肝患者血清外泌体源性miRNA表达谱的初步研究

目的分析非酒精性脂肪肝(NAFLD)与单纯肥胖对照者血清外泌体微小RNA(miRNA)表达谱的差异,为筛选外泌体源性miRNA作为NAFLD早期诊断标记物提供依据。方法选择5例NAFLD患者(NAFLD组)和5例单纯肥胖患者(对照组),采集外周血血清,使用高通量测序方法测定外泌体源性miRNA表达谱,并通过实时荧光定量PCR验证部分差异性表达的miRNA,预测靶基因及功能分析。结果NAFLD组与对照组相比差异表达的外泌体源性miRNA共30种(P<0.05),当倍比值>2且P<0.05的差异性miRNA有9种,其中5种表达上调(miR-122-5p,miR-3591-3p,miR-335-5p,let-7g-3p和miR-27a-5p),4种表达下调(miR-6753-3p,miR-129-2-3p,miR-6760-5p,miR-6516);对miR-122-5p、miR-335-5p、miR-27a-5p进行实时荧光定量PCR,结果与测序结果一致。差异表达miRNA的功能分析结果提示涉及葡萄糖稳态、脂质代谢、肝脏发育等。结论NAFLD组血清外泌体源性miRNA表达谱与对照组有明显差异,miR-122-5p、miR-335-5p、miR-27a-5p可能参与了NAFLD的发病机制,可以作为NAFLD早期诊断的标记物。     

血小板miRNA的表达谱分析

目的:研究在体外常规储存1、3和5 d血小板微小RNA(mi RNA)的表达谱,探讨mi RNA在血小板储存期的变化。方法:留取来自无偿献血捐献者单采血小板20份,摇匀后等量混合,贮存于(22±2)℃恒温血小板振荡保存箱中。分别在d 1、3和5取样(分别命名为C₁、C₃和C₅),应用DNA纳米球(DNB)测序技术对血小板mi RNA组进行测序,采用每千百万碱基的转录本(TPM)算法标准化mi RNA的表达水平,组间mi RNA表达差异>2倍(P<0.001)认为表达差异具有统计学意义。采用实时荧光定量PCR方法验证mi RNA的表达。结果:通过DNB测序,分别获得C₁、C₃和C₅组688、730和679个表达的血小板mi RNA,聚类分析表明其表达谱发生明显变化。在C₁、C₃和C₅组中前20个高表达mi RNA的表达量约占各组mi RNA总表达量的4/5,各组前5位的mi RNA...     

外泌体miRNA作为肿瘤微环境调节剂的研究进展

在癌症的发展过程中,外泌体常常发挥着重要的作用.肿瘤微环境中,各类细胞均能够释放外泌体,并通过其中生物活性分子的传递来调节肿瘤微环境.外泌体中的微小RNA(miRNA)通过细胞对外泌体的摄取而发挥各种作用,如影响肿瘤微环境中的免疫细胞,调节癌细胞的增殖及凋亡,通过控制上皮-间质转化过程和血管生成在肿瘤转移中发挥调节作用...     

尿液外泌体提取优化及冷冻对外泌体RNA含量的影响

目的对现有沉淀法提取尿液外泌体进行优化,并探讨不同的储存条件对尿液外泌体RNA含量的影响。方法分别用先浓缩后沉淀法和直接沉淀法提取人尿液标本中的外泌体,比较两种方法的分离效率和成本;采用ExoQuick-TC~(TM)沉淀试剂盒提取外泌体;纳米粒子跟踪分析技术(NTA)检测外泌体浓度及粒径分布;动态光散射技术(DLS)检测外泌体电位;透射电镜(TEM)观察外泌体形态;western blot检测外泌体标记分子CD63及Alix蛋白的表达;另取10例临床尿液标本验证先浓缩后沉淀的提取方法,以证实优化方法的可靠性。实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测20例前列腺癌患者尿液外泌体经过反复冻融(新鲜、1、3、5次)及9例前列腺癌患者尿液外泌体在-80℃冷冻不同时间(新鲜、1周、2周、1个月)时外泌体RNA标志物let-7c和PSA mRNA的表达量,并采用Wilcoxon秩和检验进行统计学分析。结果 NTA检测两种方法提取的外泌体粒径分布为30～150 nm,均为单峰;DLS结果显示,两种方法提取的外泌体电位均呈负值;透射电镜观察两种方法提取的外泌体大小较为一致,直径分布为30～150 nm;western blot检测证实优化方法存在外泌体标记分子CD63及Alix蛋白;10例尿液标本提取的外泌体浓度约为10~9～10~(11) particles/mL。外泌体经过5次冻融后let-7c和PSA mRNA含量明显下降,Z值分别为-1.69、-1.73(P均0.05)。而外泌体在-80℃冷冻1个月后其RNA含量保持稳定。结论优化后的外泌体提取方法在保证外泌体浓度和质量的前提下极大地降低成本,分离得到的外泌体在-80℃短时间冷冻后其RNA含量保持稳定,但不能反复冻融超过5次。     

单纯性2型糖尿病与糖尿病肾病患者尿液中α1-微球蛋白和激肽原1的表达分析

目的研究尿α1-微球蛋白(α1-MG)和尿激肽原1(KNG1)水平在单纯性2型糖尿病与糖尿病肾病患者中的表达变化情况。方法选取2016年9月～2017年3月在宁夏医科大学总医院住院的糖尿病肾病患者34例作为实验组(DN组)以及同时期单纯性2型糖尿病患者32例作为对照组(DM组),其中,DN组包括甲组(HbA1c10%)19例和乙组(HbA1c≥10%)15例。测定尿α1-MG和尿KNG1及各项生化指标。结果与DM组相比,尿α1-MG在DN组下降(t=9.972,P0.01),尿KNG1在DN组升高(t=-3.356,P0.01),差异均具有统计学意义;DN乙组尿α1-MG、血清GLU水平均高于DN甲组(t=-2.092,-3.464,均P0.05),DN乙组血清Cr水平低于DN甲组,差异具有统计学意义(t=2.181,P0.05);此外,在DN组,根据Pearson相关分析显示,尿α1-MG与HbA1c,尿KNG1呈正相关(r=0.33和0.355,均P0.05),其它未见明显相关。结论尿α1-MG和KNG1的表达在DN的发生发展中存在一定的变化规律,可为DN的临床诊断提供依据。     

糖尿病肾病患者尿液miR-192的表达及临床意义

目的探讨miR-192在糖尿病肾病(DN)患者尿液中的表达及其临床意义。方法选择140例2型糖尿病患者(T2DM)作为研究对象,按照24h尿清蛋白定量(24h-UAE)将其分为正常蛋白尿组(n=55)、微量蛋白尿组(n=48)、大量蛋白尿组(n=37)。另选择30例健康体检者作为对照组。采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测尿液miR-192的表达水平。分析其与患者各临床指标的相关性。结果正常蛋白尿组、微量蛋白尿组、大量蛋白尿组患者尿液miR-192表达相对值分别为(0.63±0.12,0.97±0.20和1.12±0.18),明显高于对照组(0.47±0.08);且表现为随DN的发展而逐渐增加的趋势(P0.05)。相关性分析结果显示尿液miR-192水平与血肌酐、血尿素氮、24h尿蛋白和胱抑素C呈正相关(P0.05);而与糖尿病病程、空腹血糖和糖化血红蛋白无明显相关性(P0.05)。线性回归分析结果显示尿液miR-192水平与DN有相关性(OR=1.037、1.094,P0.05),是T2DM患者发生DN的独立预测因子。结论 miR-192水平在DN患者尿液中表达显著升高,其水平反映DN患者肾功能损伤,并与肾功能损伤的程度相关。