N-甲基-N-亚硝脲对大鼠视网膜光感受器的毒性作用

目的:观察N-甲基-N-亚硝脲(N-methyl-N-nitrosourea,MNU)对SD大鼠视网膜光感受器细胞的毒性作用。方法:雌性SD大鼠100只,分17组,正常对照组4只,其余组各6只。在大鼠生后50 d,分别一次腹腔注射MNU 50 mg／kg、60 mg／kg、70 mg／kg和80 mg／kg。在MNU处理后24、48、72 h和7 d处死大鼠,取眼球,做组织学检查。结果:不同剂量的MNU均引起中心视网膜和周边视网膜损伤,其损害的程度与MNU的剂量呈正比。作用24 h后,可见视网膜光感受器细胞核固缩、破坏及光感受器外节部定向紊乱;48 h或72 h后,可见光感受器细胞丧失;7 d后,外颗粒层和光感受层几乎完全消失。结论:MNU对大鼠视网膜光感受器细胞有选择性的毒性作用,该作用呈剂量和时间依赖性。     

N-甲基-N-亚硝脲对猫视网膜光感受器细胞损害的研究

背景合理的视网膜色素变性（RP）动物模型的建立方法是进行RP干预和治疗的重要工具和手段。研究证实,N-甲基-N-亚硝脲（MNU）可造成哺乳动物光感受器细胞的选择性损害,但是否MNU可用于建立RP动物模型的报道较少。目的评估MNU对猫视网膜光感受器细胞的毒性损害作用。方法20只2岁龄的猫一次性股静脉注射MNU,并按照注射剂量的不同分为20、25、30、35、40mg／kgMNU组,每组4只。另外4只猫股静脉注射等量生理盐水作为对照组。MNU注射后每日观察实验猫的行为变化、瞳孔大小及对光反射情况,分别于注射后24h、72h、7d和14d用静脉注射过量的质量分数2％戊巴比妥钠处死实验猫,眼球摘除后制备视网膜切片进行组织病理学检查,评估不同剂量MNU对视网膜光感受器的影响。结果不同剂量MNU组的实验猫注射MNU7d后瞳孔散大,对光反射迟钝。MNU注射24h,猫视网膜光感受器细胞的损害以核固缩和排列紊乱为主,MNU注射72h,视网膜光感受器细胞的损害以外核层变薄和细胞碎裂为主,MNU注射7d后,40mg／kg注射组的实验猫均死亡,光感受器细胞层仅存在极少量细胞,MNU注射14d,视网膜光感受器细胞层均完全消失。各组视网膜损害程度与注射MNU剂量有关。结论MNU可以造成猫视网膜光感受器细胞的严重损害,MNU对视网膜光感受器的作用呈时间和剂量依赖性。     

金钠多、灯盏花素对N-甲基-N-亚硝脲诱导SD大鼠视网膜变性的保护作用

目的　观察金钠多 (Gin)、灯盏花素 (Bre)对N 甲基 N 亚硝脲 (MNU)诱导SD大鼠视网膜变性的保护作用及机制。方法　雌性SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、Gin组和Bre组。其中Gin又分大剂量和中剂量组 ,Bre分大剂量、中剂量和小剂量组。于生后 47d开始腹腔注射给药 ,每日 1次 ,连续给药 4d和 10d ,并于生后 50d腹腔注射MNU 60mg/kg。在MNU处理 2 4h和 7d后处死动物 ,取眼球。通过视网膜形态学分析测量周边视网膜的总厚度 ,TUNEL试剂盒检测光感受器细胞凋亡。结果　MNU处理 7d后 ,模型组周边视网膜的总厚度为 3 6μm ,Gin组和Bre组分别为 44、3 7、58、43和 3 9μm。MNU处理 2 4h后 ,模型组周边视网膜的光感受器细胞凋亡指数为 (3 8 0± 3 6) % ,Gin组和Bre组分别为 (2 6 3± 2 7) %、(3 7 4± 2 9) %、(19 4± 1 9) %、(2 8 0± 3 0 ) %和 (3 6 9± 2 1) %。结论　Gin和Bre对MNU引起的周边视网膜损伤有一定的保护作用 ,呈剂量依赖性 ,其作用机制是通过抑制光感受器细胞发生凋亡。但二者对中心视网膜均无保护作用     

N-甲基-N-亚硝脲诱导大鼠视网膜光感受器细胞凋亡

目的 探讨N一甲基一N一亚硝脲(MNu)对大鼠视网膜光感受器细胞毒性作用的机制。 方法 将生后50 d的雌性SD大鼠30只分别按60 mg／kg的剂量一次性腹腔注射MNu。在注射MNU 12、24、48、72 h和7 d后，颈椎脱臼法处死大鼠，取出眼球，做病理切片。另6只生后50 d的雌性sD大鼠为正常对照。用TuNEI一试剂盒和透射电镜检测光感受器细胞凋亡；免疫组织化学方法检测MNU作用不同时间视网膜细胞内增生细胞核抗原(PcNA)、弹性蛋白和胶质纤维酸蛋白(GFAP)的表达。 结果 MNu作用后极部视网膜光感受器细胞12、24、48、72 h和7 d后的凋亡指数分别是(33．6±2．3)％、(46．5±5．7)％、(20·l±5·3)％、(8-2±3·6)％和(2．O±O．8)％。在MNu作用后24 h，大部分光感受器细胞出现核固缩；24 h后，内颗粒层及内颗粒层和脉络膜之间有PcNA表达，72 h达高峰，7 d后明显减少；24 h后，内颗粒层和外颗粒层开始出现GFAP和弹性蛋白的阳性表达，72 h达高峰，7 d后明显减少。 结论 MNu可选择性地诱导视网膜光感受器细胞发生凋亡及引起Mnller细胞增生。 （中华眼底病杂志，2004，20：33-36）     

大鼠视网膜变性中药保护作用的实验研究

目的观察金钠多(Ginaton,Gin)和葛根素(Puerarin,Pue)对N-甲基-N-亚硝脲(N-methyl-N-nitrosorea,MNU)诱导SD大鼠视网膜变性的保护作用及机制。方法雌性SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、Gin大剂量和中剂量组、Pue大剂量和中剂量组。于生后47d开始腹腔注射给药,每日1次。并于生后50d,模型组和各药物处理组的大鼠腹腔注射MNU60mg·kg-1,正常对照组腹腔注射生理盐水。在MNU或生理盐水处理后不同时间处死动物,取眼球。视网膜形态学分析测量周边视网膜总厚度,TUNEL试剂盒检测感受器细胞凋亡。结果MNU处理7d后,模型纽周边视网膜总厚度为36μm,Gin组(大剂量和中剂量)和Pue组(大剂量和中剂量)分别为(44±2)μm,(37±2)μm,(46±2)μm,(35±2)μm。MNU处理24h后,模型组周边视网膜光感受细胞凋亡指数为(38.0±3.6)%,Gin大剂量组、中剂量组、Pue大剂量组和中剂量组分别为(26.3±2.7)%,(37.4±2.9)%,(25.4±3.0)%,(39.0±2.5)%.结论Gin和Pue对MNU引起周边视网膜损伤有一定的保护作用,呈剂量依赖性,其作用机制是通过抑制光感受器细胞发生凋亡。但二者对中心视网膜均无保护作用。     

骨髓间充质干细胞(MSCs)对N-甲基-N-亚硝脲(MNU)诱导的C57BL小鼠视网膜变性的治疗作用

目的 观察骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)对N-甲基-N-亚硝脲(N-methyl-N-nitrosourea,MNU)诱导的C57BL小鼠视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)的治疗作用.方法 应用不同剂量(30 mg·kg-1、45 mg·kg-1、60 mg·kg-1、75 mg·kg-1、90 mg·kg-1)的MNU腹腔注射给予C57BL小鼠和MNU作用不同时间(1d、3d、7d)后,通过视网膜电图(electroretinogram,ERG)和HE染色检测小鼠视网膜的电生理功能和组织形态变化,优化建立稳定的RP动物模型的最佳条件;在此动物模型的基础上,经玻璃体内注射和尾静脉注射给予MSCs移植,并应用ERG和HE染色评估MSCs对MNU诱导的RP的治疗作用.结果 与对照组相比,30 mg·kg-、45mg·kg-1剂量的MNU可引起视网膜形态和功能的轻微损伤,而60 mg·kg-1及其以上剂量的MNU可使视网膜ERG波幅明显降低(均为P ＜0.001),视网膜外核层(outer nuclear layer,ONL)厚度明显变薄(P ＜0.001),损伤严重;与对照组相比,60 mg·kg-的MNU作用后1d和3d,视网膜ERG波形开始降低,形态结构开始出现ONL厚度变薄的损伤,作用7d时,ERG波形呈现熄灭型(均为P＜0.001),ONL厚度明显变薄(P ＜0.001),内外核层融合,损伤严重.与MNU单独作用组相比,60 mg·kg-1 MNU作用1d后给予MSCs移植,7d后MSCs组内ONL厚度增加(P ＜0.001),视网膜ERG波形趋于恢复(均为P＜0.001).结论 MSCs移植对MNU诱导的视网膜退行性变有一定的治疗作用.     

杞菊地黄汤对化学诱导光感受器细胞凋亡大鼠的治疗观察

目的观察不同剂量杞菊地黄汤对N甲基N亚硝脲(NmethylNnitrosourea,MNU)诱导的大鼠光感受器细胞凋亡的影响。方法SD大鼠分为正常组、模型对照组以及杞菊地黄汤6倍、3倍、1倍和1/3倍各剂量组。TUNEL法检测光感受器细胞的凋亡,常规HE染色测量视网膜外核层的厚度。结果与模型对照组相比,3倍与1倍剂量杞菊地黄汤能显著降低MNU诱导的大鼠外核层细胞凋亡百分率(P<0.01),维持外核层厚度(P<0.01);6倍和1/3倍剂量杞菊地黄汤组大鼠与模型组无差异(P>0.05)。结论3倍与1倍剂量的杞菊地黄汤对MNU诱导的光感受器细胞凋亡有抑制作用。     

N-甲基-N亚硝脲诱导的大鼠视网膜损伤过程中光感受器间维生素A类结合蛋白和恢复蛋白的达达变化

观察N-甲基-N亚硝脲(MNU)诱导的大鼠视网膜损伤对光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP)和恢复蛋白(recoverin)在视网膜中的表达变化.方法雌性Sprague-Dawley大鼠30只随机分为正常对照组和MNU处理1、3、7、10d组,每组均为6只大鼠.不同时间MNU处理组大鼠按体重40 mg/kg给予一次性腹腔注射MNU;正常对照组大鼠腹腔注射生理盐水5 ml/kg.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫荧光检测各组大鼠视网膜中IRBP和恢复蛋白的mRNA及蛋白表达.结果 RT-PCR检测结果显示,与正常对照组比较,不同时间MNU处理组IRBP的mRNA表达水平随MNU作用时间增加而逐渐降低,差异均有统计学意义(P＜0.01);恢复蛋白的mRNA表达水平随MNU作用时间增加而逐渐升高.MNU处理1d组恢复蛋白的mRNA表达水平与正常对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05);MNU处理组3、7、10d组恢复蛋白的mRNA表达水平与正常对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).免疫荧光显微镜观察结果显示,正常对照组大鼠视网膜IRBP主要表达在光感受器细胞内、外节;不同时间MNU处理组IRBP在视网膜各层均有表达并随MNU作用时间增加而逐渐降低.恢复蛋白阳性标记物主要见于视网膜内核层、内丛状层及节细胞层,随MNU作用时间增加恢复蛋白的表达逐渐增强.结论MNU可降低IRBP的表达,但增加恢复蛋白的表达.     

N-甲基-N-亚硝基脲诱导大鼠视网膜变性早期基因表达谱分析

背景N-甲基-N-亚硝基脲（MNU）诱导的大鼠光感受器细胞凋亡可用于研究视网膜变性类疾病,但视网膜变性类疾病早期基因水平的研究尚未见报道。目的应用基因芯片技术研究MNU诱导的视网膜变性大鼠早期基因表达谱的变化。方法6周龄雌性SD大鼠50只分为正常组20只、12h模型组20只和24h模型组10只。模型组大鼠皮下注射MNU（40mg／kg）,正常组大鼠皮下注射等容量的生理盐水作为对照。分别于造模后12、12、24h处死正常组和12h模型组、24h模型组大鼠,大鼠右眼球进行常规视网膜组织病理学检查,正常组和12h模型组大鼠左眼的新鲜视网膜用基因芯片技术检测差异基因的表达,用荧光实时定量PCR（real—timePCR）法验证基因芯片技术检测出的差异表达率≥2．0的基因mRNA表达水平。结果全层视网膜厚度测量表明,24h模型组大鼠的厚度值明显低于正常组大鼠和12h模型组大鼠,差异均有统计学意义（t=9．926,P=0．002;t=2．736,P=0．028）。24h模型组大鼠外核层厚度值为（26．58±2．90）仙m,明显低于正常组的（38．11±1．01）μm和12h模型组的（35．07±3．03）μm,差异均有统计学意义（t=6．028,P=0．009;f=6．839,P=0．006）,正常组与12h模型组间大鼠全层视网膜厚度和外核层厚度值比较差异均无统计学意义（全层厚度：t=1．541,P=0．324;外核层厚度：t=2．040,P=0．134）。大鼠cDNA基因芯片技术检测结果表明,12h模型组大鼠全部17000个基因的表达谱中涉及生物过程的基因为142个,涉及分子功能的基因为94个,排除重复基因共有74个基因,差异表达基因主要涉及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路、Toll样受体通路和细胞凋亡通路。对基因芯片技术检测的差异表达率≥2．0的基因进行的real．timePCR定量分析表明,CCL2、,L—Jb、CCL3、c-fos、c—myc、p53和MMP3基因mRNA表达值与基因芯片技术检测的表达趋势一致。结论MNU诱导的视网膜变性早期有明显的基因表达改变。基因芯片检测的基因表达改变结果与real—timePCR定量分析结果一致。     

N-亚硝基-N-甲基脲诱导视网膜变性小鼠模型的特征

目的探讨N-亚硝基-N-甲基脲（MNU）诱导的小鼠视网膜退行性病变的形态和电生理特征。方法实验研究。32只5周龄的成年C57/BL小鼠随机分为对照组和MNU造模组,分别腹腔注射0.9%氯化钠溶液和MNU（60 mg·kg-1）。在给药后3、7和14 d取视网膜,免疫荧光染色观察光感受器形态、氧化损伤情况和神经节细胞的数量。电镜观察细胞核、线粒体和带状突触（synaptic ribbon）的超微结构。Ganzfeld视网膜电图（ERG）检测暗适应最大混合反应。采用独立样本t检验进行数据分析。结果免疫荧光显示：注射MNU后外核层（ONL）的厚度逐渐减小,OPN1SW标记的光感受器细胞的外节（OS）逐渐损伤,GFAP标记的Müller细胞增生明显,ONL层硝基酪氨酸（Nitrotyrosine）着色增多提示MNU能导致氧化损伤。Brn-3a标记的神经节细胞数量减少不明显。扫描电子显微镜显示：MNU处理后,光感受器细胞的核呈浓染色,线粒体和带状突触消失。ERG结果显示：MNU处理后3 d最大混合反应的a波和b波振幅下降。结论MNU导致视网膜外核层和外丛状层的凋亡,电生理表现和视网膜色素变性疾病一致。     

消朦灵对糖尿病大鼠视网膜TNF-α及JAK/STAT信号转导通路的调控作用

目的：探讨消朦灵片对肿瘤坏死因子α（TNF-α）和Janus激酶2/信号转导与转录激活子途径5（JAK2/ STAT5）信号通路的调控作用,及防治糖尿病视网膜病变的机理。方法：实验研究。选取50 只SD雄性大鼠,随机抽取8只作为空白组。余42只以链脲佐菌素（STZ）腹腔注射诱导制作糖尿病大鼠模型;造模成功40 只,随机分成模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组,每组10 只。模型组不予处理,低剂量组、中剂量组和高剂量组分别给予消朦灵片0.1 g/100 g、0.2 g/100 g、0.3 g/100 g进行治疗。治疗4 个月后观察各组大鼠体质量、血糖变化。通过光学显微镜及透射电子显微镜观察视网膜超微结构变化。采用Western Blot法检测TNF-α、JAK2/STAT5 蛋白表达的变化。对相关数据行重复测量资料的方差分析及单因素方差分析。结果：空白组大鼠视网膜中TNF-α、JAK/STAT有少量表达,模型组表达较多,消朦灵低剂量、中剂量、高剂量组表达依次减少,其中高剂量组表达明显下降,差异有统计学意义（F=4.61、4.23、3.28,P<0.05）。生物光学显微镜下大鼠视网膜结构,空白组结构正常;模型组各层组织排列紊乱,视网膜水肿,毛细血管扩张明显,神经节细胞数量减少,细胞核固缩,内核层空泡变性;高剂量组视网膜各层排列欠规则,轻度水肿,神经节细胞及内核层数量减少。透射电镜下空白组大鼠视网膜结构正常;模型组外节膜盘中段断裂、溶解、溃变,线粒体嵴消失,排列不规则,视锥细胞形态不规则,核中染色质分布不均匀,毛细血管基底膜增厚,管腔狭窄;高剂量组视网膜外节膜盘间隙扩大,排列欠整齐,部分线粒体肿胀变形,视锥细胞核染色欠均匀,毛细血管基底膜厚度不均匀。结论：消朦灵对糖尿病大鼠视网膜中TNF-α、JAK/STAT信号通路有显著的调控作用,能有效防止糖尿病视网膜微血管病变,延缓糖尿病视网膜病变的进程。     

氟桂嗪对大鼠视网膜光化学损伤NO水平的影响

目的通过检测氟桂嗪对大鼠视网膜光损伤一氧化氮(nitric oxide,NO)水平的影响来探讨视网膜光损伤的发病机制及药物防护.方法40只S.D(Sprague Dawley)健康大鼠,体重200～220 g,随机分成对照组及实验组、对照组20只平均分配到光照前及光照后24h,6 d,10 d 4个时间点,实验组20只大鼠采取同样的分配方法.光照前12 h对照组大鼠耳缘静脉注入40%聚乙二醇,实验组大鼠耳缘静脉注入氟桂嗪20mg/kg(溶于40%聚乙二醇),光照开始前两组再次分别注入相同剂量的上述两种药物后光照开始,两组共30只大鼠经手术显微镜灯泡连续照射1 h,于光照前及光照后三个时间点急性处死大鼠进行视网膜NO含量的检测.结果对照组视网膜光损伤后NO水平在各时间点均较光照前增高,差异有显著性意义(t=13.17,12.21,11.98,均P＜0.01),实验组视网膜光损伤后各时间点亦较光照前增高,但增高缓慢,光照前24h及6 d差异有显著意义(t=7.03,10.74;均P＜0.01),10 d时差异亦有意义(t=2.90;P＜0.05),实验组与对照组比较,光照前两组差异无意义(t=0.58;P＞0.05),光照后两组间同一时间点比较实验组较对照组NO含量降低,差异有显著意义(t=8.13,5 76,8.88;均P＜0.01).结论氟桂嗪可抑制光化学损伤后NO含量的升高,这对视网膜的光化学损伤可能起到改善作用.     

内皮素(ET_1)对豚鼠视网膜组织cAMP、cGMP影响的初步观察

目的观察全身及视网膜局部血管中ＥＴ１的水平，与豚鼠视网膜微循环和代谢的平衡状态。方法应用放射免疫方法测定了２６例健康豚鼠静脉内注射ＥＴ１后１０，２０，４０和８０分钟以及７例正常对照豚鼠视网膜组织中ｃＡＭＰ和ｃＧＭＰ的含量。结果静脉注射ＥＴ１后１０分钟ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ和ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ值降低，２０分钟ｃＡＭＰ值下降为最低（Ｐ＜０．００１），４０分钟时ｃＧＭＰ值（Ｐ＜０．０５）和ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ比值（Ｐ＜０．０１）下降为最低点，ｃＡＭＰ值呈回升趋势（Ｐ＜０．０１），８０分钟时三者已增至对照组低限（Ｐ＞０．０５）。结论提示全身和视网膜局部血管中ＥＴ１的水平与豚鼠视网膜微循环及代谢的平衡状态有关，并参与视网膜组织细胞局部代谢的调控。     

微脉冲半导体激光照射对正常大鼠视网膜损伤的观察

目的观察810 nm微脉冲半导体激光照射对正常棕色挪威大鼠（BN 大鼠）视网膜的损伤。方法使用不同能量及负载系数（duty cycle, D C）的810 nm微脉冲半导体激光对130只BN大鼠眼进行照射。分别于激光照射后第1、3、7、1 4、28 d进行彩色眼底照相、荧光素眼底血管造影及组织病理学观察，并检测热休克蛋白(HSP-70)在视网膜的表达情况，用TdT介导dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检查细胞凋亡 。结果阈值及阈上能量条件下，低DC时激光照射部位无光学显微镜下的组织病理学改变，高DC时出现可累及视网膜内核层组织的严重损伤；微脉冲半导体激光照 射后1 d大鼠视网膜内核层细胞HSP-70阳性表达细胞即较正常视网膜明显增加，3 d时达到高峰，以后逐渐下降，14 d时恢复近正常水平。HSP-70阳性细胞数量 随激光能量提高而增加。TUNEL染色可见激光照射部位凋亡细胞主要存在于视网膜色素上皮（RPE）层、外核层、内核层，甚至脉络膜层，其数量随激光能量增高而增多。在激光照射后第3 d，凋亡细胞数量最多。结论810 nm微脉冲半导体激光照射后，视网膜损伤程度与激光能量及DC呈正相关。低能量高负载系数（50 mW，50％）或高能量低负载系数（100 mW，5％～15％）时，损伤限于RPE层，避免了神经上皮层的损伤。激光照射后HSP-70高表达及细胞凋亡可能在组织损伤修复过程发挥重要作用。 （中华眼底病杂志，2008，24：122-126）