AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达

利用杆状病毒表达系统对AsiaⅠ型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)VP1基因在Sf9昆虫细胞中进行表达,为研究AsiaⅠ型FMDV VP1蛋白功能及建立AsiaⅠ型FMDV血清学诊断方法奠定基础。采用PCR方法从pGEM-T-Easy-AsiaⅠ型VP1质粒中扩增VP1基因,将其插入杆状病毒转座载体pFastBacHTA,构建的重组质粒pFastBacHTA-VP1再转入DH10Bac感受态细胞,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-VP 1,然后转染Sf9昆虫细胞。PCR鉴定证实VP1基因正确地插入到Bacmid中,成功构建了杆状病毒重组质粒Bacmid-VP1,SDS-PAGE和Western-blotting检测结果表明,VP1基因在Sf9昆虫细胞中表达出约26.5 ku的VP1蛋白。将可溶性表达的融合蛋白用Ni-NTA亲和层析方法进行纯化,通过ELISA分析,能特异性地检测出AsiaⅠ型口蹄疫病毒阳性血清。AsiaⅠ型FMDV VP1基因在杆状病毒表达系统中的成功表达为AsiaⅠ型FMDV VP1蛋白的抗原性及血清学抗体水平检测研究奠定了基础。     

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因的克隆及表达

从亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒中提取总RNA，采用反转录聚合酶链反应获得了长度约为700bp的核苷酸片段，大小与预期长度相符。扩增产物经克隆测序，证明其为VP1基因。将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-1，成功构建了重组表达质粒pGEX-VP1；利用1PTG诱导，表达出了53ku的目的蛋白条带。Western-blotting分析表明，表达产物能与亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒抗血清特异性结合。亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒结构蛋白VP1在大肠埃希氏菌中表达成功。     

O型口蹄疫病毒VP1基因的克隆及其在重组杆状病毒中的表达

利用杆状病毒表达系统进行了口蹄疫病毒VP1基因在Sf9细胞中的表达研究。首先克隆了VP1基因片段．将pMD18-VP1质粒及杆状病毒转座载体质粒pFastBacⅠ分别用BamHⅠ及Hind Ⅲ酶切后，用T4 DNA连接酶连接。构建了重组质粒pFastBac-VP1；再将该重组质粒转化DH10Bac感受态细菌。在菌体内进行重组，并经三重抗性与蓝白斑筛选。得到杆状病毒重组质粒Bacmid-VP1；将Bacmid-VP1转染Sf9细胞．获得重组杆状病毒．并进行表达水平的检测。经SDS-PAGE和Western-blotting检测。结果表明，VP1蛋白在重组杆状病毒中获得表达。     

IPTG诱导浓度、时间对AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1蛋白表达的影响

将口蹄疫病毒VP1基因插入原核表达载体pET-28a中,转化至大肠杆菌BL21.用不同的IPTG浓度与不同诱导时间诱导菌株表达VP1蛋向,分析不同IPTG浓度及不同诱导时间对蛋白表达量的影响,以确定最佳表达条件.结果表明,在一定范围内,随IPTG浓度的增高,表达量并不会随之增大;而在菌体对数生长期内,随诱导时间的延长,表达量会随之增大.最后确定当IPTG浓度为3 mmol/L,诱导表达到最长时间9 h时,VP1蛋白表达量最大.     

AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1基因结构预测及亚细胞定位

利用PCR方法扩增到VP1基因,序列测定后利用Mega4．0、swiss—model、GOR4和RasMol软件预测了VP1基因的二、三级结构。将VP1基因融合EGFP基因后定向克隆入PcDNA3．1（＋）真核表达载体,构建正确的重组质粒命名为PVP1E,在脂质体介导下将PVP1E质粒转染BHK-21细胞,WesternBlotting试验证实VP1基因成功表达,经DAPI细胞核染色后在共聚焦显微镜下观察VP1亚细胞定位。结果表明本研究预测了VP1基因的二、三级结构,其在BHK-21细胞中呈现以细胞核为主的弥散性分布,VP1基因亚细胞定位及结构预测为进一步深入探究AsiaI型FMDVVP1结构和功能提供丰富的资料。     

O型口蹄疫病毒VP1嵌合基因的构建及原核表达

首先合成我国O型口蹄疫病毒2个疫苗毒株VP1基因的3个抗原袁位，与另外扩增的流行毒株VP1基因末端273bp片段相连,构建出O型VP1嵌合基因片段（VP1O）。然后，将VPIO基因连接到原核表达载体pET28a上，构建了重组表达质粒pET28a-VP1O，转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达。SDS-PAGE电泳表明。VP1O基因在大肠杆菌中获得表达。Western blotting检测证实表达的VP1O蛋白具有良好的生物学活性。对表达蛋白通过包涵体洗涤的方法进行初步纯化，获得了较高纯度的VP1O蛋白。     

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒双拷贝VP1基因的串联表达及其免疫原性

口蹄疫病毒（FMDV）VP1基因含有T细胞和B细胞表位,是口蹄疫病毒的主要免疫原性基因。作者将亚洲Ⅰ型FMDV VP1基因首尾串联构建双拷贝的VP1基因（2VP1）,实现双拷贝VP1基因的原核表达,表达的重组蛋白（GST2VP1）经Sephadex-G200分子筛层析纯化后,Western blot证实其有反应原性,动物试验表明重组蛋白在加强免疫后能够产生和灭活疫苗相当的ELISA抗体和中和抗体;本试验结果为亚洲Ⅰ型FMDV免疫原性研究及GST2VP1蛋白的进一步应用奠定了基础。     

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因重组犬2型腺病毒的构建

应用PCR方法扩增出亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒的VP1基因，继而构建出真核表达载体pVAX—VP1。再将含有巨细胞启动子CMV的目的基因表达盒连接到穿梭载体pVAX△E3上，筛选出VPl表达盒方向与E3区转录方向一致的重组子，获得转移载体。再经酶切，连接等方法获得重组腺病毒质粒。利用脂质体介导将重组质粒转染DK细胞，转染3次后，细胞出现明显的腺病毒病变。经PCR扩增、测序检测及基因组酶切鉴定，证明该病毒即为重组犬2型腺病毒。命名为CAV2／FMDV。经验证，该重组毒可稳定遗传，其毒价为10^3.5TCID50／mL。     

口蹄疫病毒VP1基因的原核表达及免疫原性检测

将口蹄疫病毒VP1基因克隆至原核表达载体pBAD／TOPO中，经鉴定后得到了重组质粒pBAD-VP1。将此重组质粒转化到受体茵TOP10中，分别以不同浓度的诱导剂L-阿拉伯醛糖进行诱导，并在不同诱导时间进行采样，经处理后做SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。结果，以终浓度为0．02g／L的L-阿拉伯醛糖进行诱导，4h后表达可达到高峰，表达产物大小约为40ku。软件扫描结果显示，VP1融合蛋白的表达量占细菌总蛋白的26．3％，能与抗FMDV抗体发生特异性反应，融合蛋白以包涵体和可溶形式存在。抽提融合蛋白的包涵体，经过洗涤后制成油乳荆疫苗，经皮下注射免疫豚鼠，用乳鼠中和试验测定豚鼠血清中和指数，并用口蹄疫病毒对豚鼠进行攻毒。结果表明，用此融合蛋白的包涵体免疫豚鼠能诱导产生中和抗体，并对病毒的攻击提供免疫保护。     

口蹄疫病毒OH株结构蛋白基因VP1的克隆与表达

采用RT—PCR方法扩增获得了O型口蹄疫病毒的主要免疫原VP1基因，将其插入pMDl8-T载体进行序列分析，结果表明，所获得的基因片段含有完整的FMDV结构蛋白VP1编码区。根据表达载体pQE-Trisystem的克隆位点序列和该VPl基因片段的末端序列设计了1对表达引物，以重组pMD-T—VP1阳性质粒为模板，扩增获得了VP1基因，通过酶切将其克隆至表达载体pQE—Trisystem上。经测序证实，重组表达质粒所含的外源基因VP1编码框正确无误。将重组表达质粒pQE—VP1转化至大肠埃希氏菌M15，通过IPTG诱导促使VP1基因高效表达，SDS—PAGE和Western—blot分析表明，表达产物大小与预期的结果（26ku）一致，且具有良好的反应原性。以2mmol／LIPTG诱导表达5h时表达量最高，其中70％～80％的目的蛋白存在于菌体裂解后的上清中，表明外源基因VP1主要以可溶性方式表达。     

AsiaⅠ型口蹄疫双效表达载体在BHK-21细胞中的表达

将构建好的双向反义表达载体PQC-AS-P12A3C经脂质体2000转染Ampho-pack293细胞,收获假病毒,在聚凝胺的介导下将其转染到BHK-21细胞,一定时间后进行检测。通过荧光抗体染色、目的基因的整合鉴定和RT-PCR检测等表明,目的基因P12A在细胞中成功表达,且已经整合到细胞染色体基因组中,病毒抑制试验则表明重组反义质粒对FMDV的产生起到一定的抑制作用。     

口蹄疫病毒VP1基因的原核可溶性表达

针对重组原核表达载体表达目的蛋白以包涵体形式存在的问题,作者对影响外源蛋白表达的IPTG的浓度、温度、时间等因素均进行了探索.以观察VP1蛋白的可溶性情况.通过PCR技术将VP1基因克隆至pGEM-T载体中,然后将pET-28a(+)和pGEM-T载体分别进行双酶切.构建重组的pET-28a-VP1载体,将重组载体转化至BL21中,诱导后经SDS-PAGE检测可见约29 ku的目的蛋白条带.插入的外源目的蛋白主要以包涵体的形式存在,上清中的可溶性蛋白甚微.试验结果表明,这可能与蛋白本身的氨基酸组成有重要关联.     

Asia 1型口蹄疫病毒VP1基因的表达鉴定及其多抗制备

本研究旨在表达口蹄疫病毒(FMDV)的VP1全基因并制备特异性的多克隆抗体。利用PCR方法扩增Asia 1 IND 49197株VP1全基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,在大肠杆菌BL21中进行表达。SDS-PAGE结果显示表达产物分子量约为31.6ku,以包涵体的形式存在。通过Ni-NTA Purification System纯化后进行western blot和间接ELISA分析,结果显示重组蛋白能够被FMD阳性血清识别,具有良好的反应性。将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,ELISA测定抗体效价为1∶20480,病毒中和试验测定抗体效价为1∶64。本研究所表达的VP1蛋白可用于开发检测Asia1口蹄疫抗体的诊断试剂,所制备的多克隆抗体为进一步研究VP1的结构、功能以及抗原表位的鉴定提供了条件。     

鹅细小病毒VP3基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

为真核表达鹅细小病毒（GPV）融合蛋白VP3基因,本研究通过PCR扩增GPV FY89株VP3基因,并将其克隆至杆状病毒转移载体pFastBac/HBM-TOPO中,经双酶切、PCR及测序鉴定正确后,转化感受态细胞DH10Bac,提取重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-VP3,将经PCR鉴定正确的rBacmid-VP3转染Sf9昆虫细胞,连续传代后,细胞病变明显。SDS-PAGE分析结果表明成功表达了分子质量约为61 ku的VP3蛋白;Western blotting分析结果表明重组VP3蛋白具有良好的抗原性。     

口蹄疫病毒VP1基因密码子偏好性分析

VP1蛋白是口蹄疫病毒(FMDV)的主要结构蛋白,可诱导机体产生中和抗体以及激发保护性免疫应答。为探究VP1基因密码子偏好性,筛选出其最佳体外表达系统,使用Visual Gene Developer、CodonW、GraphPad Prism等软件,对VP1基因进行密码子偏好性分析,同时将VP1基因密码子使用频率与大肠杆菌、毕赤酵母、昆虫杆状病毒和哺乳动物细胞表达系统作了比较。结果显示,VP1基因的CAI为0.21,ENC为55.43,GC3S为65.26%,表明该基因密码子使用偏好较弱并且密码子偏好以G/C碱基结尾。结合VP1基因与各表达系统密码子使用频率比值,发现其与昆虫杆状病毒表达系统频率比值差异最小且CAI最大,因此推断昆虫杆状病毒表达系统是FMDV VP1基因最适体外表达系统。本研究为FMDV亚单位疫苗研制等提供了技术基础。     

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因真核表达载体的构建及其免疫活性的初步分析

提取亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒总RNA，用特异性引物通过RT—PCR反应获得了约750bp的核酸片段，将其与pGEM—T Easy载体连接，并转化大肠埃希氏菌JM109。重组质粒经PCR、酶切鉴定及测序，证明所克隆的片段含有完整的VP1基因；将重组质粒与表达载体pcDNA3．1( )分别用Barn HⅠ和Eco RⅠ双酶切后连接，构建成重组表达质粒，转化宿主菌DH5α，筛选阳性克隆。测序结果证明，目的基因正确插入到表达载体中，命名为pcDNAV；用同样方法将IL-18基因插入pcDNAV中，命名为pcDNAVI。用pcDNAVI免疫豚鼠，2周后加强免疫1次，每周用ELISA检测豚鼠血清中的抗体水平。结果表明，pcDNA VI可引发机体产生体液免疫。     

IPTG诱导浓度、时间对Asia I型口蹄疫病毒VP1蛋白表达的影响

将口蹄疫病毒VP1基因插入原核表达载体pET-28a中,转化至大肠杆菌BL21。用不同的IPTG浓度与不同诱导时间诱导菌株表达VP1蛋白,分析不同IPTG浓度及不同诱导时间对蛋白表达量的影响,以确定最佳表达条件。结果表明,在一定范围内,随IPTG浓度的增高,表达量并不会随之增大;而在菌体对数生长期内,随诱导时间的延长,表达量会随之增大。最后确定当IPTG浓度为3 mmol/L,诱导表达到最长时间9 h时,VP1蛋白表达量最大。     

口蹄疫病毒VP1基因研究进展

口蹄疫病毒VP1基因是参与构成病毒粒子的主要中和抗原基因,其表达蛋白可以诱导动物机体产生中和抗体。对VP1基因进行分析,不仅对口蹄疫病毒遗传变异的研究具有指导作用,而且对口蹄疫的流行病学调查、疫源追踪、毒株型和亚型的分析,甚至对新型疫苗的研制也具有重要意义。因此,VP1基因一直是口蹄疫病毒分子生物学研究领域中的热点。文章就口蹄疫病毒VP1基因的特性及其在基因分型、诊断和疫苗研究中的应用进行了综述。     

口蹄疫病毒VP1基因和免疫串联片段F的克隆及其在Vero细胞中的表达

用RT PCR 方法扩增口蹄疫病毒VP1基因,并克隆到pgem t easy 载体中,通过酶切、PCR和测序验证克隆正确,再亚克隆到真核表达载体pcDNA 3.1( )上,得到重组质粒pcDNA VP1。根据获得的口蹄疫病毒VP1基因的序列,结合相关的文献资料,设计合成免疫串联片段F,F含有VP1 基因的主要抗原位点141 位~160 位及200 位~213位的氨基酸序列,将F 片段克隆到真核表达载体pcDNA 3.1( )中,得到重组质粒pcDNA F。在脂质体介导下,重组质粒pcD NA VP1和pcDNA F转染Vero细胞。间接免疫荧光分析表明VP1 基因和F 基因均在Vero细胞中成功进行了瞬时表达,为进一步研制FMD基因疫苗奠定了基础。     

口蹄疫病毒VP1基因的克隆及结构蛋白VP1的原核表达

根据Genbank中的O型口蹄疫病毒全基因序列设计了一对扩增口蹄疫病毒VP1基因的引物，用该特异性表达引物从口蹄疫阳性质粒pMD—P1中扩增得到目的基因VP1（639bp）。用相同的限制性内切酶酶切目的基因和表达载体PET32a后构建重组表达载体．转化宿主菌BL21（DE3），经酶切及PCR鉴定筛选出阳性克隆．测序证明目的基因正确插入了表达载体，用不同浓度的IPTG诱导VP1基因的表达，收集菌液进行SDS—PAGE电泳，Westerll—blotting分析蛋白免疫原性。结果表明，VP1结构蛋白在大肠杆菌中表达量较高，表达产物的分子量约为41Ku，并能被口蹄疫阳性血清所识别，经分析表达蛋白约占菌体蛋白的34％。口蹄疫病毒VP1蛋白在大肠杆菌中高效表达且表达产物具有免疫原性。