结核分枝杆菌抗原Rv1258c、Rv1410c及Rv3425的HLA限制性CTL表位预测

目的:预测结核分枝杆菌(MTB)相关抗原Rv1258c、Rv1410c及Rv3425的HLA限制性细胞毒性T细胞(CTL)表位.方法:通过NCBI数据库获取各蛋白的氨基酸序列,利用BLAST分析其与人类蛋白质的同源性,利用SYFPEITHI、BIMAS和NetCTL数据库预测分析MTB相关抗原的HLA-A2与HLA-A...     

儿童结核病结核分枝杆菌临床分离株中esxA、fbpB、Rv2660c基因多态性研究

目的 对抗原编码基因esxA、fbpB、Rv2660c进行测序,了解esxA、fbpB、Rv2660c的基因多态性.方法 选取135株结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)临床分离株,运用PCR方法扩增目的基因esxA、fbpB、Rv2660c并进行测序,与结核标准株H37 Rv基因序列以及从免疫表位数据库(immune epitope database,IEDB)中查询到的表位序列进行对比,分析esxA、fbpB、Rv2660c基因序列中的变异特征.结果 在135株菌株中,esxA、Rv2660c序列暂未发现基因变异.fbpB共66株(48.89％)发现了基因变异,5个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点共造成8个(14.81％)T细胞抗原表位以及9个(24.32％)B细胞抗原表位序列的多态性.fbpB基因的dN值为0.000 120,dS为0.002 126,其中T细胞表位区与非T细胞表位区的dN值分别为0.000 067和0.000 408,dS分别为0.002 382和0.000 470,B细胞表位区dN和dS值分别为0.000 063和0.002 380,非B细胞表位区dN和dS均为0.结论 esxA、Rv2660c基因序列较保守,fbpB存在基因多态性,预测会对蛋白Ag85B的免疫功能造成影响,从而影响H56的免疫有效性.     

结核分枝杆菌Rv3432c蛋白的原核表达与生物信息学分析

目的 构建结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)Rv3432c基因的原核表达质粒并进行体外表达,运用生物学信息学软件分析蛋白Rv3432c特征,探讨抗M.tb新型药物靶点。方法 以灭活的结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR法扩增Rv3432c基因,并与表达载体pET-28a构建原核表达重组质粒。SDS-PAGE分析表达产物并利用亲和层析的方法进行纯化。采用Protparam、Pfam online tool、SOMPA、Protscale、TMHMM、Signalp 6.0、NetPhos3.1、SUMOsp 2.0、SWISS-MODEL等生物信息学软件分析蛋白Rv3432c的生物学特性。结果 pET-28a-Rv3432c重组质粒测序结果与目的基因完全一致;SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白以可溶性蛋白形式存在,相对分子质量约为55×10³,与预期大小相符。蛋白Rv3432c为亲水性蛋白(GRAVY值为-0.079)。蛋白Rv3432c为无跨膜结构域和信号肽的蛋白。Rv3432c二级结构主要由无规则卷...     

结核分枝杆菌蛋白抗原T细胞表位的研究进展

结核分枝杆菌(Mtb)的蛋白抗原根据所处细胞位置的不同,可分为分泌性蛋白、胞质内蛋白和膜脂蛋白三类。其中Mtb分泌性蛋白对抗结核菌感染的免疫作用最为重要。     

结核分枝杆菌Rv0901基因原核表达质粒的构建及其表达

目的　为研究结核分枝杆菌基因Rv0 90 1的功能提供材料。方法　PCR扩增Rv0 90 1基因编码序列 ,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pGEX 1λT获得重组表达质粒 ,转化大肠杆菌后用IPTG进行诱导表达 ,通过SDS PAGE、GST 纯化试剂盒鉴定并纯化表达产物。结果　从结核杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Rv0 90 1基因 ;成功构建了融合表达质粒pGEX Rv0 90 1;重组质粒经IPTG诱导后能在大肠杆菌中稳定表达 4 5kDa的GST Rv0 90 1融合蛋白。结论　本实验成功表达并纯化GST Rv0 90 1融合蛋白 ,为Rv0 90 1基因功能的研究打下了基础。     

结核分枝杆菌H37Rv株Rv1494和Rv1495 假想蛋白基因的克隆表达

目的 为探索参与调控结核分枝杆菌(MTB)持续性感染的相关分子,对MTB H37Rv株编码Rv1494、Rv1495假想蛋白基因进行克隆、表达及Western blotting鉴定.方法 采用Bioedit、Dnaman软件及Pfam数据库对MTB H37Rv株Rv1494、Rv1495基因编码蛋白质的氨基酸组分、蛋白模块以及其与大肠杆菌E.coli的mazEF蛋白家族的同源性进行分析.以H37Rv株基因组为模板,分别对Rv1494、Rv1495基因进行克隆,构建pET32a( )原核表达质粒,转化BL21宿主菌.重组蛋白经SDS-PAGE电泳分离纯化和Western blotting鉴定.结果 生物信息学分析提示,Rv1494基因、Rv1495基因编码的蛋白质分别与大肠杆菌E.coli染色体编码的mazEF家族中的抗毒素和毒素具有一定程度的同源性,分别为26%和29.75%;经测序表明原核表达重组质粒构建成功.负载重组质粒的BL21菌经IPTG诱导后可表达出分子大小与预期值相一致的融合蛋白,表达量均可达到菌体总蛋白的60%.重组蛋白经Western blotting检测出特异性阳性信号.结论 首次对MTB H37Rv株编码Rv1494、Rv1495假想蛋白基因进行克隆表达,为进一步探讨该基因在参与调控MTB持续性感染过程中的功能奠定基础.     

结核分枝杆菌特异性分泌蛋白的原核表达、纯化和免疫原性分析

目的 构建结核分枝杆菌rv1837c、rv3803c基因原核表达重组质粒,进行表达、纯化,并分析其免疫原性.方法 PCR扩增结核分枝杆菌H37Rv rv1837c、rv3803c基因,并克隆入pTA2质粒.测序正确后,再亚克隆入pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):rv1837c、pET30a(+):rv3803c重组体.然后转化入表达宿主大肠杆菌B121(DE3),经0.4 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导;分别与组氨酸标签单克隆抗体及结核患者血清进行Western blot,鉴定Rv1837c、Rv3803c重组蛋白.经镍离子螫和氮川乙酸-组氨酸标签亲和树脂纯化,将纯化的重组蛋白分别免疫家兔,取兔血清与纯化蛋白通过Western blot方法,检测家兔血清中的抗体.结果 pET30a(+):rv1837c、pET30a(+):rv3803c重组体表达相对分子质量为92000及38 000的重组蛋白,表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中,表达量分别占全菌蛋白质的30%及50%.获得纯度为90%的重组蛋白.纯化蛋白通过Western blot鉴定证实为目的 蛋白,有较强的免疫原性.结论 成功构建原核表达重组质粒pET30a(+):rv1837c、pET30a(+):rv3803c,并获得Rv1837c及Rv3803c重组蛋白,为血清学诊断活动性结核病奠定了基础.     

结核分枝杆菌蛋白Rv0315的克隆表达及其抗原性研究

目的评价结核分枝杆菌重组蛋白Rv0315在结核病血清学诊断中的价值。方法采用常规分子克隆方法获得重组Rv0315蛋白,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测84份确诊结核病人血清和48份健康人血清中相应的抗结核抗体水平,并与结核分泌蛋白ESAT-6的检测结果进行比较。结果成功构建了重组蛋白Rv0315,其在E.coli BL21plysS（DE3）中主要以可溶性形式表达,分子量（30.3kDa）与预期相符,ELISA血清学活性评估显示其特异性和敏感性分别为94.0%（45/48）和35.7%（30/84）。结论重组蛋白Rv0315有望成为新的结核病血清学诊断候选抗原。     

结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达载体.方法:PCR扩增Rv2389基因,测序正确后克隆入真核表达载体pCDNA3.1(-),重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染CHO细胞后, 分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达.结果:构建了重组质粒pCDNA- Rv2389, RT-PCR结果证明Rv2389可在CHO细胞中转录,间接免疫荧光检测证明,表达有Rv2389蛋白的细胞着染.结论:成功构建了结核分枝杆菌Rv2389基因的真核表达载体pCDNA-Rv2389,Rv2389基因可以在CHO细胞中表达.     

结核分枝杆菌RD12区T细胞表位分布情况预测及分析

目的预测并分析结核分枝杆菌（MTB）RD12区4个抗原的CD4^＋T和CD8^＋T细胞表位分布情况。方法在NCBI数据库上查询并获得各个抗原的氨基酸序列,用Blast分析其与MTB复合群及人类蛋白的同源性。利用SYFPEITHI、NETCTL、BIMAS和NetMHC数据库预测并分析MTB的RDl2区抗原CD8^＋T细胞表位的分布情况;利用NetMHC数据库预测并分析MTB的RD12区抗原的CD4^＋T细胞表位的分布情况。然后,综合CD4与CD8表位预测,筛选出优势表位肽段。结果通过预测与分析,初步筛选出MTB的RD12区4个抗原的CD8^＋T细胞候选表位16个;CD4^＋T细胞的强结合候选表位234个,弱结合候选表位505个,综合CD4与CD8表位预测并分析,最终筛选出13个优势表位肽段。结论预测出来的T细胞候选表位将为结核病的特异性诊断及新的抗结核多表位疫苗的研究奠定基础。     

结核分枝杆菌低氧反应蛋白HRP1（Rv2626c）的分泌致病机制初探

  目的  验证结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）基因Rv2626c编码的低氧反应蛋白1（hypoxic response protein 1, HRP1）为分泌蛋白。  方法  从Mtb H37Rv标准毒力株基因组上扩增目的基因并添加His标签;运用扩增产物构建重组质粒,电转入耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis, Ms）（MC2 155）构建重组菌;热诱导重组菌表达蛋白,检测培养滤液及细菌裂解液中蛋白的表达情况,将10 kDa培养滤液抗原（CFP-10）（Ms）和CFP-10（Mtb）设为阳性对照,将胞质蛋白热休克蛋白65（GroEL2）（Mtb）作为阴性对照。  结果  PCR成功扩增 HRP1 、GroEL2（Mtb）、CFP-10（Mtb）、CFP-10（Ms）,并且重组质粒测序峰单一且信号稳定,鉴定重组质粒构建成功。成功构建重组Ms并实现蛋白GroEL2（Mtb）、CFP-10（Mtb）、CFP-10（Ms）、HRP1在Ms中的表达。在重组菌裂解液中和培养基滤液中均检测到目标蛋白HRP1;结果与阳性对照CFP-10一致;阴性对照GroEL2（Mtb）仅在细菌裂解液中检测到,在培养滤液在未检测到。  结论  Mtb基因Rv2626c编码的蛋白HRP1可以通过Ms的分泌系统分泌到细菌外,作为Mtb分泌蛋白,在Mtb致病机制中发挥作用。     

结核分枝杆菌 Rv0757基因的原核表达及其编码蛋白对巨噬细胞功能的影响

目的构建结核杆菌Rv0757基因原核表达重组质粒pET28a-Rv0757,并研究表达的目标蛋白对小鼠骨髓巨噬细胞株ANA-1细胞的作用。方法将扩增出的Rv0757基因重组到原核表达质粒pET28a(+),并通过SDS-PAGE和Western blot鉴定诱导表达的目的蛋白。纯化目标蛋白后将目标蛋白PhoP作用于小鼠ANA-1细胞,检测活细胞数、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、一氧化氮(NO)和细胞凋亡指标。结果成功构建出pET28a-Rv0757原核表达质粒,诱导表达的目标蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定分析,其相对分子质量约为32×103。目的蛋白作用于小鼠ANA-1细胞后对活细胞数和细胞上清LDH活力无明显影响,但可以明显抑制细胞释放NO和细胞凋亡。结论本研究成功构建了原核表达载体pET28a-Rv0757,并成功表达出目标蛋白,该蛋白对小鼠ANA-1细胞没有毒性损伤,但可以抑制细胞释放NO和细胞的凋亡。     

GST-LMO1融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

 目的构建GST-LMO1 融合蛋白表达载体,并在原核细胞大肠埃希菌（Ecoli ）中诱导表达。方法以人胎脑文库为模板,用PCR方法法扩增出LMO1基因全长及各个截短突变体,通过BamH Ⅰ和EcoRⅠ酶切位点分别将其定向插入pGEX-5X-2载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X-2-LMO1及其截短突变体,通过酶切电泳鉴定和DNA 序列测定正确后,转入Ecoli BL21中,经异丙基硫代茁-D 半乳糖苷诱导表达,SDS-PAGE 和Western blot 鉴定。结果酶切电泳及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒pGEX-5X-2-LMO1及其截短突变体,并用Western blot 方法证实了GST-LMO1 全长及各个截短突变体融合蛋白的表达。结论成功构建了LMO1 全长及其截短突变体原核表达载体,并证实了其在原核细胞大肠埃希菌中的表达,为LMO1 结构与功能的研究提供了前提基础。     

GST-SRY融合蛋白原核表达和纯化

目的 构建GST-SRY融合蛋白原核表达载体, 在E.coli中诱导其表达, 并进行纯化.方法 PCR扩增SRY基因, 将SRY基因插入原核表达载体p GEX-6P-1, 经酶切和测序验证后, p GEX-6p-1-SRY转化到原核表达菌株E.coli Rosetta DE3, IPTG诱导表达GST-SRY融合蛋白, 用GST标签纯化树脂对其进行纯化.结果 经双酶切和测序证实p GEX-6P-1-SRY构建正确.重组质粒转化到Rosetta DE3经IPTG诱导后表达了分子质量单位约为49 KD的重组蛋白.结论 p GEX-6P-1-SRY原核表达载体构建成功, SRY蛋白成功诱导表达并纯化, 为今后深入研究SRY蛋白的功能奠定了实验基础.     

结核分枝杆菌复合体VNTR位点多态性与菌株MALDI-TOF MS蛋白谱差异的关系

  目的  研究结核分枝杆菌复合体(Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC)数目可变串联重复序列(variable number tandem repeat, VNTR)重复单位拷贝数与菌株蛋白质谱差异的关系。  方法  采用多位点数目可变串联重复序列分析(multiple locus variable number tandem repeat analysis, MLVA)对MTBC进行基因分型。同时,利用基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser-desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)对菌株的蛋白质谱进行主成分分析(principal components analysis,PCA),分析VNTR位点重复单位拷贝数差异(多态性)与菌株PCA聚类的关系。  结果  共收集157株MTBC菌株。146株MTBC(质谱鉴定得分≥1.700)生成的PCA树状图分为3个群,分别为Ⅰ群(61株)、Ⅱ群(26株)和Ⅲ群(59株)。24个VNTR位点多态性存在差异,其中7个高、7个中等和10个低多态性。MTBC菌株的Mtub39、QUB26、QUB4156位点多态性与菌株MALDI-TOF MS聚类有关(P=0.000,P=0.035,P=0.017)。  结论  MTBC菌株的Mtub39、QUB26、QUB4156位点多态性与菌株蛋白质谱的差异有关,3个位点可能具有调控菌株蛋白质谱构成的作用。     

结核分枝杆菌higBA基因对细菌应激反应及胞内感染免疫机制的研究

  目的  探究结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）higBA基因对细菌应激反应及胞内感染免疫的作用。  方法  从Mtb H37Rv基因组上扩增获得目的基因,与载体连接后电转化入耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis, Ms）构建重组菌,对空载菌 Ms_vec和重组菌 Ms_higBA进行应激实验和Raw264.7小鼠巨噬细胞感染实验,检测细菌菌落形成单位（CFU）和细胞因子白介素（interleukin, IL）-1β、IL-6、IL-10、IL-12p40,干扰素（interferon, IFN）-γ,肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）-α和诱导型一氧化氮合酶（inductible nitric oxide synthase, iNOS ）的转录水平变化。  结果  成功构建Ms_higBA重组菌。应激实验结果表明higBA确能提高细菌在体外培养特定条件下的生存能力。胞内感染实验证明higBA能提高细菌在巨噬细胞内存活能力,影响细胞因子的转录水平。  结论  Mtb的higBA基因在细菌应激反应和胞内感染免疫中发挥了作用。     

婴儿利什曼原虫Pepck和Gp63优势表位的真核与原核重组载体的构建与表达

目的 选取婴儿利什曼原虫的Pepck和Gp63的优势表位基因,构建Pepck-Gp63二联优势表位的原核与真核重组表达载体并表达蛋白.方法 用计算机分析预测磷酸烯醇丙酮酸羧基酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPCK)的二级结构及HLA表位,筛选出优势表位.根据本实验室之前对表面蛋白...     

分子生物学方法在结核分枝杆菌及其耐药性检测中的价值

目的探讨分子生物学方法在结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）及其耐药性检测中的价值。方法以MTB标准菌株H37Rν作为对照,以单耐药及耐多药的MTB行梯度浓度稀释后作为检测样本,分析Xpert MTB/RIF法、基因芯片法、改良罗氏培养法、比例法检测MTB的准确性、最低检出限及检测周期等。结果改良罗氏培养法和Xpert MTB/RIF法检测MTB下限均为3×102 cfu/mL,基因芯片法检出下限为3×104 cfu/mL;Xpert MTB/RIF法在3×102 cfu/mL时检测利福平耐药性存在假阳性现象,无法检测异烟肼的耐药性;Xpert MTB/RIF法检测周期≤2 h,而基因芯片法≤8 h,比例法和改良罗氏培养法检测周期在5~8周。结论在MTB及其耐药性检测中分子生物学方法的检测周期优势明显,在最低检出限和准确性方面各有优势,因此,临床诊断中综合考虑病人的经济水平和病情危重程度,选择合适的检测方法。     

Ag85A-HA2原核表达载体的构建及其抗甲型流感病毒免疫效果的研究

目的 构建结核杆菌分泌型抗原85A（Ag85A)与流感病毒血凝素（HA）中HA2（Ag85A-HA2）原核表达载体,并表达融合蛋白,研究其抗流感病毒的免疫保护效果。方法 构建Ag85A-HA2原核表达载体pET-32a(+)/Ag85A-HA2;异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达Ag85A-HA2融合蛋白,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析表达产物,并使用吸附多聚组氨酸标签（His-Tag）的蛋白纯化柱分离纯化蛋白;甲型流感病毒（influenza A virus,IAV）攻击重组蛋白免疫后的BALB/c小鼠（并设PBS对照组）,通过观察小鼠肺病理切片、测定肺指数及肺指数抑制率、死亡保护率等指标分析其免疫保护效果。结果 成功构建了原核表达载体pET-32a(+)/Ag85A-HA2;SDS-PAGE电泳分析显示成功表达相对分子质量为70×103的重组融合蛋白;动物实验表明,融合蛋白Ag85A-HA2对IAV攻击后的小鼠肺指数抑制率达到39.30%,死亡保护率达到80%,效果明显高于PBS对照组（P<0.05）,肺部病理切片也证实融合蛋白Ag85A-HA2对小鼠肺部的保护效果显著。结论 成功构建了Ag85A-HA2原核表达载体并表达出融合蛋白,该融合蛋白在动物体内能发挥良好的抗甲型流感病毒感染的免疫保护效果。