家蚕Argonaute2的表达分析及其结合RNA的初步研究

从家蚕cDNA文库中扩增到家蚕BmAGO2基因完整的ORF序列,通过Lasergene软件分析获得BmAGO2的抗原表位区（命名为Kago2）,构建含Kago2的表达载体,转化大肠杆菌诱导表达,融合蛋白经镍柱亲和层析纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA和Western blotting检测抗血清的效价可达到1∶25 600以上,抗体特异性较好。表达谱分析结果显示,BmAGO2蛋白在家蚕卵期、蛹期、蛾期和五龄幼虫期均表达,但在蛹期表达量要偏低。而在五龄幼虫各组织中BmAGO2蛋白的表达差异较明显,BmAGO2蛋白在头部和表皮中大量表达,丝腺、马氏管和脂肪中也有少量表达,而在血淋巴、气管和中肠中未检测到该蛋白的表达。结合BmAGO2表达谱分析结果,进一步利用其抗体通过免疫共沉淀方法从BmAGO2蛋白表达量高的家蚕头部和表皮中分离出BmAGO2蛋白及结合的RNA,并逆转录成cDNA。以家蚕miRNA潜在的靶基因Bmem4,Bm（spl）-like,Bmemc,Bmmγ,Bmmβ2作为检测基因,荧光定量PCR分析获得的BmAGO2结合RNA,和对照组RNA相比,Bmem4,Bm（spl）-like,Bmemc,Bmmγ,Bmβ2基因在BmAGO2结合RNA中的含量分别富集了3.93、1.31、2.4、1.31、0.97倍。miRNA靶位点分析表明,Bmem4和Bmemc存在多个miRNA结合位点,极有可能是miRNA的靶基因。目前还没有有效的家蚕miRNA靶基因高通量鉴定方法,本实验为家蚕miRNA靶基因的高通量筛选提提供了可靠地实验途径。     

家蚕一个DDRGK超家族成员的克隆及分析

DDRGK类蛋白是在动物及植物中发现的约有300个氨基酸残基的蛋白家族,含有一个高度保守的DDRGK基序,但功能还未知。在对家蚕幼虫cDNA文库的测序中发现了含有该保守结构域的EST序列,经过电子克隆、RT-PCR,获得该基因完整的cDNA序列,将其命名BmDDRGK(GenBank登录号FJ645927)。然后构建了重组质粒转化到大肠杆菌BL21和Rosetta中诱导表达,但经SDS-PAGE检测未检测到重组蛋白的表达。利用Real-timePCR技术对BmDDRGK在家蚕五龄幼虫期和蛹期不同组织的mRNA表达水平进行了鉴定。绝对定量结果显示BmDDRGK在家蚕五龄幼虫期和蛹期的各个组织中均有较为明显的表达,在五龄幼虫期,以中肠、马氏管、睾丸表达量较高,在蛹期,以翅原基、睾丸的表达量较高。     

信号肽引导源基因在昆虫表达系统中的分泌表达

将杆状病来源的gp67信号肽引导的慈姑蛋白酶抑制剂(API)基因与植物来源的慈姑蛋白酶抑制剂信号肽引导的慈姑蛋白抑制剂(API)基因，分别克隆到昆虫杆状病毒转载体pBacPAK8中，通过共转染将它们分别整合到昆虫病毒表达载体Bm—BacPAK6中，将获得的重组病毒CrBK—API2和CrBK—bpAPI4分别接种家蚕(Bombyx mori)细胞、家蚕幼虫及蛹体中，慈姑蛋白酶抑制剂得到了高效表达。从家蚕细胞的表达来看，外源表达产物大多存在于细胞外的上清液中；从家蚕幼虫体内表达来看，信号肽能引导外源基因高效表达，且表达产物的90％以上能分泌到细胞外；蛹体中的表达情况与幼虫中的相似，但表达产物出了不均一的现象，从表达产物的分子量测定来看，这两种信号肽在表达过程中都没有被切除。     

莱茵衣藻硫胁迫相关microRNA检测及其靶基因分析

采用特异反转录引物,构建莱茵衣藻microRNA(miRNA)的cDNA文库.选用U4核仁小分子RNA(small nucleolar RNA,snoRNA)作为内参,用SYBR(R)green RT-PCR对3种与莱茵衣藻缺硫胁迫反应相关的miRNA进行检测,利用在线平台软件Web MicroRNAs Designer(WMD3)对miRNA靶基因进行预测.结果表明,在缺硫胁迫下,3种miRNA(miRNA1145.2、miRNA1146和miRNA1158)的表达水平均明显上调,与正常培养的莱茵衣藻表达miRNA的相对丰度比值分别为3.11、2.38和3.67.靶基因预测分析表明,miRNA1145.2能影响脂肪酸氧化反应,miRNA1146与辅酶Q代谢相关,miRNA1158可能参与磷酸戊糖途径调控.     

拟南芥ago1-27突变体的RNA-seq分析

miRNA在植物生长发育和环境适应等方面起着极为重要的作用.本研究对拟南芥ago1-27突变体进行了RNA-seq,鉴定到几千个差异表达基因,并且miRNA靶基因倾向于在ago1-27中表达上调.ago1-27 RNA-seq结合降解组分析鉴定到新的miRNA靶基因,如miR396靶向半胱氨酸蛋白酶基因和miR167靶向编码AT-hook DNA结合蛋白的基因等.     

基于RD-BmBacmid载体构建表达GFP蛋白的重组杆状病毒的方法

研究构建一种快速表达GFP蛋白的重组杆状病毒的方法。在复制缺陷型的家蚕杆状病毒(BmNPV)穿梭载体RD-BmBacmid基础上,利用PCR方法合成两端分别含有50bp左右同源臂的绿色荧光蛋白基因(AcGFP)片段和线性化的RD-BmBacmid共转染BmN细胞或家蚕幼虫,可以一步获得重组病毒,表达绿色荧光蛋白。实验结果表明,含有AcGFP基因的重组杆状病毒构建成功,在BmN细胞和家蚕幼虫中分别表达了绿色荧光蛋白。因而,本研究成功建立了一种快速构建重组杆状病毒并能够表达GFP蛋白的新方法。     

LC-1 ScFv偶联GFP基因的构建及表达

从具有高效蛋白表达及活力的抗肺癌杂交瘤单克隆细胞株（LC-1）抽提总RNA，反转录成cDNA。根据肿瘤单链抗体（ScFv）基因设计引物，用多聚酶链式反应（PCR）克隆出抗体的重链和轻链基因，并通过重叠延伸PCR法将重链基因与修饰后的轻链基因连接为单链抗体基因。改造后的ScFv与绿色荧光蛋白（GFP）基因连接，构建表达质粒ProGFP-ScFv，随后转化大肠杆菌JM109，用诱导剂IPTG进行诱导表达。表达产物采用Ni-NTA树脂进行纯化，进行SDS-PAGE电泳分析其纯度。酶联免疫检测（ELISA）表明该蛋白已具有抗体活性。395 nm激光激发显示绿色荧光，表明目的基因在原核生物中存在表达。     

拟南芥microRNA通路中新因子的筛选和突变体分析

小核糖核酸(micro ribonucleic acid,miRNA)是一类长度为20~24核苷酸(nucleotide,nt)的非编码的核糖核酸(ribonucleic acid,RNA),在植物生长发育过程中具有重要作用.为鉴定参与植物miRNA合成、降解和运输等通路的因子,利用拟南芥转基因株系SUC2:amiR-SUL进行正向遗传筛选体系,通过对该株系进行甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone,EMS)诱变筛选获得SUP-E45突变体.对该突变体进行表型观察、实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和全基因组测序实验.结果显示,突变的基因为Ago1(Argonaute 1),该基因编码的AGO1蛋白是miRNA通路中至关重要的蛋白,成熟的miRNA与AGO1蛋白结合形成miRISC沉默复合体(miRNA-induced silencing complex,miRISC)从而对靶基因的表达进行负调控.验证了该筛选体系的可行性.通过该筛选体系可筛选出其他参与miRNA合成、影响miRNA活性或miRNA运输等通路的因子,为后续拟南芥miRNA通路的研究奠定了基础.     

盐藻microRNAs高通量测序和生物信息学分析

小核糖核酸(microribonucleic acid,microRNA或miRNA)是一类内源性长约21~24个核苷酸碱基(nucleotide,nt)的非编码RNA,在真核生物的基因转录后调控中起着重要作用.杜氏盐藻(Dunaliella salina)是β-胡萝卜素含量最高的真核微藻,为探究其是否存在内源miRNA,构建了小RNA文库,通过Illumina HiSeq~(TM)2500高通量测序的方法对盐藻进行小RNA测序.测序共获得11 542 169条clean tags(3个盐藻文库clean tags数的平均值).比对Gnen Bank数据库、Rfam数据库及盐藻的参考基因组数据,筛选后的clean tags数据再比对miRBase数据库,3个盐藻生物学重复分别获得已知miRNA为42、41和44个.比对盐藻参考基因组及其miRNA前体发卡结构预测,3个重复分别获得盐藻新的miRNA为920、880和957个.预测所有miRNA的靶基因,并对其进行功能富集,发现靶基因在细胞代谢进程、分子功能的结合和催化活性方面较多.首次鉴定了杜氏盐藻中具有miRNA的存在,对揭示miRNA这一调控机制广泛存在于单细胞真核绿藻提供了依据.     

莱茵衣藻CrDRBs基因的克隆和生物信息学分析

双链核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)结合蛋白(double-stranded RNA-binding protein,DRB)是一类含有双链RNA结合结构域(dsRBD)的蛋白,在小核糖核酸(micro ribonucleic acid,microRNA或miRNA)的生物合成和作用方式选择方面起着重要作用.为获得莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii,C. reinhardtii)中所有CrDRBs的全长序列并进行生物信息学分析,从蛋白质功能结构域Pfam数据库中下载了dsRBD结构域模块,使用HMMER软件基于dsRBD检索C. reinhardtii全基因组序列,获得C. reinhardtii中4个含dsRBD结构域的CrDRB蛋白相关信息.抽提C. reinhardtii总RNA,反转录获得其cDNA,设计相应引物克隆获得其完整的基因ORF序列.设计实时荧光定量PCR引物,以actin基因为内参,分析C. reinhardtii各CrDRBs基因的相对表达.同源比对分析C. reinhardtii各CrDRBs蛋白的dsRBD序列.通过Phyre2软件在线预测其dsRBD的高级结构.将莱茵衣藻CrDRBs的dsRBD与拟南芥的5个DRB成员构建系统进化树分析,初步探讨分析莱茵衣藻CrDRBs各成员的的进化保守性.本研究共获得了4个莱茵衣藻双链RNA结合蛋白,均具有典型的dsRBD结构域,含有3个保守氨基酸.相比已报道的DUS16,其他3个CrDRBs的CDS序列较长,基因表达较高(除CrDRB2外).本研究为下一步揭示莱茵衣藻CrDRB在miRNA调控途径的功能奠定基础.     

糖尿病鼠骨骼肌萎缩相关环状RNA的研究

骨骼肌萎缩是糖尿病患者中、晚期严重并发症之一,为研究其分子发病机制,利用链脲佐菌素诱导构建小鼠1型糖尿病模型,通过高通量测序技术,调查与糖尿病肌萎缩病变相关的环状核糖核酸（circular ribonucleic acid,circRNA）表达谱,并利用生物信息分析软件探究circRNA在糖尿病骨骼肌萎缩病变中的可能作用．结果显示,与正常同基因背景小鼠的同类组织相比,糖尿病鼠的腓肠肌呈现：(1)肌纤维面积明显减小,运动功能下降;(2)含有1 403个与1型糖尿病发生发展相关的差异表达circRNA,其中,690个上调和713个下调;(3)通过基因本体、京都基因和基因组百科全书的功能富集分析显示,差异表达的候选circRNA亲本基因主要富集于转录调节生物学过程、细胞质成分和蛋白质结合分子功能等方面,以及促分裂原活化蛋白激酶信号通路、泛素介导的蛋白降解、叉头盒蛋白O通路与糖尿病肌萎缩相关的信号通路等．通过数据库信息和生物信息分析技术,预测与肌萎缩基因MuRF1相结合的小RNA(mirco RNA,miRNA),并挖掘出可调控它们表达的功能circRNA,构建了circRNA-miRNA-m...     

功能与疾病中的RBFox蛋白家族

RNA结合蛋白(RNA binding proteins,RBPs)是细胞内一类能与单链或双链核糖核酸(ribonuleic acid,RNA)结合并形成核糖核蛋白复合体的一类蛋白.RBFox (RNA binding proteins feminine gene on X chromosome)蛋白是RNA结合蛋白家族中的重要成员,在多种动物体内的特定组织细胞中表达并发挥生物学功能.已发现的RBFox蛋白包括RBFox1、RBFox2和RBFox3,均含有进化上高度保守的RNA识别结构基序(RNA recognition motif,RRM),能特异性地与(U) GCAUG序列结合并发挥作用.目前研究揭示了RBFox蛋白是一类多功能蛋白,除了调控RNA加工过程中的经典功能可变剪接之外,还广泛参与基因转录、mRNA稳定性调节、miRNA代谢以及蛋白翻译等过程,在心脏疾病、神经系统疾病、糖尿病和癌症等疾病的发生发展过程中起重要调控作用.本文概述了目前RBFox家族在调节剪接、转录、miRNA代谢和mRNA稳定性的4个功能及其在心脏疾病、神经系统疾病、糖尿病和癌症等多种疾病方面的研究进展,为RBFox蛋白的作用机制及其对疾病调控的进一步研究提供借鉴.     

约氏疟原虫Pys25和Pys48抗原的表达与产物活性初步研究

通过家蚕杆状病毒表面展示技术获得约氏疟原虫有性阶段候选抗原Pys25(217AA)和Pys48(455AA),以期建立一种新的鼠疟模型。首先利用大肠杆菌原核表达系统表达这两种抗原,免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,同时利用家蚕杆状病毒表面展示技术,并改造pFastBac Dual载体,在其Ph启动子前端加入哺乳动物启动子CMV,并将目的蛋白基因与杆状病毒囊膜蛋白gp64基因片段融合表达,融合蛋白展示在病毒粒子表面。用其免疫Balb/c小鼠,在小鼠体内,CMV启动子启动融合蛋白表达,共同刺激小鼠产生多克隆抗体。通过间接ELISA检测,两种抗原抗体效价均能达到1∶12 800。本实验为后期免疫阻断效应研究、多时期多价疫苗的构建及鼠疫模型的建立提供了实验基础。     

基于高通量数据的人体外源性植物miRNA跨界调控建模

以基于人体血清的高通量测序数据为研究对象,采用生物计算方法对数据进行分析,以目前已知的人类和植物的RNA数据作为参照集,从中筛选出可能的人体外源植物miRNA;基于miRNA的调控机制原理,获得可能的植物miRNA干扰人类mRNA的靶基因;构建植物miRNA-人类mRNA调控网络模型,分析可能的跨界调控作用。本文通过构建植物-人体跨界调控模型,共挖掘出9个核心模块。研究结果表明,外源性植物miRNA参与调控人体胺代谢、酒精代谢以及脂肪酸代谢等生物过程。     

食管鳞癌中3个新miRNA的分子功能预测

为寻找食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)诊断与治疗的新分子标志物,利用实时定量荧光PCR技术检测ESCC中3个未知miRNAs(miR-3914、miR-8082和miR-4770)的表达状况;运用生物信息学方法分别对它们差异表达miRNA下游的候选靶基因做基因本体(gene ontology,GO)富集和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析;采用蛋白免疫印迹方法观察转染miRNA mimic后一些与癌症发生和发展相关蛋白的表达改变.结果显示,与食管癌癌旁正常组织和正常食管上皮细胞比较,在ESCC组织/细胞中的miR-3914和miR-8082表达均呈显著性降低(P 0. 05),但miR-4770无明显的表达变化. GO富集分析发现,miR-3914和miR-8082参与RNA聚合酶II启动子转录、蛋白结合和细胞凋亡等生物学过程; KEGG富集分析发现,miR-3914和miR-8082两者均与癌症相关通路有关,且均可调控LAMC2、CCDC6和PDGFB基因.当ESCC细胞分别转染miR-3914 mimic和miR-8082 mimic后,与未转染组比较,p53蛋白质表达增加,而c-Myc和Bcl-2蛋白质表达降低.研究结果表明,miR-3914和miR-8082各自均具有成为辅助ESCC早期诊断与精准治疗生物靶标的潜能.     

家蚕MBP-Bmlp7蛋白的克隆表达及免疫学鉴定

克隆表达家蚕蚕蛹30 kD(1 kD=1 u)脂蛋白家族成员Bmlp7(Bombyx mori lipoprotein 7)的融合蛋白,鉴定其致敏原性.合成Bmlp7的基因后连接至载体质粒p MAL-C5e上,在大肠杆菌BL21中诱导表达出麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein,MBP)-Bmlp7,纯化后,利用Western blot鉴定MBP-Bmlp7融合蛋白与家蚕过敏患者血清中特异性免疫球蛋白E(immunoglobulins E,Ig E)的结合能力.结果显示,纯化得到了纯度较高的MBP-Bmlp7融合蛋白,且该融合蛋白能够与家蚕过敏患者血清特异性IgE结合,说明Bmlp7是家蚕中一种潜在的致敏原.     

RBP结合位点预测的深度学习方法进展

预测RNA结合蛋白(RBP)的结合位点对于理解RNA结合蛋白如何在基因调控中发挥作用起至关重要的作用.近年来,随着高通量实验数据的大量积累和深度学习的快速发展,深度学习方法在RBP结合位点预测领域上的应用越来越广泛.通过深度学习模型可以在海量的生物数据中挖掘隐藏的模式,与传统实验方法相比,具有低消耗、高速度、高鲁棒性的...     

约氏疟原虫Pys25和Pys48抗原的表达与产物活性初步研究

通过家蚕杆状病毒表面展示技术获得约氏疟原虫有性阶段候选抗原Pys25（217AA）和Pys48（455AA）,以期建立一种新的鼠疟模型。首先利用大肠杆菌原核表达系统表达这两种抗原,免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,同时利用家蚕杆状病毒表面展示技术,并改造pFastBac Dual载体,在其Ph启动子前端加入哺乳动物启动子CMV,并将目的蛋白基因与杆状病毒囊膜蛋白gp64基因片段融合表达,融合蛋白展示在病毒粒子表面。用其免疫Balb/c小鼠,在小鼠体内,CMV启动子启动融合蛋白表达,共同刺激小鼠产生多克隆抗体。通过间接ELISA检测,两种抗原抗体效价均能达到1∶12 800。本实验为后期免疫阻断效应研究、多时期多价疫苗的构建及鼠疫模型的建立提供了实验基础。     

拟南芥肌醇- 1-磷酸合酶类蛋白基因的克隆表达

以野生型拟南芥总RNA为模板,逆转录PCR反应获得拟南芥肌醇-1-磷酸合酶类蛋白基因cDNA（AtMIPS1）,开放读码框为1533bp,编码510个氨基酸．与已报道物种MIPS基因氨基酸序列比较分析表明,AtMIPS1与植物MIPS基因的氨基酸同源性和相似性较高达86％-90％与95％-96％,并含有MIPS基因的保守区域“334SYNHLGNNDG”．将该cDNA序列不改变阅读框架克隆到pET28a（＋）原核表达载体上,SDS—PAGE结果表明：在0．12g／LIPTG诱导2h的条件下得到最佳的蛋白表达效果,AtMIPS1的成功表达为其功能研究打下基础．     

家蚕30kDa载脂蛋白19G1前体的生物信息学分析及克隆表达

从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中发现了一条编码低分子量30 kDa载脂蛋白19G1前体 (low molecular mass 30 kDa lipoprotein 19G1 precursor)的EST序列(GeneBank登录号: AY568957),在NCBI数据库中比对后得知该基因的ORF长为771 bp,与基因组比对后发现该基因的ORF不含内含子,由单一外显子编码256个氨基酸残基的蛋白质,该蛋白属于家蚕30K蛋白家族,预测分子量约为29.5 kDa ,等点电为7.29;信号肽分析显示该蛋白很可能存在信号肽.根据该基因ORF进行引物设计,以家蚕基因组为模板,PCR扩增获得该基因,将其克隆到pET-28a(+)载体中并导入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,裂解菌作SDS-PAGE分析,结果表明该蛋白前体成功表达,为研究其功能打下了基础.