短发夹RNA干扰表达质粒逆转人大肠癌细胞LOVO／5-Fu多药耐药的研究

目的：探讨短发夹RNA（shRNA）沉默多药耐药MDR）基因对大肠癌多药耐药细胞株LO-VO/5-Fu生长的影响。方法：构建靶向MDR1的shRNA干扰质粒转染人大肠癌多药耐药细胞株LO-VO/5-Fu,MTT法检测各组细胞对5-Fu的敏感性,流式细胞术检测细胞周期变化、凋亡情况及P-糖蛋白（P-gp）的表达,Realtime-PCR检测各组细胞MDR1 mRNA表达的变化,Western blot检测各组细胞P-gp表达的变化。结果：与对照组质粒组和未转染组相比,转染含shRNA干扰质粒细胞的实验组IC50明显降低,为（2.304±0.232）μmol/L,且差异有统计学意义（P〈0.05）,敏感性的相对逆转率为73.8%;凋亡率明显升高为（5.767±0.694）%（P〈0.05）;MDR1 mRNA表达明显下调（P〈0.05）;P-gp的表达水平降低（P〈0.05）。结论：靶向MDR1的shRNA干扰质粒有效抑制了MDR1的表达,使P-gp的表达降低,从而增强了LOVO/5-Fu细胞对5-Fu的敏感性,有可能为临床上克服大肠癌化疗过程中出现的耐药提供新的作用靶点和治疗途径。     

大肠癌多药耐药逆转的研究进展

大肠癌是消化道常见的恶性肿瘤,其多药耐药的发生是多因素、多阶段、多步骤共同作用的结果,针对其多药耐药逆转的研究对于提高患者的远期疗效极其重要.目前针对其多药耐药逆转机制的研究主要有针对P-糖蛋白的逆转、基因治疗、中医中药治疗等.在上述领域的研究已经取得了一定的进展,如何进一步深入研究大肠癌多药耐药的发生、发展机制,并实现多药耐药的逆转,将有助于预测和改善化疗疗效、提高消化道恶性肿瘤的综合疗效,并最终克服多药耐药这一难题.     

短发夹RNA干扰质粒与粉防己碱对结肠癌耐药细胞多药耐药性的逆转作用

目的 比较短发夹RNA干扰质粒与粉防已碱对结肠癌LoVo/5-氟尿嘧啶(5-FU)耐药细胞多药耐药性(MDR)的逆转作用.方法 用粉防己碱和靶向MDR1的短发夹RNA干扰质粒分别对结肠癌LoVo/5-FU耐药细胞进行处理,实验分为对照组(空白对照)、粉防己碱组和转染组(短发夹RNA干扰质粒).应用MTT法检测细胞对5-FU的敏感性;流式细胞仪检测细胞周期变化、凋亡情况及P-糖蛋白的阳性表达率;RT-PCR法检测MDR1 mRNA的表达情况;Western blot检测P-糖蛋白的表达情况.多组间的比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK-q检验.结果 (1)细胞对5-FU的敏感性:对照组、粉防己碱组、转染组的药物半数抑制浓度( IC50)分别为(7.3±0.3)、(4.4±0.7)、(2.4±0.4) mmol/L,3组比较,差异有统计学意义(F =65.27,P＜0.05);粉防己碱组与转染组比较,差异有统计学意义(q=6.67,P＜0.05).(2)细胞周期的变化:对照组、粉防己碱组、转染组G1期和S期细胞所占比例分别为38.13％±3.75％、51.36％±2.76％、59.24％±4.31％和20.46％±2.23％、14.32％±1.91％、9.40％±1.65％,3组比较,差异有统计学意义(F =25.23,24.37,P＜0.05);粉防己碱组与转染组比较,差异有统计学意义(q=3.67,4.35,P＜0.05).(3)细胞凋亡情况:对照组、粉防己碱组、转染组细胞凋亡率分别为1.32％±0.47％、3.24％±0.26％、5.88％±0.44％,3组比较,差异有统计学意义(F=99.26,P＜0.05);粉防己碱组与转染组比较,差异有统计学意义(q=11.48,P＜O.05).(4)P-糖蛋白的表达:对照组、粉防己碱组、转染组细胞P-糖蛋白的阳性表达率分别为96.9％±2.3％、61.6％±4.9％、76.6％±3.6％,3组比较,差异有统计学意义(F =67.83,P＜0.05);粉防己碱组与转染组比较,差异有统计学意义(q=6.97,P＜0.05).(5)MDR1 mRNA表达情况:对照组、粉防己碱组、转染组细胞MDR1 mRNA的相对表达量分别为1462±161、570±85、233±81,3组比较,差异有统计学意义(F=90.59,P＜0.05);粉防己碱组与转染组比较,差异有统计学意义(q=5.12,P＜0.05).结论 粉防己碱和靶向MDR1的短发夹RNA干扰质粒均能逆转LoVo/5-FU耐药细胞的MDR,且后者逆转作用更强,逆转机制与抑制P-糖蛋白表达及下调MDR1 mRNA表达有关.     

甲基莲心碱逆转人结肠癌细胞奥沙利铂耐药的体外研究

目的:探讨甲基莲心碱(Nef)对人结肠癌细胞奥沙利铂(OXA)耐药的逆转作用及机制。方法:采用OXA浓度逐步递增法(2、4、8、12、24、48μmol/L)孵育人结肠癌HCT116细胞诱导构建OXA耐药株HCT116/OXA;检测Nef对HCT116/OXA细胞的细胞毒性,确定Nef的最适作用浓度和时间;分析并比较OXA(IC_(50)浓度)单独处理、Nef(最适作用浓度)单独处理、OXA(IC_(50)浓度)联合Nef(最适作用浓度)处理后,HCT116/OXA细胞的增殖,凋亡情况及凋亡相关蛋白(Bcl-2,Bax,PARP,p-PARP)的表达情况。结果:与亲本HCT116细胞比较,HCT116/OXA细胞较对OXA的耐药性明显增高(IC_(50):21.00μmol/Lvs.112.00μmol/L,P0.05),耐药指数为5.33。Nef能明显抑制HCT116/OXA的增殖有作用(P0.05),并呈浓度依赖性,其最适作用浓度、时间分别为5μmol/L、24h(细胞存活率为90%)。与OXA单独处理比较,HCT116/OXA细胞对OXA联合Nef处理的耐受性明显降低(IC_(50):112.00μmol/Lvs.45.47μmol/L,P0.05),逆转倍数为2.46;Nef单独作用对HCT116/OXA细胞的凋亡影响不明显(P0.05),但其与OXA联合作用对HCT116/OXA细胞凋亡诱导作用明显强于OXA单独作用(P0.05);与OXA或Nef单独作用比较,OXA联合Nef作用后,HCT116/OXA细胞抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显下降,Bax、p-PARP等凋亡蛋白表达明显上升(均P0.05)。结论:Nef可逆转HCT116/OXA对OXA的耐药,机制可能与其调节Bcl-2/Bax表达水平,从而与OXA产生协同作用有关。     

葡萄籽多酚体外逆转胆囊癌细胞株GBC-SD多药耐药作用的研究

目的:研究葡萄籽多酚(GSP)逆转胆囊癌先天性耐药细胞株GBC-SD耐药的作用,寻找高效低毒的耐药逆转剂。方法:选择GBC-SD为研究对象,MTT比色法测定各化疗药物的半数抑制浓度(IC50),RT-PCR测定MDR1mRNA的变化,流式细胞仪检测P-gp蛋白和细胞内阿霉素浓度的变化。结果:①无毒(3μg/ml)和低毒(6μg/ml)剂量浓度的GSP处理后各化疗药物的IC50值均明显降低(P〈0.05),能明显逆转GBC-SD的多药耐药性;②无毒(3μg/ml)和低毒(6μg/ml)剂量浓度的GSP能下调GBC-SD细胞MDR1mRNA表达(P〈0.05);③无毒(3μg/ml)和低毒(6μg/ml)剂量浓度的GSP能下调GBC-SD细胞P-gp蛋白表达(P〈0.05);④GSP增加GBC-SD细胞内ADM药物浓度(P〈0.05)。结论:GSP能部分逆转先天性耐药细胞株GBC-SD多药耐药性,作用机制为下调GBC-SD细胞MDR1mRNA及P-gp蛋白表达。     

低浓度活性氧逆转肾癌先天性多药耐药的实验研究

目的探讨低浓度活性氧对肾癌786-O细胞先天性多药耐药的逆转作用及相关机制。方法采用WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒确定活性氧H2O2的非细胞毒性剂量,以及对786-O细胞药物敏感性的影响。罗丹明123实验检测细胞P糖蛋白(P-gp)功能,Western blot方法检测经典多药耐药基因(mdr1)产物P-gp的表达。结果在0.00001～0.1mmol/L浓度范围内,H2O2具有明显的促细胞生长作用,且显著增加了阿霉素及长春新碱的细胞毒性,0.02mmol/LH2O2孵育786-O细胞72h后其对阿霉素及长春新碱的药物敏感性分别增加至对照组的5.43及4.47倍,荧光染料罗丹明123的蓄积量显著增加,Western blot检测结果显示0.02mmol/LH2O2可抑制肾癌786-O细胞P-gp的表达。结论低浓度活性氧H2O2可部分逆转人肾癌786-O细胞先天性多药耐药对阿霉素的耐药性,其逆转机制与增加细胞内化疗药物浓度、抑制P-gp的表达有关。     

多药耐药膀胱癌细胞株构建的研究现状及展望

多药耐药(multidrug resiatance,MDR)是最重要、最常见的肿瘤耐药现象,是近年来肿瘤临床和基础研究中的热点,多药耐药细胞株是研究MDR现象的主要工具之一,但建立合适的耐药细胞模型却很困难.目前主要采用两类方法来构建多药耐药细胞株:即药物诱导法及转基因法.本文就目前多药耐药膀胱癌细胞株如何构建的研究现状作一综述,并讨论目前多药耐药膀胱癌细胞株构建的利弊、展望未来将如何以更优越的方法构建一高效、稳定的膀胱癌多药耐药模型.     

粉防己碱对膀胱癌BIU-87/ADM细胞株的耐药逆转作用及其机制

目的 探讨粉防己碱(TET)对膀胱癌耐药株BIU-87/ADM多药耐药性(MDR)的逆转作用及其机制。方法 应用CCK法观察不同浓度TET( 1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L)对BIU-87和BIU-87/ADM细胞生长的抑制作用,并测定1 mg/L TET逆转多药耐药的活性;Annexin-V与PI双染法流式细胞术分析1 mg/L TET对细胞凋亡的影响;免疫荧光法和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测1 mg/L TET对P-gp蛋白和MDR1表达水平的影响;细胞免疫化学法和RT-PCR法检测1 mg/L TET对BIU-87/ADM细胞Caspase-3和Survivin表达水平的影响。结果 1.0 mg/L无毒剂量下的TET显著增加阿霉素(ADM)对耐药株BIU-87/ADM的细胞毒性作用(P＜0.01),逆转指数(RF)为5.33,而对敏感株BIU-87无明显作用(P＞0.05),RF为1.33;1.0 mg/L TET和1.5 mg/LADM共同作用48 h,能使BIU-87/ADM细胞凋亡率增加至(40.86±4.35)％,与单独应用ADM的(12.42 ±3.24)％比较差异有统计学意义(P＜0.01)。而BIU-87细胞凋亡率为(61.23 ±5.46)％,与单独应用ADM的(57.79±4.73)％比较差异无统计学意义(P＞0.05)。TET能明显抑制mdr1mRNA和P-gp蛋白在BIU-87/ADM的表达;与单用ADM比较,TET和ADM联用能使BIU-87/ADM细胞株中Caspase-3的表达水平明显升高(P＜0.01),Survivin的表达水平显著降低(P＜0.01)。结论 粉防己碱能逆转BIU-87/ADM细胞的多药耐药性,这一作用可能与粉防己碱抑制P-gp的表达和增强化疗药诱导细胞凋亡有关。     

沙利霉素逆转P-gp介导的肾癌ACHN细胞多药耐药的实验研究

目的 探讨沙利霉素对肾癌ACHN细胞多药耐药的逆转及其机制.方法 实验分为对照组、阿霉素组、沙利霉素组及阿霉素和沙利霉素联合用药组,药物作用24 h后,CCK-8方法 检测肾癌细胞的生长活性,免疫细胞化学法检测肾癌细胞P-糖蛋白(P-gp)的表达情况.结果 10 μg/ml 阿霉素对肾癌ACHN细胞的生长抑制率仅为4.758%.沙利霉素组对肾癌ACHN细胞生长抑制率呈剂量依赖性,并高于阿霉素组(P<0.05),其中以10 μmol/L组抑制率最高(达17.555%).联合用药组的生长抑制率高于沙利霉素组及阿霉素组(P<0.05),以10 μmol/L 沙利霉素 +10 μg/ml 阿霉素组的抑制率最高(达45.447%).与阿霉素组比较,经沙利霉素处理过的肾癌ACHN细胞中的P-gp蛋白表达下降(P<0.05).结论 沙利霉素增强了肾癌ACHN细胞对阿霉素的敏感性,耐药性逆转的机制之一可能与沙利霉素下调癌细胞中P-gp的表达有关.     

凋亡抑制蛋白XIAP与肿瘤多药耐药

XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis protein)是凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis protein,IAP)家族中最有效的内源性凋亡抑制因子,可以通过直接抑制caspases或者参与信号转导途径抑制细胞凋亡。研究发现,XIAP与肿瘤多药耐药有密切关系,并且有可能成为逆转肿瘤多药耐药提高化疗效果的治疗新靶点。     

RNA干扰逆转人胃癌细胞多药耐药的研究

目的：研究RNA干扰沉默多药耐药（multidrug resistance,MDR）基因对胃癌多药耐药细胞株BGC-823/5-Fu生长的影响。方法：构建靶向MDR1的shRNA干扰质粒转染人胃癌多药耐药细胞株BGC-823/5-FU,噻唑蓝（MTT）法检测耐药细胞对5-Fu的敏感性,实时荧光定量PCR（Real-time-PCR）检测MDR1 mRNA表达的变化,Western blot检测各组细胞P-gp表达的变化,流式细胞术检测细胞周期变化、凋亡情况。结果：与RNAi-control组和normal组相比,RNAi-MDR1组细胞干扰质粒细胞的IC50明显降低,为2.104±0.242（P〈0.05）,敏感性的相对逆转率为76.8%;MDR1 mRNA表达明显下调（P〈0.05）;P-gp的表达水平降低（P〈0.05）;凋亡率明显升高至（5.757±0.684）%。结论：应用RNA干扰有效抑制了MDR1的表达,使P-gp的表达降低,增强了BGC-823/5-Fu细胞对5-Fu的敏感性,为寻找逆转胃癌细胞多药耐药有效方法奠定了基础。     

吴茱萸碱对人结肠癌细胞自吞噬的影响

目的 观察吴茱萸碱对结肠癌Lovo细胞自噬的影响,探讨吴茱萸碱对Lovo细胞的生长抑制作用及其机制.方法 联合应用MTT法和形态学变化观察吴茱萸碱对Lovo细胞的生长抑制作用,借助激光共聚焦显微镜观察自噬现象,并用丹(磺)酰戊二胺染色测定对自噬进行定量分析,Western blot方法检测微管相关蛋白轻链3的表达,确认自噬的发生.同时检测吴茱萸碱和3-甲基腺嘌呤对Lovo细胞活力及凋亡的影响.结果 吴茱萸碱呈浓度依赖性抑制结肠癌Lovo细胞的生长活力(P＜0.05),尤其在浓度为60 μmol/L时最为明显(60%),且在光镜下形态表现为细胞裂解和细胞间隙增宽.吴茱萸碱可诱导结肠癌Lovo细胞发生自噬(P＜0.05),阻断自噬后,吴茱萸碱抑制结肠癌Lovo细胞生长活力的能力进一步增强(P＜0.01).结论 吴茱萸碱可诱导结肠癌Lovo细胞发生自噬,但自噬却拮抗吴茱萸碱的抗肿瘤活性.联合应用吴茱萸碱和自噬凋节剂可增强其抗肿瘤作用,逆转其对化疗药物的耐药性.

Abstract：

Objective To investigate the effects of evodiamine on autophagy of human colon a cleno carcinoma lovo cells, and to explore the role and mechanism of autophagy which was induced by evodiamine (EVO). Methods MTT assay combined with the morphologic changes were used to observe the cell viability. Monodansylcadaverine was used to detect autophagy by fluorospectrophotometer and the confocal laser fluorescence microscopy respectively. Immunoblotting assay was used to observe the microtubule-associated protein 1 light chain 3. Finally, evodiamine combined with 3-methyladenine to detect the cell viability with MTT assay and the apoptosis with the flow cytometry, respectively.Results Evodiamine inhibited the viability of Lovo cells in dose-dependent manner ( P ＜ 0. 05 ), especially in 60 μmol/L that was obviously(60% ). Further more, the cell lysis and cell gap widened was observed by the light microscope. Evo triggered the autophagy, and after inhibition the autophagy by 3-MA, the killing capacities of the Evo was enhanced ( P ＜ 0. 01 ). However, autophagy prohibited the apoptosis pathways.Conclusions Evodiamine can trigger the autophagy, which might play a self-defense role in evodiamineinduced cell death. The cytototoxicity of evodiamine can be augmented by the autophagy inhibitors. The joint application of autophagy regulators with the chemotherapeutic agents might enhance the cell killing effects of chemotherapeutic drugs and show a potent role in cancer drug resistance.     

人膀胱癌多重抗药性逆转的实验研究

为探讨膀胱癌多重抗药性逆转机理，应用阿霉素（ＡＤＭ）大剂量短暂冲击结合低浓度持续递增法，获得了具有多重抗药性的ＢＩＵ８７Ｒ／ＡＤＭ细胞。通过测定细胞内ＡＤＭ聚积量和钙离子浓度，发现ＢＩＵ８７Ｒ／ＡＤＭ细胞内ＡＤＭ聚积量显著低于ＢＩＵ８７细胞（Ｐ＜００５）；维拉帕米（ＶＰＬ）、奎宁能使ＢＩＵ８７Ｒ／ＡＤＭ细胞内ＡＤＭ聚积量增加（Ｐ＜００５），两者协同应用基本上可逆转ＢＩＵ８７Ｒ／ＡＤＭ细胞的抗药性。结果表明：（１）细胞内ＡＤＭ聚积量减少是抗药细胞的重要变化，在细胞抗药性发生机理中可能起主导作用，（２）ＶＰＬ、奎宁能逆转ＢＩＵ８７Ｒ／ＡＤＭ细胞的抗药性，可能与增加细胞内ＡＤＭ聚积量有关，与钙通道无关。     

丁硫氨酸亚砜胺体外逆转人膀胱癌细胞多药耐药性的研究

目的：探讨丁硫氨酸亚砜胺(BSO)对体外培养的人膀胱癌细胞株多药耐药性的影响。方法：以20umol／L的BSO处理人膀胱癌细胞株BIU87及其多药耐药业株BIU87／A后约18h,分别应用定量逆转录多聚酶链式反应法(RT—PCR)、荧光分光光度法及MTT法．检测两株细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCSh)mRNA的表达和细胞内谷胱甘肽(GSH)水平,以及细胞对多种药物敏感性的变化。结果：BSO处理后,BIU87／A细胞γGCSh mRNA的表达水平为1．091,明显低于处理前的1．534(P＜0．01)。与之对应,细胞内GSH浓度也由处理前的177．3mmol／g蛋白质降至处理后的89．0mmol／g蛋白质(P＜0．05)。BSO处理使BIU87/A细胞对大部分化疗药物的敏感性增高。结论：BSO可通过抑制细胞的GSH的合成．使膀胱癌耐药细胞的化疗耐药性得到逆转。     

葡萄籽多酚对人乳腺癌细胞MCF-7/ADR在裸鼠体内的多药耐药逆转作用

目的　研究葡萄籽多酚 (GSP)对人乳腺癌耐阿霉素细胞MCF 7/ADR的体内多药耐药逆转作用。方法　采用人乳腺癌裸鼠移植瘤模型研究GSP对肿瘤多药耐药的体内逆转作用 ;采用流式细胞术测定不同用药P 糖蛋白 (Pgp)表达变化及肿瘤细胞凋亡率变化。 结果　体内裸鼠抑瘤实验显示GSP有一定抑瘤作用 ,抑制率为 18 35 % ,联合应用阿霉素 (ADR)可显著抑制肿瘤生长 ,2 0mg/kgGSP可有效逆转MCF 7/ADR细胞的耐药性 ,抑瘤率为 5 4 6 4 %。流式细胞术结果显示应用GSP后肿瘤细胞Pgp表达显著降低 ( 32 0 3± 2 0 9) ,与对照组 ( 5 5 13± 2 12 )相比差异有显著意义 (P <0 0 5 )。平均凋亡率为 15 12 %± 1 0 4 % ,显著高于对照组 9 0 7%± 0 4 3% (P <0 0 5 )。结论　GSP能在体内逆转MCF 7/ADR细胞的耐药性 ,其机制可能是通过抑制Pgp表达 ,并可能通过诱导肿瘤细胞凋亡来起作用     

环孢素A对肾癌细胞多重耐药性的逆转作用

通过肾癌细胞的体外实验发现ＲＣＣ－９２５肾癌细胞系对长春新碱高度耐药，对阿霉素低度耐药，半数致死浓度分别为１４７２６．４ｍｇ／Ｌ和１．５５９ｍｇ／Ｌ。提示ＲＣＣ－９２５细胞具有天然多重耐药性。而环孢素Ａ可显著提高长春新碱和阿霉素的细胞毒性，增效幅度随环孢素Ａ浓度的升高而增强，增效倍数对长春新碱为３．０～３５５．７倍，对阿霉素为５．４～４７．７倍。结果提示环孢素Ａ对ＲＣＣ－９２５肾癌细胞的多重耐药性具有显著的逆转作用。