花生FAD2基因家族表达分析及其对低温胁迫的响应

为了探究FAD2在花生低温响应中的作用,本研究从普通油酸花生中花16 (ZH16)和高油酸花生中花413 (ZH413)中克隆得到花生AhFAD2家族的全部基因,共7个。通过分析这些基因的表达模式发现,在ZH16和ZH413中各FAD2基因表达模式相似, AhFAD2-1A/B主要在花和发育的种子中表达, AhFAD2-3A/B主要在营养组织中表达, AhFAD2-4A/B主要在根和花中表达,表明AhFAD2基因在花生不同发育阶段和不同组织中发挥各自的生物学功能。在15℃下发芽6 d发现,ZH413的发芽率未显著下降,而ZH16的发芽率显著下降。种子萌发过程中,AhFAD2-1A/B和AhFAD2-4A/B均受低温诱导表达。在ZH16中AhFAD2-1A/B在低温诱导第6天开始显著上调表达,而在ZH413中第1天显著上调表达;在ZH16中AhFAD2-4A/B在低温诱导第3天出现显著上调表达,之后表达量下降,但在ZH413中第1天就显著上调表达,且始终维持在高水平表达。基于以上研究结果推测,高油酸花生在受到低温胁迫时,AhFAD2-1A/B编码蛋白失活,但AhFAD2-4A/B的高量表达在一定程度上弥补了这部分功能。同时也说明AhFAD2-1A/B功能的缺失并不是决定花生耐寒性的主要因素。本研究的开展为培育抗寒的高油酸花生品种奠定了理论基础,为高油酸花生在高纬度、高海拔地区推广提供了理论支持。     

花生AhFAD2-1基因启动子及5'-UTR内含子功能验证及其低温胁迫应答

Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶基因(FAD2)催化油酸生成亚油酸,是决定油酸亚油酸比值的关键基因。高油酸花生对低温更加敏感,暗示FAD2在低温响应中发挥作用。为探索花生FAD2的低温胁迫应答,本研究分析了花生FAD2-1A/B的基因结构,从普通油酸花生品种豫花9326中克隆了FAD2-1A/B启动子和内含子,并通过转化拟南芥验证了功能及其对冷胁迫的应答。结果表明, Ah FAD2-1A/B包含2个外显子和1个位于5'-UTR的内含子; Ah FAD2-1A/B基因启动子功能较弱,仅Ah FAD2-1B启动子在子叶期幼苗的子叶叶尖中观察到蓝色; Ah FAD2-1假基因5'侧翼序列具有启动子活性,可调控基因在子叶、下胚轴、种子中表达。Ah FAD2-1内含子序列具有启动子的功能,驱动基因在幼苗下胚轴及子叶中表达,同时还有提高基因表达效率和扩大表达范围的功能,是Ah FAD2-1基因表达调控必需元件;包含5'-UTR内含子的Ah FAD2-1A/B启动子的调控序列功能受低温胁迫抑制。     

CRISPR/Cas9编辑花生FAD2基因研究

油酸脱氢酶((35)12FAD或FAD2)是催化油酸(OA)的C12位上脱氢生成双不饱和亚油酸(LA)的关键酶,它控制油酸、亚油酸的含量及其比值(O/L)。研究表明, AhFAD2是油酸生成亚油酸的关键基因,决定花生种子中油酸和亚油酸的相对含量。本研究根据AhFAD2基因序列,设计了相应sgRNA序列,并构建了旨在敲除FAD2A和FAD2B两个花生油酸脱氢酶的CRISPR/Cas9基因编辑载体。经花生基因转化后,通过对转基因花生突变位点基因组序列分析找出基因突变体。对靶基因分析发现,16株转基因花生含有29个FAD2A基因突变,其中16个突变引起蛋白质序列变化;11株转基因花生含有30个FAD2B基因突变,其中17个突变引起蛋白质序列变化。FAD2A和FAD2B蛋白质序列的变化可影响花生油酸脱氢酶的活性,改变油酸催化脱氢,使亚油酸合成受阻,油酸含量增加。本研究为研究花生脂肪酸合成及高油酸花生育种提供了宝贵的基因突变体材料。     

花生AhFAD2基因的多态性及其与籽粒油酸/亚油酸比值间的相关性

高油酸低亚油酸的花生油稳定性好、营养价值高,培育高油酸/亚油酸比值(O/L)的花生品种一直是花生育种的重要目标。为深入了解控制花生O/L比值的遗传基础,提高花生品质育种效率,对鲁花14等13个花生品种Δ¹²脂肪酸脱氢酶AhFAD2基因的编码区进行了序列分析。结果表明,该基因在13个花生品种中皆存在3类转录本,即AhFAD2A、AhFAD2B和假基因。台山珍珠、台山三粒肉、江田种、Chico、05-21063、白沙1016的基因型是OL1OL1OL2OL2;临桂麻壳、飞龙乡、勾了种、鲁花14、花育19、花育23的基因型是ol1ol1OL2OL2;鲁花11的基因型可能存在OL1ol1杂合等位位点。在个别品种中AhFAD2A基因的若干位置存在多态性;AhFAD2B基因相对保守,所测13个花生品种的核苷酸序列基本相同。结合13个花生栽培品种籽粒中O/L比值测定的结果,初步探讨了基因多态性与O/L比值之间的关系,同时对假基因可能存在的功能进行了讨论。     

不同花生品种芽期耐寒性鉴定及评价指标筛选

低温寒害是限制花生产业发展的重要非生物胁迫因子之一。花生品种芽期耐寒能力的强弱是决定花生出苗整齐度和高产高质的重要保障。本研究利用品种综合指标值、权重、隶属函数值、D值对62个花生品种芽期耐寒性进行综合评价。结果表明,D值越大,其耐寒性越强,反之耐寒性越弱。系统聚类分析可将62个品种分为5类,第I类为高耐寒型;第II类为耐寒型;第III类为中间型;第IV类为敏感型,第V类为高感型。相关性分析表明,油酸含量与D值及其他4个耐寒性指标值的相关性未达到显著水平,说明花生油酸含量和花生芽期耐寒性强弱无关;各相对指标值与D值及各相对指标值间均呈极显著正相关,说明花生芽期耐寒性相对指标值之间具有一致性。通过对相对指标特征值、贡献值及权重分析表明,相对发芽率可作为花生芽期耐寒性鉴定的正向指标,相对发芽率越大,其芽期耐寒性能力越强,反之耐寒性能力越弱。本研究筛选出5个高耐寒性品种,建立了以相对发芽率作为花生芽期耐寒性的评价指标,对花生芽期耐寒性的高效鉴定和耐寒性新品种培育及其相关理论研究提供基础材料和高效鉴定方法。     

高油酸花生品种(系)抗旱性综合评价

为鉴定高油酸花生(HOAP)品种(系)的抗旱指标,综合评价参试品种的抗旱性。在PEG处理和盆栽胁迫下对30份高油酸花生品种(系)进行抗旱性鉴定,采用隶属函数法对各项指标进行了抗性评价与鉴定。结果表明,花生抗旱性与花生萌发期相对芽长/种长(RRBS)、相对发芽势(RGE)、相对发芽指数(RGI)、相对发芽率(RGR)呈极显著正相关,与花生从苗期胁迫的全生育期相对主茎高(RLMS)、相对地上生物量鲜重(RSFW)、相对叶片鲜重(RLFW)及在土壤含水量为田间持水量的45%～50%(K2/K3)的相对侧枝长(RLB)呈显著正相关。通过隶属函数法,折算各项指标的相对隶属函数值,筛选出抗旱高油酸花生品系S51和抗旱敏感高油酸花生品系L42。本研究结果为高油酸花生抗旱新品种研究提供参考。     

野生花生脂肪酸组成的遗传变异及远缘杂交创造高油酸低棕榈酸花生新种质

以花生属19个近缘野生物种87份种质和113份栽野远缘杂交后代为材料, 系统分析野生花生脂肪酸组成的遗传变异及其在栽培种花生脂肪酸改良中的潜力。结果表明, 野生花生的棕榈酸含量与栽培种花生相似, 硬脂酸和油酸含量略低于栽培种花生, 亚油酸含量略高于栽培种。不同物种间以及同一物种内不同资源间的脂肪酸组成存在较大差异。A. rigonii棕榈酸含量较低, A. pusilla和A. duranensis油酸含量较高, A. batizocoi亚油酸含量较高, A. rigonii和A. duranensis油酸和亚油酸含量变幅较大。发掘出油酸含量达60%以上的野生资源2份(19-6, A. duranensis和23-1, A. sp.), 亚油酸含量达40%以上的资源7份, 其中A. rigonii(编号为11-4)亚油酸含量高达48%, 是目前所发现的花生资源中亚油酸含量最高的种质。远缘杂交后代脂肪酸的变异远远超过亲本间的差异, 而且不同组合间的棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸含量差异达显著或极显著水平。通过远缘杂交获得了6份油酸含量达64.0%以上且棕榈酸含量在8.5%以下的新种质, 其中yz8913-8油酸含量达67.85%, 比其栽培种亲本提高近30个百分点, 且棕榈酸含量仅7.60%。SRAP检测表明, 这6份远缘杂交后代除整合了亲本的DNA片段外, 还产生了新的DNA片段, 有的还丢掉了亲本的某些片段。农艺性状分析表明, 其中4份种质的综合农艺性状较好, 具有重要育种利用价值。     

高油酸花生组合F2代分离情况速测报告

目前我国生产上种植的花生品种油酸含量较低,一般占脂肪酸含量的40%～50%,油酸/亚油酸比值为1.2:1左右,耐贮性较差。提高油酸含量是我国花生育种的目标之一,油酸/亚油酸比值为1.6曾是我国高油酸品种攻关指标。国外对油酸高低的评价是以花生品种脂肪酸的实际油酸含量为标准,普通品种(低油酸品种)的油酸含量为36%～67%、亚油酸含量为15%～43%,高油酸品种的油酸含量为80%、亚油酸含量为2%～5%。本试验的目的是利用油酸快速测定仪器对高油酸组合F2分离情况进行测定,对高油酸的遗传规律进行验证,为花生高油酸育种提供理论依据,同时对快速测定仪…     

花生品种主要脂肪酸含量在不同生态区的稳定性

花生是主要的油料作物,脂肪酸组成受环境等的影响而不稳定。本研究选取60份黄淮及长江流域产区主推的花生品种,连续2年在湖北武汉、河北石家庄、河南濮阳和河南周口4个环境下种植,利用GB/T5510-2011法检测种子脂肪酸含量。结果表明,高油酸花生品种油酸含量比普通油酸品种稳定,普通油酸品种棕榈酸和亚油酸含量比高油酸品种稳定;武汉种植环境有利于花生油酸含量的提高,2年60份品种的平均油酸含量均最高,分别为52.93%和52.64%;高油酸花生品种除油酸含量显著提高外,花生烯酸含量也提高了54.1%;而棕榈酸和亚油酸含量分别降低了45.20%和90.44%。结合前期SSR研究结果,本研究涉及的6份高油酸品种属于不同的类群(G1、G2c和G2e),其遗传背景差异较大。本研究结果为花生品种的合理布局和进一步的遗传改良提供了理论依据。     

耐低温萌发棉花品种种子萌发期生理特性分析

为探讨低温胁迫下不同棉花品种萌发差异成因,以强耐低温萌发品种鲁棉研37号、鲁棉研36号和低温萌发敏感品种斯字棉2B、斯字棉5A为材料,研究了不同低温下不同萌发时期的生理指标与基因表达的差异。结果显示,12℃胁迫36 h,低温萌发敏感品种MDA含量急剧上升,至胁迫48 h,低温萌发敏感品种斯字棉2B、斯字棉5A比鲁棉研37号MDA含量分别提高了48. 17%,50. 65%,因此,12℃胁迫36 h MDA含量的变化可以作为耐低温萌发的选择指标; SOD、POD活性在各种处理水平下鲁棉研37号、鲁棉研36号均保持较高水平; CAT活性在低温的刺激下,强耐低温萌发品种逐渐超越低温萌发敏感品种;游离脯氨酸含量在12℃胁迫48 h时,鲁棉研37号与斯字棉2B、斯字棉5A相差幅度分别为33. 32%,23. 27%,这些生理指标差异较好地反映了不同品种耐低温萌发差异。4个CBF基因家族成员CBF1、CBF2、CBF4、CBF6在强耐性品种中表达上调更迅速,在胁迫12 h时达到表达峰,这可能是强耐低温萌发品种应答低温胁迫时,表现更灵敏与迅速的原因。     

外源脯氨酸诱导提高玉米对低温胁迫的生理响应

玉米生育早期实施抗寒的措施对保障玉米安全生产具有重要意义。本研究在萌发期和苗期分别以800和400μmol/L的外源脯氨酸(Pro)处理6份耐寒性不同的玉米自交系,分析外源Pro对10℃胁迫下种子萌发及幼苗生理特性的影响。结果表明,10℃胁迫能明显抑制玉米种子萌发,表现为发芽势、发芽率、胚芽长、胚根长、胚芽鲜重、胚根鲜重均显著降低;幼苗叶片的相对电导率、丙二醛含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、SOD活性、POD活性、CAT活性均显著升高。10℃处理下,萌发期和苗期分别施加800和400μmol/L的外源Pro后能明显促进玉米种子萌发,并减轻低温对幼苗生理伤害,除相对电导率和丙二醛含量分别降低42.36%和30.48%外,其余11个性状均分别升高12.57%～256.37%。进一步通过综合评价表明,10℃条件下,萌发期和苗期利用800和400μmol/L浓度的外源Pro对玉米的低温缓解效果分别为0.548和0.497。这些结果为外源Pro在玉米生育早期抵御低温胁迫的生产应用提供参考。     

低温胁迫和赤霉素对花生种子萌发和幼苗生理响应的影响

低温是影响我国广大花生产区春花生发芽的主要因素之一。本文以不同生态区的30个花生品种为实验材料,研究了倒春寒天气诱导的低温胁迫对花生出苗的影响,以出苗率为标准筛选出4个耐低温的花生品种(阜花17、阜花12、冀花16、冀花18)和4个不耐低温的品种(鲁花11、白沙1016、正农黑花生1号、白玉)于温室测定了4℃低温和赤霉素(GA_3)处理后种子发芽相关指标和幼苗生理指标。结果表明, 4℃对耐低温花生品种发芽率、发芽指数影响不显著,但种子活力指数和芽长呈现下降趋势;4℃处理后,不耐低温品种幼苗相对膜透性和MDA含量上升幅度更高,耐低温品种幼苗的可溶性糖和游离脯氨酸含量上升幅度更大。GA_3显著促进4℃低温处理后花生种子萌发和种子活力,抑制了花生幼苗在低温处理后相对膜透性和丙二醛的上升,提高了可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸含量。研究表明,赤霉素促进低温胁迫下种子萌发和幼苗生长的最佳浓度是300μmol L~(–1)。发芽率与相对膜透性和丙二醛含量显著负相关,与可溶性糖、脯氨酸含量显著正相关。温度影响发芽率的品种间差异较大,常温下赤霉素对不同耐低温品种的发芽率影响较小。本研究为耐低温花生种质资源创新和新品种培育提供了理论依据,为研究赤霉素对不同花生品种耐低温性影响的生理机制提供了基础。     

花生ahFAD2A等位基因表达变异与种子油酸积累关系

花生ahFAD2A是控制种子油酸、亚油酸含量和油亚比的关键基因。利用ahFAD2A基因特异引物检测远杂9102, 豫花9416等52个花生品种的ahFAD2A基因等位变异, 并比较其中13个品种的ahFAD2A基因序列。结果表明, 花生ahFAD2A基因存在G-A两种单核苷酸等位变异(野生型ahFAD2A-wt和突变体ahFAD2A-m), DNA序列比对结果证实, 豫花9416等10个品种(突变体)与远杂9102、延津花籽和开农白2号(野生型)相比, 在ahFAD2A基因的448 bp处存在核苷酸G-A突变。应用real-time PCR检测ahFAD2A等位基因在种子不同发育时期的表达动态显示突变体豫花9416等位基因(ahFAD2A-m)在种子发育中期表达量稍高, 种子发育后期表达量下降速度较野生型远杂9102(ahFAD2A-wt)更快。进一步测定豫花9416和远杂9102在种子不同发育时期的油酸、亚油酸积累和油亚比动态, 发现两品种间存在明显差异, 豫花9416在籽粒发育前期油酸相对含量已超过亚油酸, 油亚比大于１并逐渐增加, 而远杂9102到籽粒发育中后期油酸相对含量才高于亚油酸, 油亚比逐渐接近于１左右。     

金花10号花生栽培技术

<正>花生油酸含量的多少是影响花生制品理化稳定性和营养价值的重要品质指标之一。油酸含量越高,花生及其制品越不易酸败变质,储藏时间越长。油酸能降低人体血管中低密度脂蛋白胆固醇水平,保持高密度脂蛋白胆固醇水平,减少血管胆固醇的沉淀。然而,目前我国花生油酸含量多在34%~53%,平均油酸含量40%左右,油酸、亚油酸比值(O/L)1.15。鉴于高油酸花生的营养价值,培育高产高油酸花生已经成为我国花生育种     

含异位表达花生AhNCED1基因的拟南芥提高耐渗透胁迫能力

AhNCED1是干旱胁迫下调控花生ABA生物合成的关键基因。以pCAMBIA1301为基本双元表达载体,分别构建CaMV35S启动子和拟南芥AtNCED3基因启动子(AtNCED3p)驱动花生AhNCED1基因的2个植物双元表达载体p35S::ORF和pAtNCED3p::ORF,通过根癌农杆菌介导法将上述两个表达载体分别转化野生型和129B08/nced3突变体拟南芥,经潮霉素筛选和PCR鉴定分别获得35S::ORF-WT和A3p::ORF-B08转基因植株,RT-PCR证实花生AhNCED1基因已在转基因植株中稳定表达,并对野生型、129B08/nced3突变体和转基因拟南芥进行外源ABA敏感性和耐渗透胁迫能力分析。结果表明,129B08/nced3突变体对外源ABA的敏感性下降,而花生AhNCED1基因在拟南芥中的异位表达提高了对外源ABA的敏感性。在山梨醇胁迫下,129B08/nced3突变体种子的相对萌发率明显低于野生型的,而A3p::ORF-B08转基因拟南芥种子的相对萌发率与野生型的相当,显著高于129B08/nced3突变体的,且300mmolL–1山梨醇胁迫下,35S::ORF-WT转基因拟南芥种子的相对萌发率明显高于野生型的。在300mmolL–1山梨醇胁迫下,129B08/nced3突变体幼苗叶片高度黄化,根的形成和幼苗生长受到严重抑制,而A3p::ORF-B08转基因突变体与野生型相似,叶片仅轻度黄化,幼苗生长势良好;35S::ORF-WT转基因植株幼苗生长未受明显影响。这些结果说明,拟南芥129B08/nced3突变体对山梨醇诱导的非离子渗透胁迫有超敏性,异位表达花生AhNCED1基因能恢复该突变体对山梨醇的超敏性,提高拟南芥的耐渗透胁迫能力。     

反义RNA介导GmFAD2-1B基因沉默增强大豆种子中油酸的高效累积

油酸含量是评价大豆油食用品质和稳定性的重要指标。本研究采用农杆菌介导转化法,将反义GmFAD2-1B基因导入栽培大豆品种,获得油酸含量显著提高的转基因大豆新品系。Southern杂交检测表明,外源GmFAD2-1B基因片段已导入大豆基因组,其插入拷贝数为1~5个。q RT-PCR检测表明,外源GmFAD2-1B主要在大豆种子中表达,并导致种子中内源GmFAD2-1 m RNA表达水平显著降低,而根、茎、叶、花组织中内源GmFAD2-1 m RNA表达水平无显著变化。脂肪酸组分分析表明,12份转基因大豆种子油酸含量为27.38%~80.42%,其中,L40和L72油酸含量分别为68.91%~80.42%和65.98%~80.22%,较对照品种Williams 82(17.8%~22.0%)提高2.65倍以上,亚油酸降低至4.84%~14.55%,饱和脂肪酸降低至10.34%~11.16%,但总脂肪和总蛋白含量与对照品种相比没有显著变化。农艺性状分析表明,转基因大豆在熟期、株高、叶形、花色、结荚高度、百粒重等方面与对照品种也没有显著差异。     

单粒花生主要脂肪酸含量近红外预测模型的建立及其应用

脂肪酸组成是影响花生营养价值和货架寿命的主要因素,高油酸花生以其营养保健价值高、化学稳定性好、耐储藏等特点,深受广大消费者和花生加工企业的喜爱。因此,培育高油酸品种是花生育种的重要目标,建立快速、高效、准确检测花生中主要脂肪酸含量的无损方法是加快花生脂肪酸改良和高油酸品种选育进程的重要技术保障。本研究利用近红外光谱技术建立了可以非破坏性地快速检测单粒花生中油酸、亚油酸、棕榈酸含量的数学模型,其中油酸模型的决定系数(R2)为0.907,均方差为3.463;亚油酸模型的决定系数为0.918,均方差为2.824;棕榈酸模型的决定系数为0.824,均方差为0.782。使用100粒花生验证该模型的准确性,结果油酸、亚油酸和棕榈酸的近红外预测值与化学值的相关系数分别为0.88、0.90和0.71,表明此模型可以准确地预测单粒花生中这3种脂肪酸的含量。本研究借助该模型建立了一种不依赖分子标记的快速、高效选育高油酸花生的方法,并成功应用于高油酸花生育种,选育出高油酸花生品种中花215。     

NaCl对高羊茅萌发的胁迫效应研究

通过室内模拟盐胁迫对高羊茅不同品种萌发的胁迫效应研究,揭示单盐对牧草、草坪草种子萌发活力的影响和萌发盐分临界值,以期为盐碱地改良和优良牧草的引选提供依据;用不同浓度NaCl作为高羊茅萌发培养液,通过测定相对发芽率并对其进行回归分析;结果表明,NaCl盐胁迫对高羊茅种子的萌发有抑制作用,且在0～0.6%的低盐浓度范围内抑制作用不明显,NaCl盐浓度高于0.6%时抑制作用显著;0.4%、0.6%、1.2%的NaCl浓度是高羊茅相对发芽率变化的几个"拐点"(即敏感点);高羊茅相对发芽率与盐浓度呈极显著负相关,Y=101.75-47.371 x,r=-0.98;14个品种中萌发期较耐盐的品种有佛浪、爆发力和翠碧A,火凤凰、交战2和火凰RT耐盐性较差;高羊茅萌发阶段进行耐盐性评价时,相对发芽率和耐盐半致死浓度是很好的萌发能力的鉴定指标,可以作为种子耐盐能力评价指标,但耐盐致死浓度不宜作鉴定指标.     

锌指蛋白基因ZAT12提高转基因高油酸花生抗寒性

低温和冻害严重影响高油酸花生的产量和品质。为了提高高油酸花生的抗寒性,本研究利用农杆菌介导的转化方式将可以激活低温响应基因的锌指蛋白基因ZAT12导入高油酸花生。同时对影响高油酸花生转化的几种因素(植物生长素ZT和6-BA的使用浓度,侵染时间,烟草提取物添加量)进行改良优化。通过PCR和实时荧光定量PCR检测证明PnZAT12已经整合到高油酸花生基因组中。对转基因植株进行低温胁迫处理,分别测定其相对电导率(relative electrolytic leakage, REL)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量及超氧化物岐化酶(superoxide dismutase, SOD)活性。结果表明,转基因花生的MDA含量和REL显著低于非转基因花生,而SOD活性明显高于非转基因花生。在表型比对方面,转基因花生的叶片黄化程度和植株枯萎程度远低于非转基因花生。结果证实,转基因花生比非转基因花生有更高的抗寒性。研究结果对抗逆基因的改良研究及高油酸花生的分子育种工作都具有重要的参考价值。     

分子标记辅助选育高产高油酸花生新品种舜花 14 号

舜花 14 号是以普通油酸含量的花育 19 号作母本及轮回亲本,高油酸花生开农 176 作父本,经 TaqMan 探针及 KASP分子标记辅助选育而成的高产高油酸大花生品种。2019 年开始参加山东省高油酸花生联合体新品种多点比较试验,荚果平均产量 5601.90kg/hm2,较对照花育 25 号平均增产 8.33%。2022 年单粒精播高产攻关试验实打验收荚果产量 9728.40kg/hm2,首创高油酸花生实打验收山东省高产纪录。品种籽仁蛋白质含量 26.4%,含油量 50.67%,油酸含量 80.6%,亚油酸含量 2.99%,O/L 比值 26.96。2022 年 9 月通过国家非主要农作物品种登记,登记编号：GPD 花生（2022）370149。