多重荧光定量聚合酶链反应法检测肉制品中的3种食源性致病菌

摘要：目的 建立多重荧光定量聚合酶链反应法（quantitative polymerase chain reaction,qPCR）快速检测肉制品中沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7 3种食源性致病菌的方法。方法 根据沙门氏菌的invA基因、单增李斯特菌的hemolysin基因、大肠杆菌O157:H7的rfbE基因序列分别设计特异性引物及探针,通过优化反应体系,测定其灵敏度、特异性和重复性,建立了可同时检测上述3种食源性致病菌多重qPCR方法。结果 该方法只扩增3种靶细菌,对其他供试菌不扩增;沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7的检出限分别为101、102、102拷贝数/μL,并且拥有良好的重复性和特异性。人工污染的猪肉样品经SLE（Salmonella、Listeria monocytogenes and Escherichia coli 3种菌株的共增菌培养基）培养基富集8 h后,分别可以检测到初始菌液浓度为1.56×102 CFU/25 g的沙门氏菌,2.13×102 CFU/25 g的单增李斯特菌,2.32×102 CFU/25 g的大肠杆菌O157:H7。结论 所建立的多重qPCR灵敏度高、特异性强、重复性好,可同时检测肉制品中沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157:H7 3种食源性致病菌,在提高食品安全和保护人类健康方面有重要意义。     

利用EHEC琼脂平板从食物中分离检测产志贺毒素大肠杆菌

为利用肠出血性大肠杆菌(EnterohaemorrhagicEscherichiacoli,EHEC)琼脂平板,从食物中分离、检测产志贺毒素大肠杆菌(shigatoxin-producingEscherichiacoli,STEC),采用STEC毒力基因(hlyA基因)检测溶血素的产生,建立了一种利用EHEC琼脂平板快速、准确地从食物中分离、检测STEC的方法。该方法可检测STEC不同血清O157∶H7、O26、O111。     

基于酸处理的产志贺毒素大肠埃希菌选择性增菌方法研究

目的开发一套基于酸处理的产志贺毒素大肠埃希菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)选择性增菌方法,提高食品中STEC菌株的检出率。方法 选择12株不同血清型STEC菌株以及13株常见干扰菌,评价其对不同酸处理条件(pH2.0、2.5、3.0)的耐受性;考察筛选的酸处理条件对营养胁迫和冷冻胁迫状态STEC菌株生长活性的影响;比较研究酸水解酪蛋白、酵母提取物和丙酮酸钠等成分对胁迫状态STEC菌株的促生长作用,优化酸处理后中和/促生长培养基配方;比较增菌前与增菌后两种酸处理方式对STEC菌株分离效果的影响;最后通过人工污染样品,评价本研究建立的STEC酸处理选择性增菌方法的检测效果。结果 本研究建立了一种不依赖于抑菌成分的STEC选择性增菌方法,样品在增菌前经酸处理培养基室温处理2 h,降低背景杂菌干扰,再通过中和/促生长培养基(TSB-1.5%Tris-0.1%丙酮酸钠)进行目标菌的增菌培养;人工污染试验结果表明,本方法与我国现行GB4789.36-2016标准方法相比,能够有效减少背景杂菌的干扰、获得更高的STEC分离效率。结论 本研究建立的基于酸处理的STEC选择性增菌方法能够有效提高食品中STEC菌株的检测效率和检测准确性。     

前增菌抗生素添加对产志贺毒素大肠埃希氏菌分离的影响

目的 研究产志贺毒素大肠埃希氏菌（STEC）国际标准检测方法中前增菌肉汤中抗生素种类和浓度对STEC分离的影响。方法 利用STEC和其他非STEC菌株，对国际现行检测STEC标准方法推荐的在前增菌步骤使用3种抗生素的最低抑菌浓度（MICs）进行测定。结果 不同抗生素对STEC抑制存在差异性。在推荐浓度下，吖啶黄及头孢磺啶会抑制stx1a和stx2b亚型STEC的生长，新生霉素则会抑制stx1a、stx1c、stx1d、stx2b、stx2d、stx2e、stx2f、stx2g等亚型菌株的生长。此外，STEC与其他革兰氏阴性菌对吖啶黄、头孢磺啶、新生霉素的MICs无显著性差异（P<0.05）。而革兰氏阳性菌对这3种抗生素的MIC值显著低于革兰氏阴性菌（P<0.01）。结论 本文结果为STEC增菌方法的研发完善提供了有价值的证据。     

单增李斯特菌胶体金免疫层析试纸条的研制

以单增李斯特菌(LM)内化素A蛋白(InlA)单克隆抗体为基础,研制其胶体金免疫层析检测试纸条。方法 采用DNAStar软件对LM inlA全长基因编码蛋白进行抗原表位分析,截取部分inlA基因片段构建原核表达质粒,诱导表达和纯化获得重组蛋白。以该蛋白免疫BALB/c小鼠,筛选高效分泌抗InlA单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体;以双抗体夹心的原理研制胶体金免疫层析检测试纸条,并对其特异性、敏感性、稳定性进行评价。结果 筛选到2株高效分泌抗InlA单克隆抗体的杂交瘤细胞株,抗体属于IgG1亚类,小鼠腹水抗体效价为1∶64000;研制的试纸条可与LM发生阳性反应,而与非LM李斯特菌、链球菌、鼠伤寒沙门菌、大肠杆菌O157∶H7等食源性致病菌均不发生阳性反应;LM纯培养物敏感性为2.4×10^5cfu/ml,模拟猪肉样品敏感性为4.0×10⁶ cfu/ml;4℃保存期可达16周以上。结论 研制的胶体金免疫层析试纸条具有快速、特异、敏感等优点,可以用于样品中LM的快速检测。     

海产品中副溶血性弧菌免疫磁分离和环介导等温扩增快速检测方法的建立

采用纳米免疫磁珠分离副溶血性弧菌,建立副溶血性弧菌环介导等温扩增检测方法。方法 采用副溶血性弧菌单克隆抗体,制备纳米免疫磁珠,特异性吸附副溶血性弧菌,结合环介导等温扩增技术,建立副溶血性弧菌快速检测方法。结果 副溶血性弧菌纳米免疫磁珠在菌体浓度为10³cfu/ml水平时,对副溶血性弧菌的捕获率达到74%。免疫磁分离结合环介导等温扩增技术,在纯培养、无需增菌情况下,检测灵敏度达到140cfu/ml增菌液;通过对134株副溶血性弧菌和74株非目标菌的测试,环介导等温扩增技术具有良好的特异性;食品基质添加试验中,在增菌时间缩短至8h的条件下,其检测限为2cfu/25g样品。结论 副溶血性弧菌免疫纳米磁珠结合环介导等温扩增技术,有效缩短了增菌时间,适用于副溶血性弧菌的快速检测。     

多重PCR法检测产志贺毒素性大肠杆菌的 4个血清型

目的建立多重PCR法检测产志贺毒素性大肠杆菌(shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC)主要血清型O26、O145、O45和O121的分析方法。方法根据GenBank登录序列,设计扩增O抗原翻转酶(wzx)基因的引物,建立PCR方法,并以STECO26、O145、O45和O121基因组为模板,检验多重PCR的灵敏度和特异性。使用建立的PCR,检测牛胴体表面拭子,阳性扩增条带送测序,以验证PCR扩增的可靠性。同时将阳性扩增样品,涂布显色平板,分离靶标血清型细菌。结果本研究成功建立STEC O26、O145、O45和O121的多重PCR方法, PCR循环参数中退火温度为60℃,扩增片段分别为249、353、890和587 bp。多重PCR直接检测O26、O145、O45和O121时,最低检测限介于10~3～10~4 CFU/mL,而增菌后再检测,最低检测限均为1CFU/m L。多重PCR用于其他血清型STEC,和非大肠杆菌扩增时,均未扩增出目的条带,只有O26、O145、O45和O121能够扩增出相应条带。当使用多重PCR直接检测胴体擦拭子时,阳性率为5.45%(3/55),主要为O26、O145血清型;增菌后检测阳性率为7.27%(4/55),主要为O26、O145和O121血清型。阳性PCR扩增样品,成功分离到O26两株、O145和O121各一株。分离菌株具有典型大肠杆菌的生化特性,携带STEC代表性毒力因子志贺毒素和紧密素,且具有多重耐药性。结论以STECO26、O145、O45和O121的wzx基因为检测靶标,成功建立多重PCR方法,灵敏度和特异性良好,与细菌分离联合使用,可减少工作量,精准分离目的病原菌。     

成都周边某奶牛养殖场及市售生鲜牛肉中产志贺毒素大肠埃希菌监测与分析

目的 通过连续3年监测成都周边某奶牛养殖场犊牛和成年牛粪便、饲养环境及菜市场和超市生鲜牛肉中的产志贺毒素大肠埃希菌（STEC）,了解本地区牛及牛肉中STEC菌株的携带及菌株特征情况,为评估该地区STEC污染状况、感染风险及防控策略提供科学依据。方法 采用荧光定量PCR法分离鉴定STEC,采用微量肉汤稀释法进行药敏试验。分离株全基因组测序后在EnteroBase数据库上获得MLST型别、菌株类型、血清型、毒力基因信息,使用Abricate软件比对得到stx亚型信息。用BioNumerics 7.6软件进行cgMLST聚类分析。结果 2019—2021年共采集奶牛养殖场牛粪和环境样品247份,25份检出STEC,检出率10.12%;采集生鲜牛肉294份,32份检出STEC,检出率10.88%;共分离到57株STEC。检出STEC菌株对氨苄西林耐药率最高,达42.11%（24/57）,其次为头孢噻肟和头孢唑啉（均占比38.60%,22/57）。多重耐药株占35.09%（20/57）。57株STEC共分离出30种血清型,其中可引起暴发的血清型有：O26：H11、O103：H25、O145：H12。通过毒力基因分析发现具有致病风险的亚型有：stx2a、stx2c、stx2d、stx2e、stx2g以及stx2k;及与疾病的严重程度密切相关eae-STEC及STEC/ETEC杂合株。结论 2019—2021年奶牛养殖场牛粪便和菜市场生鲜牛肉中STEC的污染持续存在。犊牛粪便检出率（21.43%）高于成年牛粪便检出率（0.91%）。菜市场生鲜牛肉STEC检出率高于超市。牛粪便中分离菌株比牛肉中分离菌株耐药情况严重。部分分离菌株因携带强毒力基因或其他致病相关基因而具有更强致病性。     

基于免疫磁分离的7种产志贺毒素大肠埃希氏菌快速检测方法的评价

目的 研究基于免疫磁分离的七种产志贺毒素大肠埃希氏菌快速检测方法的灵敏度与特异性。方法 将大肠埃希氏菌O157：H7和大肠埃希氏菌O103不同稀释度的菌悬液,用免疫磁珠富集后,检测其携带毒力基因stx1、stx2 和黏附基因eae以及O157:H7和O103的抗原基因。同时,对菌悬液进行活菌计数,进行灵敏度研究。对8株携带stx1、stx2、eae基因的目标菌菌悬液,以及25株非目标菌的标准菌株及分离菌株的菌悬液,用免疫磁珠富集后,检测其携带毒力基因stx1、stx2 和黏附基因eae以及抗原基因,进行特异性研究。结果 本方法检测大肠埃希氏菌O157：H7的stx1、stx2、eae以及抗原基因的灵敏度为10_²CFU/mL,检测大肠埃希氏菌O103抗原基因的灵敏度为10_³CFU/mL. 8株目标菌检测结果与其携带的基因一致,没有假阴性,包容性达到100%。25株目标菌检测结果与其携带的基因一致,未发现有假阳性,排他性达到100%。结论 方法具有良好的灵敏性及特异性,适用于食品中七种产志贺毒素大肠埃希氏菌的快速检测。     

食品中大肠杆菌O157:H7的几种检测方法的比较

目的评估平板分离培养法、免疫磁珠分离(IMS)法、VIDAS全自动酶标免疫测试系统、BAX全自动病原菌检测系统及环介导等温扩增(LAMP)技术在食品中检验肠出血型大肠埃希菌O157∶H7的特异性、敏感性。方法使用平板分离培养法、免疫磁珠分离法、VIDAS法、BAX法及LAMP法对人工制备的染菌猪肉样本进行检测,并对这几种方法进行比较。结果 BAX法和LAMP法的检出率最高,分别是89.1%和85.9%,免疫磁珠法和VIDAS法检出率次之,分别是75.0%和78.1%,传统分离培养法为43.8%。结论 BAX法和LAMP法具有快速、高效、特异性好、敏感性高的特点,可快速筛选食品中可能存在的肠出血型大肠埃希菌O157∶H7。     

双抗夹心ELISA检测食品中大肠杆菌O157:H7方法研究

研究获得纯化抗大肠杆菌O157:H7IgY抗体,经检测10mg/ml纯化IgY抗体的效价为1:320;以大肠杆菌O157:H7免疫新西兰大耳白兔,获得兔抗大肠杆菌O157:H7IgG抗体,效价达1:25600。以兔抗大肠杆菌O157:H7IgG抗体稀释3200倍作为捕获抗体,抗大肠杆菌O157:H7IgY抗体为检测抗体建立双抗夹心ELISA方法检测大肠杆菌O157:H7,正交试验分析表明,捕获抗体于37℃包被2h、不封闭、抗原与捕获抗体于37℃结合2h、检测抗体浓度为0.25mg/ml、与抗原于37℃结合1h为最优反应条件。该方法对纯培养菌液检出限为105CFU/ml,具有良好的敏感性及特异性。染菌样品经在EC增菌液中选择性培养后进行双抗夹心ELISA检测,接种量为0.1～1CFU/g(ml)的样品在培养12h后可检出阳性反应,1～10CFU/g(ml)的样品在培养8h后可检出阳性反应。     

大肠杆菌O157:H7快速增菌培养基检测效果的研究

为了验证对于大肠杆菌O157:H7菌株特异性、复苏效果以及快速生长的特点,比较了3种培养基对于大肠杆菌O157:H7的增菌效果。研究结果表明,8h培养时间内,MicroFast~?快速增菌培养基对于冷损伤和热损伤的大肠杆菌O157:H7菌株具有良好的修复和增殖效果。MicroFast~?快速增菌培养基营养组分适合O157菌株的生长需求,在MicroFast~?快速增菌培养基中,大肠杆菌O157:H7菌株的倍增时间为13.5min,远高于m EC+n的28min,且MicroFast~?快速增菌培养基能够完全抑制部分G+细菌以及部分G-细菌的干扰,对于大肠杆菌O157:H7具有特异性的选择。故MicroFast~?快速增菌培养基对于大肠杆菌O157:H7菌株具有良好的选择特异性,能够短时间内(8h内)有效富集培养大肠杆菌O157:H7菌株,是一种能够实现大肠杆菌O157:H7菌株快速高效、特异增殖的培养基,将其结合检测金标卡,能够实现8h内快速检测,结果可信可靠。     

TaqMan多重实时定量PCR快速检测3种常见食源性病原菌

建立一种可同时快速检测大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌的多重实时定量PCR(qPCR)方法。依据大肠杆菌O157:H7 tir基因、单增李斯特菌mpl基因和蜡样芽孢杆菌entFM基因的保守序列分别设计特异性引物和TaqMan探针,建立多重qPCR反应体系,进行灵敏度、特异性和稳定性试验,同步检测人工染菌牛奶样品中的病原菌并与国家标准方法作对比。结果表明,建立的多重qPCR方法灵敏度高,最低检出限为12 CFU/mL;特异性强,只对3种目标菌进行PCR扩增;稳定性好,各重复性试验中Ct值的变异系数<1%;所有受污染样品阳性检出率均为100%,与国家标准方法检测结果一致,且检测周期缩短至6 h。本研究建立的TaqMan多重qPCR方法能同时快速、准确地检测乳品中的大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌,为食品安全提供技术支撑。     

基于噬菌体特异性的新型荧光酶联方法检测食品中大肠埃希菌O157∶H7

目的对一种基于噬菌体特异性的检测食品中大肠埃希菌O157∶H7的新型荧光酶联方法(VIDASECPT)进行了评价。方法利用VIDASECPT、VIDASECO、BAXO157三种快速方法检测不同浓度大肠埃希菌O157∶H7标准菌株的生理盐水悬浮液,并对VIDASECPT和常规培养法检测食品中大肠埃希菌O157∶H7进行了比对。结果 VIDASECPT检测大肠埃希菌O157∶H7的检出限为104 CFU/ml,并且不受大肠埃希菌背景菌的干扰,其他两种快速方法的检出限均为105 CFU/ml,其中VIDASECO易受到背景菌的干扰;检测不同食品基质中大肠埃希菌O157∶H7,当大肠埃希菌O157∶H7的浓度为104 CFU/ml时,VIDASECPT与常规培养法无统计学差异。结论 VIDASECPT方法检测大肠埃希菌O157∶H7具有快速、灵敏、抗干扰性强的特点。     

基于内参的大肠埃希氏菌O157∶H7实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

针对大肠埃希氏菌O157∶H7 rfbE和Flic靶基因保守序列,设计特异性引物和探针,优化反应体系,并加入内参（internal amplification control,IAC）,建立能够实时监控反应过程的荧光定量聚合酶链式反应（polymeasechain reaction,PCR）检测方法。结果表明,该方法对E. coli O157∶H7基因组DNA的最低检测限为1 pg/μL;对含有靶基因质粒的最低检测限为103 copies/μL;对细菌的最低检测限为5×103 CFM/mL;Ct值与模板拷贝数均呈良好的线性关系（R2=0.999）。人工污染实验结果表明,在初始菌量为7 CFM/25 g时,采用水洗加试剂盒法提取DNA,E. coli O157∶H7在增菌6 h后即可检出;而采用水煮法提取DNA,则在增菌10 h后方可检出。建立的E. coli O157∶H7实时荧光定量PCR方法,既能有效检测食品中O157∶H7,又能实时监测PCR反应过程,有效防止“假阴性”的发生。     

IMSA技术快速检测肠出血大肠杆菌O157:H7方法的建立及应用

为了建立和评价一种适合食药监及基层检验部门使用的肠出血性大肠杆菌O157:H7快速检测方法,针对肠出血性大肠杆菌O157:H7特异性rfbE 基因,应用等温多自配引发扩增技术（Isothermal Multiple Self-matching-initiated Amplification,IMSA）,设计引物进行检测。对建立的方法进行特异性试验和灵敏度试验,与荧光定量PCR法进行比对;利用建立的IMSA法确定人工污染样本被检出的最短增菌时间和最低检测灵敏度;使用IMSA法和国标法对24份不同肉制品进行检验,评估两者的一致性。结果表明:该方法仅对肠出血性大肠杆菌O157:H7特异性扩增;IMSA法的灵敏度比qPCR法高,达8.9×102 CFU/mL;人工污染菌种样本最短增菌10 h可以被建立的IMSA法检出,检出限为9.1 CFU/25 g;24份肉制品样本的IMSA法与常规培养法结果一致性为100%。结论: IMSA技术检测肠出血性大肠杆菌O157:H7具有特异性强、灵敏度高、结果快速准确的特点,可在11 h内完成食品中O157:H7的检出,适用于食药监及基层检验部门进行肠出血性大肠杆菌O157:H7的快速检测。     

单核细胞增生李斯特菌特异性单链抗体磁珠的制备与评价

目的:制备一种单核细胞增生李斯特菌的特异性单链抗体捕获磁珠(scFv-IMBs),通过用人工污染的方式评价scFvIMBs的效果。方法:在不同的增菌培养体系中以市售磁珠(Dyna-IMBs)作为对照,通过定性、定量培养技术和PCR检测技术,分析scFv-IMBs在法兰克福香肠中捕获与分离单核细胞增生李斯特菌和英诺克李斯特菌的能力。结果:在BHI培养基中,scFv-IMBs对单核细胞增生李斯特菌的捕获率介于15%～55%之间,优于Dyna-IMBs(0.85%～1.27%),显示出良好的特异性。在MOPS-BLEB培养基中两种磁珠的捕获率在62%～88%,捕获率高于在UVM培养基(5%)和FB培养基(53%)中。人工污染样品经scFv-IMBs捕获,单核细胞增生李斯特菌的菌落数在选择性培养基上的比例有显著性提升(P0.01),可从高浓度英诺克李斯特菌(1∶1 000)中有效分离单核细胞增生李斯特菌。磁珠检测方法的灵敏度可达1 CFU/mL。结论:与市售免疫磁珠产品相比,scFv-IMBs具有较好的特异性,可显著降低体系中英诺克李斯特菌的干扰,具有更好的分离能力。     

基于实时荧光聚合酶链式反应快速检测食源性大肠埃希氏菌O157:H7

目的 建立一种快速、灵敏、特异、高效的食源性大肠埃希氏菌O157:H7型实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)检测方法。方法 针对大肠埃希氏菌O157:H7型的O抗原特异基因rfbE保守区域设计特异性引物和探针, 合成基因片段绘制标准曲线, 在菌液基因组DNA和质粒双层面调试优化以完成方法的初步建立。其后, 对该方法的特异性、敏感性、重复性等进行全面的质量评估验证。结果 该方法特异性100%; 基因组DNA检测敏感性为7.11×102 fg/μL; 纯培养物水平检测敏感性为1.0×102 CFU/mL; 重复性变异系数在0.10%~1.00%之间; 标准曲线相关系数r2为0.9994。结论 成功建立了一种性能良好的大肠埃希氏菌O157:H7型实时荧光探针PCR快速检测方法, 该方法具有灵敏度高、特异性强、扩增时间短, 仅为35 min的特点, 可用于疑似大肠埃希氏菌O157:H7型污染样品的快速诊断检测。     

食品中大肠杆菌O157∶H7疑似菌株的分离和鉴定研究

采集117份食品样品,经过PCR扩增毒力基因stx1、stx2和O157特征基因rfbO157初筛。将部分PCR阳性的食品样品,经过新生霉素EC增菌液增菌、免疫磁珠富集、血清学鉴定、菌落PCR复筛,分离出5株O157:H7疑似菌株。其中1株O157∶H7疑似菌株EC5.11不能与O157诊断血清产生良好凝集反应,采用血清学方法该菌容易漏筛。采用PCR扩增rfbO157基因和H7鞭毛抗原编码基因fliCH7,EC5.11均呈阳性反应。最终包括EC5.11在内的4株疑似菌株被证实为O157∶H7血清型。本研究提出了一种改良方法筛选、鉴定食品中O157∶H7疑似菌株,比起传统方法,减少工作量的同时提高了筛选的特异性。     

纳米免疫磁分离-实时荧光聚合酶链式反应快速检测海产品中副溶血性弧菌

采用副溶血性弧菌单克隆抗体、纳米免疫磁分离技术,结合实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测方法,建立海产品中副溶血性弧菌纳米免疫磁分离-实时荧光PCR检测方法。副溶血性弧菌纳米免疫磁珠在菌体浓度为103 CFU/mL水平时,对副溶血性弧菌的捕获率达到74%。在纯培养、无需增菌情况下,该方法检测灵敏度达到140 CFU/mL;通过134 株副溶血性弧菌和74 株非目标菌的测试,实时荧光PCR技术具有良好的特异性;在食品基质添加实验中,其检测限为2 CFU/25 g样品,增菌时间缩短到8 h。