提高bFGF基因表达水平的策略及其表达产生的纯化工艺

目的：通过在同一个表达载体pLX1上调整SD序列和ATG之间距离,以提高bFGF目的蛋白表达量。方法：以Klenow和MungBean Nuclease通过增加2个及减少2个碱基调整SD序列和ATG之间距离,SDS－PAGE和Western blot检测目的蛋白表达量,以高压液相疏水层析、凝胶过滤及肝素亲和层析纯化目的蛋白、MTT法进行活性测定。结果：获得了重组质粒pLX2,pLX3,诱导后与表达质粒pLX1(7.78%)相比,表达量分别为8．03％,9．9％,经纯化后获得的bFGF纯度达98％,ED50为2．29ng/ml。结论：调整SD序列和ATG之间距离可以增加目的基因的剂量,从而提高了目的的基因在大肠杆菌中的表达水平。     

Hpa和bFGF在口腔鳞癌中的表达及其意义

Objective: To investigate the expressions of heparanase (Hpa) and basic fibroblast growth factor (bFGF) in oral squamous-cell carcinoma (OSCC), and to evaluate the relationship between the expressions and tumor angiogenesis and progression. Methods: The expressions of Hpa mRNA and bFGF mRNA of OSCC were examined using in situ hybridization. The microvascular density (MVD) was assessed through immunohistochemistry staining. Results: The expressions of Hpa mRNA and bFGF mRNAwere associated with tumor MVD and lymph node metastasis. Concomitant expression of Hpa mRNA and bFGF mRNA was associated with higher tumor MVD as compared with expression of either factor alone. Conclusion: Hpa and bFGF might contribute to the angiogenesis and lymph node metastasis in OSCC and they cooperate in promoting vascularization.     

牛蛙核糖核酸酶在大肠杆菌中的高效表达及其初步纯化

目的:利用大肠杆菌系统表达重组RC蛳RNase融合蛋白,并对其表达产物进行初步纯化。方法:以PCR方法扩增出RC蛳RNase基因,插入到融合蛋白原核表达载体PET32a中,构建重组表达载体PET蛳RC蛳RNase,转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)plyS,利用异丙基硫代蛳β蛳D蛳半乳糖苷(IPTG)诱导表达。工程菌经超声碎菌,离心后,采用Ni亲合层析法在变性条件下进行初步纯化。结果:经IPTG诱导后,SDS蛳PAGE和免疫印迹分析显示,工程菌在相对分子质量为3.1×104处出现一条新生蛋白带,目的蛋白占菌体总蛋白的34%,主要以包涵体形式存在。所得包涵体经纯化,纯度可达90%以上。结论:重组融合蛋白RC蛳RNase在大肠杆菌中获得成功表达,纯化效果令人满意,为进一步研究其生物学特性和功能奠定了良好的基础。     

基因工程人β干扰素的原核表达及纯化研究

目的摸索一种适合于中试生产的点突变重组人β干扰素(17Ser-IFN-β)发酵与纯化工艺。方法研究不同培养基和热诱导时间对17Ser-IFN-β表达的影响;观察pH、蛋白浓度和层析条件对17Ser-IFN-β纯化的影响。结果17Ser-IFN-β工程菌在含甘油、酪蛋白水解物及微量元素的M9培养基中,17Ser-IFN-β表达量明显增加。灰度扫描显示热诱导4h后的表达量最高,目的蛋白可达菌体总蛋白的20%以上。17Ser-IFN-β可以相对特异性地被仲丁醇抽提至有机相中,纯度达80%,经S200凝胶过滤柱层析后纯度达90%,用G25柱转换缓冲液,使缓冲液pH值＞8,同时去除缓冲液中的还原剂DTT,将复性后的样品用C4反相柱层析进行精制,最终获得纯度＞98%和比活性>3×107U/mg的17Ser-IFN-β制品。结论成功地建立了注射用新型重组人β-干扰素的中试生产工艺,为随后进行的临床前研究及临床试验打下基础。     

Heparanase及bFGF在胃癌组织中的表达及其与胃癌侵袭转移的关系

目的:探讨乙酰肝素酶(Heparanase HPA)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在胃癌组织中的表达及其与胃癌生物学行为的关系.方法:RT-PCR法检测HPA mRNA在胃癌组织中的表达,同时应用免疫组织化学法检测bFGF蛋白在胃癌组织中的表达.结果:HPA mRNA的高表达与胃癌的大体类型、浸润深度、细胞分化程度及组织学生长方式、淋巴结转移、腹膜转移、TNM分期呈正相关:而与肿瘤大小无明显关系.bFGF与浸润深度及TNM分期呈正相关.HPA与bFGF共同表达的病例腹膜转移率、淋巴结转移率、腹腔脱落癌细胞检出率均明显增高.结论:HPA在胃癌组织中的表达增高.HPA及bFGF的表达与胃癌的恶性程度密切相关,在胃癌的侵袭转移中发挥重要作用.两者共同表达时恶性程度明显增高.     

人NY-ESO-1基因的原核表达、纯化和初步应用

目的：克隆人NY-ESO-1基因，进行原核表达和分离纯化，并初步应用于肝癌患者血清NY-ESO-1抗体的检测。方法：通过RT-PCR技术从人肝癌组织中扩增NY-ESO-1基因片段，插入原核表达载体pGEX4T-1( )中，构建重组表达质粒pGEx／ESO1，导入大肠杆菌BL21(DE3)，诱导目的蛋白表达，经包涵体透析复性和GSTrap亲和层析纯化目的蛋白，Westem blot鉴定。应用间接ELISA方法初步检测50例肝癌患者血清和20例正常人血清NY-ESO-1抗体的表达。结果：扩增得到NY-ESO-1基因3′端276bp片段，与GeneBank公布序列一致，构建的pGEX／ESO1原核表达质粒经IPTG诱导，在大肠杆菌中表达分子量约36kD的GST-ESO1融合蛋白，纯化后蛋白纯度为90％。50例肝细胞癌患者血清中4例检测到NY-ESO-1抗体(8％)，正常人血清均为阴性。结论：成功构建pGEX／ESO1重组表达质粒，得到有活性的NY-ESO-1融合蛋白，对肝癌患者血清NY-ESO-1抗体的检测有-定的应用价值。     

原癌基因eIF4E与bFGF在乳腺癌中的表达及其临床意义

目的 探讨eIF4E与bFGF在人类乳腺癌组织中的表达、相关性及其春临床意义.方法 采用免疫组化方法对75例乳腺和12例乳腺良性病变中eIF4E与bFGF基因表达的水平进行研究.结果 eIF4E与bFGF在乳腺癌组织中表达的阳性率分别为89.3%和58.7%.乳腺癌中eIF4E与bFGF阳性率明显高于生存期≥5年组(P＜0.05),与生存期成负相关.bFGF在有腋淋巴结转移组阳性表达率明显高于无腋淋巴结转移组(P＜0.01),而eIF4E的表达与有无腋淋巴结转移无关(P＞0.05).两者均与患者年龄、肿块大小、病理类型、临床分期、ER、PR、CerbB-2表达状态无关(P＞0.05).eIF4E与bFGF表达有相关性(P＜0.01),两者呈显著正相关(r=0.473).结论 eIF4E与bFGF在乳腺癌的发生发展及预后中起着重要作用,联合检测eIF4E与bFGF的表达可以成为临床上判断乳腺癌预后的参考指标.     

原发性肝癌围化疗栓塞期血液中 VEGF、bFGF 的表达及其临床意义

目的：观察化疗栓塞治疗前后原发性肝癌患者血液中血管生成调节因子（VEGF和bFGF）表达水平的变化，探讨术后肿瘤血管生成情况。方法：采用双抗体夹心EHSA法检测人血清VEGF、bFGF含量，比较化疗栓塞治疗前后的表达水平。结果：11例肝癌患者血液中VEGF和bFGF的表达水平介入后均较介入前明显升高，（P〈0．05）。两者表达呈正相关（P=0．012）。结论：化疗栓塞治疗促进了血液中VEGF和bFGF表达；VEGF和bFGF的表达在一定程度上反映了化疗栓塞术后肿瘤血管生成状况。     

重组人微小染色体维持蛋白MCM5的原核表达与纯化

 MCM5蛋白是一种DNA复制调控蛋白，属于MCM蛋白质家族。MCM5蛋白的表达作为一种增殖细胞的标记物受到关注，抗MCM5蛋白的抗体可以用来检测肿瘤细胞。MCM5蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达，通过洗涤、层析可以得到纯度较高的MCM5包涵体蛋白。本研究的成功为进一步进行相应抗体的制备奠定了基础。     

重组人微小染色体维持蛋白MCM5的原核表达与纯化

MCM5蛋白是一种DNA复制调控蛋白，属于MCM蛋白质家族。MCM5蛋白的表达作为一种增殖细胞的标记物受到关注，抗MCM5蛋白的抗体可以用来检测肿瘤细胞。MCM5蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达，通过洗涤、层析可以得到纯度较高的MCM5包涵体蛋白。本研究的成功为进一步进行相应抗体的制备奠定了基础。     

bFGF基因表达与人脑胶质瘤间质血管增生

探讨ｂＦＧＦ基因表达与人脑胶质瘤间质血管增生的关系。方法采用原位杂交法检测５７例胶质瘤组织的ｂＦＧＦｍＲＮＡ表达水平并定量分析所含毛细血管。结果：各级胶质瘤ｂＦＧＦｍＲＮＡ表达的阳性性,随着胶质瘤及别的升达水平也升高。     

Relationship between Gene Expression of bFGF and Proliferative Activity in Meningioma

OBJECTIVE To study the relationship between bFGF gene expression and proliferative activity in meningiomas.METHODS Thirty-seven samples of meningioma were examed using Northern hybridization for bFGF-gene expression and immunohistochemi- stry for bFGF protein expression and the Ki-67LI.RESULTS bFGF mRNA was detected in 22 meningiomas of Grade Ⅰ and in all samples of Grade Ⅱ and Ⅲ. Six of the Grade Ⅰ tumors were negative,giving an overall positive rate of 83.8 % for bFGF mRNA. Autoradiography was conducted using a thin scaning apparatus. bFGF mRNA expression compared to that for β-actin was 0.34±0.06 for Grade Ⅰ tumors compared to 0.82±0.12 for Grade Ⅱ and Ⅲ tumors. The difference was highly significant (P＜0.001). The results of immunohistochemistry showed that the number of the positive cells for the bFGF protein was 29.7±7.6% in Grade Ⅰ tumors and 63.2±11.7 % in Grade Ⅱ plus Ⅲ, resulting in a significant difference between them (P＜0.001). The Ki-67LI was found to be 2.8±1.1% in Grade Ⅰ and 6.5±1.3 % in Grade Ⅱ plus Ⅲ. The former was significantly lower than the later (P＜0.001).CONCLUSION The expression of bFGF was correlated well with the malignancy of the meningiomas.     

高表达p73 基因对肺腺癌细胞VEGF 、bFGF 表达抑制作用的研究

 目的 观察高表达的p73基因对肺腺癌细胞中VEGF、bFGF mRNA和蛋白表达水平的影响。方法 将p73基因以脂质体法转染A549细胞、H1299细胞，G418筛选阳性细胞克隆．采用RT-PCR半定量法检测转染前后VEGF、bFGF mRNA的表达水平，Western-blot半定量法检测蛋白表达水平。结果 转染p73基因后，A549细胞、H1299细胞中VEGF、bFGF mRNA和蛋白表达水平均下降，较未转染p73基因的细胞有显著性差异(P<0．05)。结论 高表达的p73基因能够降低肺腺癌细胞中VEGF、bFGF mRNA和蛋白表达水平，提示p73基因可能抑制人类肺腺癌的血管生成。     

重组人内皮细胞生成抑制因子-Endostation的表达和纯化

目的:利用Pichia pastoris菌株高效表达重组人内皮细胞生长抑制因子(rh-Endostatin),并将其纯化至均质。方法:将构建的菌种Pichia pastoris X33/pLW202扩增后接种至发酵培养基中,诱导表达后收获上清,将上清浓缩后经亲合层析、凝胶层析后得到高纯度rh-Endostatin。结果:从发酵上清中可得到60mg/L高纯度的rh-Endostatin,经HPLC检测纯度达98％以上。结论:在Pichia pastoris表达系统中,实现了rh-Endostatin的高效分泌性表达。     

人脑胶质瘤bFGF及其相关受体FGFR—1的蛋白表达

目的：探讨ｂＦＧＦ及其相关受体ＦＧＦＲ－１的表达与人脑胶质瘤的关系。方法：用免疫组化法，对５７例人脑胶质瘤进行了检测。结果：发现人脑胶质瘤ｂＦＧＦ和ＦＧＦＲ－１表达水平均升高，且随胶质瘤恶性程度增加而升高，它们之间呈正相关。结论：胶质瘤能高表达ｂＦＧＦ和ＦＧＦＲ－１，它们可作为诊断和判定胶质瘤预后的参考。     

Shh和bFGF在胰腺癌中的表达及其与临床病理特征关系

[目的]探讨Shh、bFGF在胰腺癌组织中的表达及其意义。[方法]应用免疫组织化学SP法检测Shh和bFGF蛋白在34例手术切除的原发性胰腺癌组织，21例胰腺良性病变组织中的表达。[结果]Shh在胰腺癌组织中阳性表达率为64．7％（22／34），高于胰腺良性病变组织（0／21）（X^2=22．647，P=-0．000）。bFGF在胰腺癌组织和胰腺良性病变中阳性表达率分别为67．6％（23／34）和66．7％（14／21），无显著性差异（X^2=0．006，P=0．940）。Shh表达与患者年龄、性别及肿瘤部位、大小、分化、淋巴结转移、血管浸润无明显相关，与肿瘤TNM分期、远处转移密切相关（P〈0．05）；bFGF的表达与TNM分期、血管浸润、远处转移密切相关（P〈0．05）。胰腺癌组织中Shh表达与bFGF表达呈正相关（r=-0．410，P=0．016）。[结论]Shh和bFGF在胰腺癌组织的表达与胰腺癌的分期和远处转移相关；两者可能在胰腺癌发生发展中起协同作用。     

鼻咽癌患者放射治疗前后血清VEGF和bFGF的变化

[目的]探讨鼻咽癌（NPC）患者放射治疗前后外周血清血管内皮细胞生长因子（VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的变化。[方法]42例NPC患者作为放疗组予以放射治疗。40例健康体检者作为正常对照组。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测放疗前后NPC患者外周血清VEGF和bFGF的含量，并与对照组比较。[结果]放疗前NPC患者血清VEGF和bFGF显著升高，与对照组比较有统计学意义（P〈0．01）。放疗后3个月NPC患者血清VEGF和bFGF明显下降，接近对照组水平（P〉0．05），放疗后1年复发者血清VEGF和bFGF水平持续异常（P〈0．01），未复发者血清VEGF和bFGF水平恢复正常（P〉0．05）。放疗前后患者血清VEGF和bFGF的浓度变化呈正相关（P=0．0011，r=0．7981）。[结论]NPC患者血清中VEGF和bFGF高表达，测定NPC患者血清中VEGF和bFGF的变化对临床疗效观察和预后判断均有重要的临床意义。     

截短的食管癌相关基因ECRG4在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化

目的本实验旨在构建ECRG4的原核表达载体，在大肠杆菌中表达并纯化ECRG4所编码的蛋白，为进一步研究奠定基础。方法将ECRG4基因序列前端编码疏水性跨膜区28个氨基酸的cDNA序列截去，再将截短的cDNA序列克隆到原核表达载体Pet30（＋）上，重组表达载体转化感受态表达菌株BL21（DE3），低浓度IPTG低温诱导融合蛋白的表达。采用Western blot鉴定目的蛋白的表达，使用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化。结果构建了截短的ECRG4．pET30a（＋）基因的原核表达载体，IPTG低温诱导得到大量可溶性蛋白，并且通过亲和层析纯化了重组融合蛋白。结论成功获得了高效表达的、具有一定的生物学活性的ECRG4原核表达产物，并为进一步研究ECRG4的结构和功能打下基础。     

COX-2和bFGF在乳腺癌组织中的表达及相关性探讨

目的 研究环氧化酶-2(COX-2)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在正常乳腺组织、乳腺良性疾病和乳腺癌组织中的表达及其相关性.方法 用免疫组化方法检测10例正常乳腺组织、45例乳腺良性疾病和90例乳腺癌中COX-2和bFGF的表达,并分析其与乳腺癌的临床病理特征的相关性.结果 Cox-2和bFGF在良性乳腺疾病及...