RNA干扰沉默STAT3基因表达对人胰腺癌细胞SW1990侵袭能力的影响

目的：观察信号转导与转录因子3（STAT3）siRNA表达载体对胰腺癌细胞侵袭能
力的影响,并探讨其机制。方法：实验分为空白对照组、阴性对照组及STAT3 siRNA组。以人
胰腺癌细胞株SW1990作为研究对象,将合成的STAT3 siRNA转染SW1990细胞后,采用RT-PCR及
Western blotting检测转染前后STAT3 mRNA及蛋白的表达变化,Transwell法检测其对胰腺癌
细胞侵袭能力的影响,RT-PCR及Western blotting检测其对胰腺癌细胞MMP-2和MMP-9表达
的影响。结果：STAT3 siRNA转染胰腺癌细胞72 h后,STAT3 mRNA和蛋白表达水平均明显降低,
与空白对照组及阴性对照组比较,差异有统计学意义（P<0.05）;转染后胰腺癌细
胞的侵袭细胞数及MMP-2和MMP-9的表达显著减小,与阴性对照组及空白对照组比较,差异有统
计学意义（P<0.05）。结论：STAT3 siRNA能特异地阻断胰腺癌细胞中STAT3信号的活
化,并进一步通过下调MMP-2和MMP-9的表达从而抑制胰腺癌细胞的侵袭能力。     

STAT3基因siRNA表达载体的构建及鉴定

目的利用RNA干扰技术,以信号转导和转录激活因子3(STAT3)为靶基因,设计构建重组体,并进行序列分析鉴定。方法设计一条有小发夹结构的DNA序列,聚合酶链反应(PCR)扩增合成siRNA表达框架(SECs)表达框架,克隆至载体psi Lent GeneTM中构建重组体,转化E.coli DH5α菌株,提取质粒进行酶切鉴定后测序分析。结果重组质粒经EcoRⅤ酶切、电泳、测序分析表明插入序列正确,重组质粒构建成功。结论成功构建了STAT3靶向RNA干扰重组体,为肿瘤的基因治疗在分子水平、细胞水平和整体水平的研究提供一些新方法。     

毛酸浆内酯通过抑制STAT3诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡

[目的]旨在探讨信号转导和转录激活因子3(STAT3)在毛酸浆内酯（PPB）诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡中发挥的作用。[方法]采用荧光染色法分析PPB诱导MCF-7细胞凋亡;使用生物信息学方法预测PPB抗乳腺癌的潜在机制;采用噻唑蓝（MTT）法考察STAT3抑制剂S3I-201以及STAT3小干扰RNA(siRNA)对PPB抑制MCF-7细胞生长的作用;采用蛋白免疫印迹（Western Blot）法考察PPB单独处理或STAT3 siRNA预处理后对MCF-7细胞中STAT3、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8(Caspase8)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(Caspase9)、细胞色素c(Cytochrome c)以及多聚ADP核糖聚合酶（PARP）蛋白表达的影响。[结果] MCF-7细胞经PPB作用后凋亡形态特征明显,凋亡比例上升;生物信息学结果显示PPB与乳腺癌疾病的共同靶点STAT3在乳腺癌组织中高表达,单基因GSEA结果提示STAT3高表达与凋亡信号通路呈负相关;Western Blot法检测结果显示PPB能够抑制STAT...     

转染STAT3诱饵寡核苷酸对人胃癌细胞的影响

目的 通过研究STAT3诱饵寡核苷酸对人胃腺癌MKN45细胞增生活性及其MMP-2,CD44v6和ICAM-1表达的影响,寻求胃癌治疗中的新靶点.方法 以人胃癌细胞MKN45为对象,体外药物敏感实验(MTT)法检测STAT3诱饵寡核苷酸对肿瘤细胞的增殖抑制效应,免疫组化S-P法检测胃癌细胞MMP-2,CD44v6和ICAM-1表达变化情况.结果 (1)STAT3诱饵寡核苷酸对人胃癌细胞生长的抑制作用呈时间依赖性;(2)STAT3诱饵寡核苷酸可明显抑制胃癌细胞株细胞MMP-2,CD44v6和ICAM-1的表达.结论 STAT3诱饵寡核苷酸可通过抑制胃癌细胞的分裂和增殖,抑制胃癌细胞MMP-2,CD44v6和ICAM-1的表达,干扰肿瘤的转移与复发.     

miR-590-5 p靶向调控STAT3基因对骨肉瘤143 B细胞迁移和侵袭的影响

目的:探讨miR-590-5p和信号转导与转录激活因子3(STAT3)基因在骨肉瘤143B细胞中的表达,探讨miR-590-5p对STAT3基因的靶向作用及其对143B细胞迁移和侵袭的影响.方法:运用生物信息学方法对miR-590-5p和STAT3基因的靶向配对关系进行预测,采用荧光素酶报告系统鉴定;脂质体2000转染miR-590-5p模拟物以及干扰STAT3的siRNA后,real-time PCR检测miR-590-5p和STAT3 mRNA在癌细胞中的表达,Western blotting检测STAT3蛋白在癌细胞中的表达,细胞划痕实验检测癌细胞的迁移情况以及Transwell小室检测癌细胞体外的侵袭性.结果:生物信息学软件TargetScan和miRanda显示miR-590-5p和STAT3基因二者靶向配对良好,荧光素酶报告系统鉴定发现miR-590-5p能够抑制STAT3 mRNA表达.Real-time PCR和Western blotting检测结果均表明过表达miR-590-5p能够降低STAT3 mRNA和蛋白的表达.细胞划痕实验和Transwell实验发现过表达miR-590-5p能够分别抑制143B细胞的迁移和侵袭.结论:miR-590-5p通过负性靶向调控骨肉瘤143B细胞中STAT3基因的表达,进而抑制癌细胞的迁移和侵袭.     

siRNA敲除STAT3基因对结肠癌HCT116细胞侵袭的抑制

目的:了解RNA干扰沉默STAT3基因对结肠癌细胞侵袭的可能作用.方法:根据STAT3基因特点,设计合成STAT3小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),并转染人结肠癌细胞系HCT116后,采用RT-PCR检测STAT3mRNA,采用软琼脂集落培养试验检测癌细胞锚着不依赖性增殖,采用Boyden小室模型试验检测癌细胞的侵袭能力.结果:STAT3 siRNA可有效抑制结肠癌细胞集落生长和侵袭能力,且与浓度相关.结论:STAT3 siRNA可抑制结肠癌细胞的侵袭.     

RNAi沉默STAT3基因对人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用

目的：研究pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3重组质粒对人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用,阐明RNA干涉技术在卵巢癌生物治疗领域中的作用。方法：应用人卵巢癌细胞系SKOV3对15例裸鼠建立人卵巢癌皮下移植瘤模型,随机分为3组：对照组（生理盐水）、空质粒对照组及重组质粒组（pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3）。应用电子穿孔仪将质粒转入裸鼠移植瘤内,观察重组质粒注射后第7、14、21和28天各组裸鼠皮下移植瘤体积变化。利用Western blotting检测重组质粒对STAT3蛋白表达的影响,采用HE及TUNEL染色方法观察肿瘤组织形态变化及细胞凋亡情况。结果：重组质粒瘤内注射对SKOV3裸鼠皮下移植瘤的生长有明显的抑制作用,与2个对照组比较,重组质粒组裸鼠移植瘤生长速度明显减慢（P<0.01）。重组质粒组瘤体内STAT3及CyclinD1、VEGF、survivin、c-myc蛋白表达明显低于2个对照组（P<0.01）。HE染色显示,重组质粒组肿瘤细胞出现大片细胞坏死,2个对照组肿瘤细胞以正常形态居多。TUNEL染色显示,重组质粒组癌组织有大量细胞凋亡,2个对照组几乎均为TUNEL阴性反应细胞。结论：pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3重组质粒能明显抑制人卵巢癌细胞SKOV3裸鼠皮下移植瘤的生长。     

STAT3在食管鳞癌细胞系中的激活及其靶基因产物的表达

目的 分析食管鳞癌细胞系中信号传导及转录活化因子3（STAT3）在不同食管鳞癌细胞系中的激活状态及其对食管鳞癌细胞的生存及转化作用,探讨是否在不同类型的食管鳞癌细胞系中存在组成性激活的STAT3信号通路。方法采用Western blotting检测两株食管鳞癌细胞中STAT3及磷酸化STAT3（p-STAT3）,血管内皮生长因子（VEGF）和BCI-2蛋白的表达情况,并采用凝胶电泳迁移率（EMSA）法检测两株食管鳞癌细胞核中p-STAT3蛋白与其特异的DNA序列结合能力。RT-PCR法检测STAT3、VEGF和BCI-2mRNA的表达。结果食管鳞癌细胞中存在激活的STAT3信号传导通路,通路蛋白STAT3、p—STAT3及其下游靶基因产物VEGF、BCI-2在两种食管鳞癌细胞中均有表达,p-STAT3蛋白在细胞核中具有较高的DNA结合活性。RT-PCR结果表明,STAT3、VEGF和BCI-2的mRNA在细胞中也存在过表达。结论本研究发现在两种食管鳞癌细胞系中均有组成性激活的STAT3信号通路,提示STAT3信号通路可能在食管鳞癌发生、发展中起重要作用。     

siRNA沉默Livin基因对乳腺癌MCF-7细胞化学治疗增敏作用的研究

目的：观察小干扰RNA（siRNA）沉默Livin基因对人乳腺癌细胞MCF‐7细胞生物学影响及siRNA沉默MCF‐7细胞Livin基因对4种化学治疗药物的增敏作用。方法 Lipofectamine 2000脂质体转染法转染MCF‐7。分组：空白组（无转染）、脂质体组、反义组、错义组、联合组。MTT法测定氟尿嘧啶（5‐FU）、表柔比星（EPI）、多西紫杉醇（DXT）、吉西他滨（GEM）单药（单药组）对乳腺癌细胞MCF‐7增殖的抑制作用。免疫组织化学检测Livin蛋白在MCF‐7细胞中的表达及转染联合化学治疗药物对Livin蛋白的表达变化。实时荧光定量PCR（RT‐PCR）检测转染Livin siRNA后乳腺癌MCF‐7细胞的Livin基因表达变化。同时利用Annexin‐V检测乳腺癌细胞的凋亡及siRNA Livin联合5‐FU、EPI、DXT、GEM 诱导乳腺癌细胞凋亡的影响。结果 Livin在MCF‐7细胞中高表达,4种化学治疗药物对 Livin表达无明显影响,转染Livin基因48、72 h后联合4种药物后能明显下调Livin蛋白表达,差异有统计学意义（P＜0．05）。5‐FU、EPI、DXT、GEM治疗乳腺癌MCF‐7细胞48、72 h均能明显的引起细胞的凋亡,且呈剂量依赖性。转染Livin基因48 h联合4种药物后乳腺癌MCF‐7细胞的凋亡率明显高于单药处理的细胞,差异有统计学意义（P＜0．01）。结论 siRNA沉默Livin基因能促进由化学治疗药物5‐FU、EPI、DXT、GEM引起的细胞凋亡,具有化学治疗增敏作用。     

siRNA沉默FAK基因表达对乳腺癌MCF-7细胞生物学特性的影响

目的:研究RNAi干扰粘着斑激酶(Focal adhesion kinase,FAK)的表达及对人类乳腺癌细胞生物学特性的影响.方法:构建表达FAK基因siRNA的重组质粒FAK-siRNA,在脂质体的介导下转染入人乳腺癌MCF-7细胞,荧光倒置显微镜下观察转染效率,应用RT-PCR和Western blot检测FAK mRNA和蛋白表达,流式细胞术分析细胞周期分布,体外实验测定肿瘤细胞穿透matrigel的能力.结果:成功转染FAK-siRNA后乳腺癌MCF-7细胞FAK基因的表达与阴性对照组、空白质粒转染组相比FAK mRNA和蛋白表达水平明显降低(P＜0.05),细胞增殖指数及侵袭力明显降低(P＜0.01).结论:FAK-siRNA能有效抑制人乳腺癌细胞FAK基因mRNA和蛋白的表达,降低细胞增殖能力及侵袭力.     

Inhibition of cell proliferation by siRNA targeting hPRLR in breast cancer MCF-7 cell line

Objective： To study the inhibition of proliferation of breast cancer by small interfering RNA（siRNA） targeting human prolactin （hPRLR） and the underlying mechanisms. Methods：The siRNA targeting hPRLR was chemically synthesized and transfected into MCF-7 cells, the expression of hPRLR was analyzed by real-time quantitive PCR, cell growth inhibition was measured with MTT assay, cell cycle of the transfected cells was examined by flow cytometry, meanwhile, expression of cyclin D1 was tested by semi-quantitative RT-PCR, Results：24 h after transfection with 100 nmol/L siRNA-PRLR, the expression of hPRLR mRNA was suppressed by 65%, cells in G1 phase increased, but cells in S phase decreased. Down regulated hPRLR expression exhibited significant inhibition in cell proliferation. And the expression of cyclin D 1 was down regulated. Conclusion：The results indicate that siRNA-hPRLR is a useful tool for silencing hPRLR expression and inhibiting cell proliferation in breast cancer MCF-7 cell line, and it may be a possible new approach for breast cancer gene therapy.     

siRNA抑制Ki-67表达对乳腺癌MCF-7／ADR细胞阿霉素耐药性的研究

目的采用Ki-67RNA表达载体干扰沉默Ki-67基因,检测其对乳腺癌MCF-7／ADR细胞株耐-67mRNA及蛋白表达的影响,观察沉默艇-67基因前后乳腺癌细胞株对阿霉素敏感性改变。方法体外合成靶向艇-67siRNA表达载体,应用脂质体法瞬时转染尉-67高表达的乳腺癌细胞株MCF-7／ADR,应用RT-PCR和Western印迹法检测转染后Ki-67mRNA及蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖活性及转染前后细胞对阿霉素敏感性的变化。结果Ki-67siRNA载体转染后24h可显著抑制乳腺癌MCF-7／ADR细胞株的Ki-67mRNA和蛋白表达及细胞的增殖活性。Ki-67siRNA组阿霉素IC50值为（6．3±0．9）μg/ml。结论si—Ki-67能够有效抑制Ki-67基因的表达,降低乳腺癌细胞的增殖能力,沉默Ki-67表达能部分逆转阿霉素耐药现象。     

siRNA沉默MACC1基因对乳腺癌细胞MCF-7增殖和迁移的影响

目的:观察siRNA沉默MACC1基因对乳腺癌细胞MCF-7增殖和迁移的影响。方法:使用siRNA-MACC1对MCF-7细胞进行转染处理为实验组,空白组细胞不作任何处理,阴性对照组细胞经siRNA-NC转染处理。显微镜下观察转染效果,使用荧光定量PCR和Western Blot法分别检测并比较三组MACC1 mRNA和蛋白表达水平,使用MTT法和Transwell小室实验分别检测并比较三组细胞的增殖和迁移能力。结果:与空白组比较,实验组MACC1 mRNA和蛋白质表达水平均受到明显抑制(P<0.05),实验组MCF-7细胞的增殖和迁移能力均弱于空白组。结论:siRNA沉默MACCI基因可显著抑制乳腺癌细胞MCF-7的迁移和增殖。     

地塞米松对人乳腺癌细胞系MCF-7细胞增殖及细胞周期的影响

目的:观察不同浓度的地塞米松(Dex) 对人乳腺癌细胞系(MCF-7) 细胞增殖、细胞周期分布及P21/WAF1表达的影响.方法:以不同浓度Dex(10-10～10-6 mol/L)处理细胞,采用活细胞计数法观察细胞增殖情况;测定碱性磷酸酶(AKP)活性;通过流式细胞仪技术,测定Dex作用后其细胞周期分布;通过蛋白印迹分析的方法检测Dex对p21/WAF1表达的影响.结果:Dex对MCF-7细胞的增殖有明显抑制作用, 10-7mol/L Dex作用5 d后活细胞计数为对照组的70%,细胞在G0/G1期停滞; Dex还可使MCF-7 细胞AKP活性增高,这种作用具有时间和剂量依赖性;Dex对p21/WAF1表达无明显影响.结论:Dex对MCF-7细胞有明显的增殖抑制作用,细胞在G0/G1期停滞.     

hIAP-2 siRNA表达质粒的构建及其对乳腺癌细胞MCF-7的作用

目的:构建人凋亡抑制蛋白2(hIAP-2)基因的小分子干扰RNA(siRNA)的表达质粒,并检测其对乳腺癌细胞MCF-7的作用.方法:利用含U6启动子的mU6pro载体构建hIAP-2 siRNA表达质粒,RT-PCR和Western印迹法检验其对MCF-7细胞的RNA干扰(RNAi)效果.用MTT法分析其对细胞增殖,流式细胞仪检测其对细胞周期,以及Hoechst染色法观察其对细胞形态的影响.同时,用胱天蛋白酶-3(caspase-3) Ac-DEVD-pNA底物法检测caspase-3活性的变化,Western印迹法检测一些相关蛋白质的表达变化.结果:hIAP-2 siRNA表达质粒高效而特异地剔降MCF-7细胞中hIAP-2的表达,抑制肿瘤细胞增殖(P<0.01),阻断MCF-7细胞在G1期.随着hIAP-2基因被沉默,MCF-7细胞变得多核化和巨核化,caspase-3酶原表达升高并被激活(P<0.01).此外,IκBα和p21waf1蛋白表达升高,NF-κB(p65)则降低,Cyt C维持不变.结论:RNA干扰hIAP-2对MCF-7细胞增殖和细胞周期调控有重要影响,细胞裂亡可能是导致其细胞死亡的主要原因,DNA受损后其细胞周期阻滞在G1期可能与上调p21waf1有关.     

siRNA逆转乳腺癌多药耐药的研究

目的研究siRNA(small interfering RNA)对乳腺癌多药耐药性的逆转作用。方法设计针对MRP基因的siRNA,转染乳腺癌MCF-7/adr细胞,用实时荧光定量PCR分析MRP mRNA的表达;流式细胞仪检测MRP蛋白表达和细胞内柔红霉素积累量。结果该siRNA能使耐药细胞株MCF-7/adr中MRP基因的mRNA及蛋白表达水平分别下调(58.16±1.36)%、(51.87±1.90)%(P<0.05),细胞内柔红霉素积累量显著增加(P<0.01)。结论siRNA可逆转乳腺癌的多药耐药。     

人乳腺癌细胞株MCF-7、MCF-7／ADM细胞迁移能力的对比研究

目的探讨乳腺癌细胞化疗继发耐药后细胞迁移能力的变化,并筛选出相关基因。方法以MCF-7细胞株为亲本细胞,采用阿霉素（ADM）低浓度持续加量诱导法建立对ADM耐药的人乳腺癌细胞株MCF-7／ADM。应用ATP-TCA药物敏感检测法和×CELLligence／RT-CES实时细胞电子分析系统检测人乳腺癌细胞株MCF-7、MCF-7／ADM对多种化疗药物的耐药情况及细胞增殖能力。应用Transwell实验和xCELLligence／RT-CIM实时细胞电子分析系统检测人乳腺癌细胞株MCF-7、MCF-7／ADM的细胞迁移能力。应用比较基因组芯片筛选出人乳腺癌细胞株MCF-7、MCF-7／ADMDNA拷贝数4倍差异的基因。结果撤药培养150d后,MCF-7／ADM细胞较亲本细胞MCF-7的ADM耐药指数为72.9,对其他化疗药物无明显的交叉耐药性。MCF-7／ADM细胞迁移能力较MCF-7明显降低（P〈0．05）。MCF-7／ADM有12种基因DNA拷贝数是MCF-7的4倍,MCF-7有6种基因DNA拷贝数是MCF-7／ADM的4倍。结论乳腺癌细胞化疗继发耐药伴随细胞迁移能力明显降低,其相关基因的DNA拷贝数亦有明显差异。