单核细胞趋化因子1发卡环RNA真核表达载体的构建

目的：构建单核细胞趋化因子1发卡环RNA真核表达载体。 方法：实验于2002—10／2003-05在解放军第二军医大学中心实验室完成。①单核细胞趋化因子1发卡小分子干扰RNA片段合成。（2）将发卡小分子干扰RNA克隆人质粒pSilencer产生重组质粒SiRNA—pSilencer-单核细胞趋化因子1。③分别用BamHⅠ和HindⅢ酶切鉴定，随机分为1，2样本，每份样本进行10次电泳，并且采用460bpi标准参照样。④将经酶切鉴定后的重组质粒作测序分析。 结果：①单核细胞趋化因子1发卡小分子干扰RNA片段被成功克隆进pSilencer-U6质粒中。②BamHⅠ和HindⅢ酶切鉴定可切出450bpi大小的片段，结果表明样本1，2均与参照以及marker相一致，从片段大小的角度初步确定酶切的准确。③DNA测序分析显示，重组质粒小分子干扰RNA编码序列与设计片段的序列完全一致。 结论：针对单核细胞趋化因子1发卡小分子干扰RNA片段的真核表达载体SiRNA—pSilencer-单核细胞趋化因子1的成功构建，为进一步研究其基因功能打下了基础。     

GATA-3短发夹状RNA逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的构建GATA-3特异性短发夹状RNA(shRNA)逆转录病毒表达载体。方法设计、合成两对GATA-3编码基因的反向重复序列,中间插入9个碱基的短发夹,经退火形成互补双链,再克隆至逆转录病毒载体RNA i-Ready pSIREN-RetroQ。结果构建的重组逆转录病毒载体可以被限制性内切酶BamH I,EcoR I切开,电泳可显示相应条带,经测序其序列与设计的一致。结论成功构建GATA-3特异性shRNA逆转录病毒载体RetroQ/GATA-3/shRNA,为进一步进行肿瘤细胞GATA-3基因沉默的研究奠定了基础。     

兔膜联蛋白A1基因短发夹RNA慢病毒载体构建与RNA干扰效率的鉴定

背景:膜联蛋白A1参与细胞凋亡的调控。目的:针对兔膜联蛋白A1基因构建短发夹RNA慢病毒载体,并检测其对成骨细胞的沉默效率。方法:针对兔膜联蛋白A1基因设计RNA干扰靶序列,合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与BamHI和EcoRI双酶切后的pGLV/H1/GFP载体连接成pGLV-shANXA1,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。pGLV-shANXA1和pGLV/helper-1、pGLV/helper-2、pGLV/helper-3共转染293FT细胞包装产生慢病毒颗粒LV-shANXA1,并测定其滴度,随后将LV-shANXA1感染兔成骨细胞。结果与结论:经PCR和测序证实构建片段大小及DNA序列与目标序列一致,shANXA1片段完全正确插入慢病毒载体pGLV/H1/GFP中。包装浓缩慢病毒颗粒LV-shANXA1的滴度为3.8×108TU/L。经嘌呤霉素筛选后,感染复数为50时,LV-shANXA1对成骨细胞感染效率为80%;感染复数为100时,感染效率为95%。Real-time PCR和Western blot检测显示,LV-shANXA1-901对膜联蛋白A1基因的沉默效率最高,在感染复数为50时,沉默效率可达71.2%。表明实验成功构建的兔膜联蛋白A1基因短发夹RNA慢病毒载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

大鼠CRBP-1基因shRNA慢病毒载体的构建与测序

[目的]构建测序大鼠视黄醇结合蛋白-1(CRBP-1)基因短发卡RNA(shRNA)慢病毒载体.[方法]针对已经筛选确定的大鼠CRBP-1基因RNA干扰(RNAi)有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Hpa Ⅰ和Xho Ⅰ酶切后的pGCL-GFP载体连接产生shRNA慢病毒裁体,命名为Lv-shCRBP-1,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.[结果]PCR鉴定与DNA测序证实合成的Lv-shCRBP-1寡核苷酸链插入正确.[结论]成功构建大鼠CRBP-1基因shRNA慢病毒载体.     

增殖诱导配体shRNA对结直肠癌细胞增殖与转移的影响

目的 探讨增殖诱导配体(APRIL)shRNA对结直肠癌细胞的增殖与转移的影响.方法 用RNA干扰技术敲低结直肠癌细胞株SW480中APRIL基因的表达,以免疫印迹技术、细胞黏附、损伤修复及侵袭力检测等体外实验对比APRIL基因敲低前后细胞株SW480的增殖、黏附、侵袭及转移能力的变化.结果 转染组细胞APRIL蛋白表达的灰度值为0,显著低于阴性对照组的1.0±0.3和未转染组的1.1±0.4,差异有统计学意义(F=42.15,P=0.00);转染组、阴性对照组及未转染组最大增殖细胞数分别为(6.1±4.7)×104个、(36.4±14.4)×104个和(41.3±19.2)×104个,转染组细胞增殖能力明显受到抑制(F=24.76,P<0.05);转染组细胞黏附的平均吸光度(A)值为0.343,低于阴性对照组的0.409及未转染组的0.412,细胞黏附率相对于未转染组降低39%;转染组、阴性对照组及未转染组迁移至损伤区细胞数分别为(47.89±13.16)个、(98.78±23.26)个和(108.01±39.11)个,与阴性对照组、未转染组比较,细胞迁移能力的差异有统计学意义(F=65.53,P<0.01);细胞侵袭力(A值0.58±0.10)相对于阴性对照组(A值0.94±0.23)与未转染组(A值1.11±0.21)差异亦有统计学意义(F=5.771,P<0.05).结论 APRIL有促细胞增殖作用,很可能参与结直肠癌细胞的侵袭和转移,并具增强结直肠癌侵袭和转移潜能.     

单核细胞趋化因子1发卡环RNA真核表达载体的构建

目的:构建单核细胞趋化因子1发卡环RNA真核表达载体。方法:实验于2002-10/2003-05在解放军第二军医大学中心实验室完成。①单核细胞趋化因子1发卡小分子干扰RNA片段合成。②将发卡小分子干扰RNA克隆入质粒pSilencer产生重组质粒SiRNA-pSilencer-单核细胞趋化因子1。③分别用BamHⅠ和HindⅢ酶切鉴定,随机分为1,2样本,每份样本进行10次电泳,并且采用460bpi标准参照样。④将经酶切鉴定后的重组质粒作测序分析。结果:①单核细胞趋化因子1发卡小分子干扰RNA片段被成功克隆进pSilencer-U6质粒中。②BamHⅠ和HindⅢ酶切鉴定可切出450bpi大小的片段,结果表明样本1,2均与参照以及marker相一致,从片段大小的角度初步确定酶切的准确。③DNA测序分析显示,重组质粒小分子干扰RNA编码序列与设计片段的序列完全一致。结论:针对单核细胞趋化因子1发卡小分子干扰RNA片段的真核表达载体SiRNA-pSilencer-单核细胞趋化因子1的成功构建,为进一步研究其基因功能打下了基础。     

靶向hTERT基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建hTERT 基因RNAi 慢病毒载体,为大肠癌RNAi 介导的基因治疗打下基础.方法 化学合成3 条靶向hTERT 基因的siRNA,转染大肠癌细胞SW480,48 h 后采用RT-PCR 方法筛选出一条对hTERT mRNA 有明显抑制作用的siRNA.针对已经筛选确定的hTERT 基因RNAi 有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经XhoⅠ和HpaⅠ酶切后的GP-Supersilencing Vector 载体[含U6 启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV-shhTERT 慢病毒载体,PCR 筛选阳性克隆,测序鉴定.用LV-shhTERT、pGag/Pol、pRev 和pVSV-G 4 质粒共转染包装细胞293T 细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP 蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果 PCR 和测序证实,成功构建hTERT shRNA 的慢病毒载体LV-shhTERT.包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为1 ×108 UT/ml.结论 成功构建了hTERT 基因RNAi 慢病毒载体.     

人核小体结合蛋白1小分子干扰RNA重组慢病毒抑制非激素依赖性前列腺癌体内生长的实验研究

目的探讨重组慢病毒介导的人核小体结合蛋白1（NSBP1）基因沉默对非激素依赖性前列腺癌细胞系DU145移植瘤生长的抑制作用及机制。方法慢病毒lentivirus-NSBP1转染非激素依赖性前列腺癌细胞系DU145。用转染细胞成瘤,观察抑瘤效果。运用实时RT-PCR和Western blot方法检测移植瘤中NSBP1、cyclinB1与Bcl-2的mRNA和蛋白的表达。结果体内实验证实NSBP1表达水平的降低,对肿瘤细胞在裸鼠体内成瘤率没有影响,但对肿瘤的生长有明显抑制作用。同时随着NSBP1表达水平的降低,cyclinB1和Bcl-2的mRNA及蛋白的表达也降低。结论NSBP1-RNAi-lentivirus重组慢病毒能有效抑制DU145细胞移植瘤的生长,NSBP1可能通过调控cyclinB1、Bcl-2基因的变化影响肿瘤细胞的生长。     

小分子干扰RNA真核表达载体阻断U937细胞肿瘤坏死因子α基因的表达

背景:无菌性松动是导致人工关节置换后失败和降低人工关节使用寿命的主要原因,肿瘤坏死因子α是一个极具吸引力的无菌性松动治疗新靶点.小分子干扰RNA作为一种新型的基因阻断技术,被广泛用于新基因筛选、基因功能鉴定、信号转导研究以及基因治疗方面,显示出广阔的应用前景.目的:构建人肿瘤坏死因子α基因的小分子干扰RNA真核表达载体,观察其对U937细胞中肿瘤坏死因子α基因表达的干涉作用.方法:将合成的2对小分子干扰RNA寡核苷酸链分别退火形成双链,连接入pSilencer4.1-CMV neo真核表达载体,分别命名为pSilencer-T1和pSilencer-T2,经酶切及测序鉴定.电转染法转染重组质粒入U937细胞,G418筛选后反转录-聚合酶链反应检测其对肿瘤坏死因子α基因mRNA的干涉效果.结果与结论:经酶切及测序鉴定,成功构建了siRNA真核表达载体,经电转染法转染U937细胞后,反转录-聚合酶链反应显示所构建的干涉肿瘤坏死因子α基因的真核表达载体成功地抑制了目的基因的表达,U937细胞中肿瘤坏死因子α基因的mRNA表达水平明显降低.提示成功构建了人肿瘤坏死因子α基因的RNA干涉真核表达载体pSilencer-T1和pSilencer-T2,并在U937细胞中有效地发挥了对肿瘤坏死因子α基因表达的干涉作用.     

靶向端粒酶反转录酶基因短发夹RNA载体的构建

背景：端粒酶反转录酶对端粒酶活化起重要作用。 目的：利用pLentilox3.7.U6载体构建靶向大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的短发夹RNA干扰分子表达载体并鉴定其作用。 方法：选择端粒酶反转录酶基因上两段序列体外合成RNA干扰分子的正义链和反义链模板序列,经退火成互补双链,与线性化pLentilox3.7.U6载体连接、转化大肠杆菌和序列测定,应用蛋白质印迹和免疫荧光技术,在体外培养的大鼠脊髓星形胶质细胞模型上验证构建的干扰载体抑制端粒酶反转录酶基因表达的效果。 结果与结论：蛋白质印迹和免疫荧光检测结果表明,重组质粒干扰组中星形胶质细胞端粒酶反转录酶均呈低表达。结果证实,实验成功构建了针对大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的短发夹RNA质粒表达载体,此载体能有效抑制体外培养的大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶的表达。     

慢病毒载体介导survivin基因siRNA对裸鼠移植人肺腺癌的体内抗癌机制研究

目的探讨慢病毒载体介导survivin基因小片段干扰RNA(siRNA)对裸鼠移植人肺腺癌的体内抑瘤活性。方法制备表达survivin-siRNA的慢病毒载体,构建裸鼠移植人肺腺癌模型,将裸鼠分为空白组(PC组)、空白载体组(NC组)、实验组(RNAi组)3组,分别给予生理盐水、空白病毒载体和siRNA;siRNA组肿瘤组织局部注射表达survivin-siRNA的慢病毒载体,观察肿瘤体积及其随时间的生长变化曲线;分别采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)及蛋白质印迹法检测各组裸鼠肿瘤组织中survivin基因的信史RNA(mRNA)及其表达的蛋白水平变化;采用流式细胞术检测肿瘤细胞周期组方图变化。结果慢病毒载体介导survivin-siRNA对裸鼠肺腺癌的抑瘤率为46.07%;siRNA组瘤重与NC组和PC组比较,差异有统计学意义(P0.05),而NC组与PC组瘤重比较差异无统计学意义(P0.05);siRNA组survivin基因mRNA及蛋白表达较NC组和PC组明显降低,抑制率分别为72.00%、53.00%;G1期细胞百分比明显增加,S期细胞百分比则明显减少。结论慢病毒载体介导的siRNA能有效抑制裸鼠移植人肺腺癌survivin基因的表达,有效激发细胞凋亡。     

靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体质粒，为利用RNA干扰技术探索HIWI基因的作用的研究做准备。方法根据HIWI mRNA序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段，退火形成双链并连接入pGenesil-2载体，并进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的shRNA已插入载体中，经测序证明与设计相同。结论成功构靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体，为进一步研究HIWI基因在干细胞和肿瘤细胞中的作用机制及后续的体内外RNAi实验研究奠定了基础。     

人GLIPR-2基因慢病毒RNAi载体的构建及鉴定

目的 构建人GLIPR-2基因慢病毒RNA干扰（RNAi）载体,并鉴定其感染人肝癌细胞系HepG2后缺氧条件下的GLIPR-2基因表达变化.方法 根据GLIPR-2基因序列合成siRNA片段,克隆至慢病毒载体pMAGic7.1上,转染293T细胞进行包装,收获并浓缩重组慢病毒颗粒.感染HepG2细胞,流式细胞术检测GFP的表达率,并用Western blot检测目的 蛋白在缺氧条件下的表达变化.结果 重组RNAi质粒pMAGic7.1-shRNA-GLIPR-2经菌落PCR鉴定及测序证实构建正确;稳定感染HepG2 细胞后,GFP的表达率为分别为84.48%、69.97% 和39.82%;Western blot结果显示慢病毒转染组GLIPR-2蛋白的表达水平较对照组明显降低.结论成功构建了GLIPR-2基因慢病毒RNAi载体,该载体在缺氧条件下可明显抑制目的 蛋白在HepG2细胞中表达,为进一步研究GLIPR-2的生物学功能奠定了基础.     

靶向转酮醇酶样基因1 siRNA表达载体的构建及鉴定

目的构建针对转酮醇酶样基因1(TKTL1)特异性小干扰RNA(siRNA)真核表达载体并检测其沉默效应。方法采用人U6 SnRNA启动子,分别把被9 bp序列间隔的19 bp长短的TKTL1靶序列的反向重复序列,置于pEGFP-C1-U6质粒载体中,构建成TKTL1短发夹环RNA,产生重组质粒pEGFP-C1-U6/TKTL1,分别用PstⅠ和SalⅠ酶切鉴定及测序分析,并将重组质粒转染人结肠癌细胞株LoVo,通过RT-PCR检测TKTL1基因表达水平的变化。结果酶切鉴定与DNA测序分析证明,TKTL1基因的siRNA表达载体构建正确,RT-PCR结果表明转染重组质粒的LoVo细胞TKTL1基因的表达水平明显降低。结论成功构建了针对TKTL1基因的siRNA表达载体,转染LoVo细胞后可显著抑制TKTL1基因表达。     

小鼠单核巨噬细胞Ufm1基因shRNA慢病毒载体构建及鉴定

目的 构建小鼠Ufm1基因RNA干扰慢病毒载体,并实现该基因在小鼠单核巨噬细胞系（RAW264.7）中的稳定表达抑制.方法 根据小鼠Ufm1基因设计两条RNA干扰序列,合成靶序列双链DNA,与pFU-GW-RNAi载体连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.pFU-GW-RNAi载体、pHelper 1.0载体及pHelper 2.0载体共转染293T细胞包装产生慢病毒颗粒,并测定其滴度,随后感染RAW264.7细胞,建立稳定转染细胞株.将RAW264.7细胞分为空白组、阴性对照组及RNA干扰慢病毒感染组,用Real-time PCR检测Ufm1基因mRNA的表达量.结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,shRNA片段完全正确插入慢病毒载体pFU-GW-RNAi中.在荧光显微镜下观察可见,293T细胞呈绿色荧光,并测得病毒滴度为9×105 TU/μl.重组慢病毒感染RAW264.7后,用Real-time PCR检测到Ufm1基因mRNA的表达受到抑制.结论 成功构建了小鼠RNA干扰慢病毒载体,并能够在RAW264.7细胞中有效沉默靶基因.     

人HMGN5基因shRNA慢病毒载体构建与RNAi效率的鉴定

目的构建人HMGN5基因的shRNA慢病毒载体并鉴定在肺癌A549和H1299细胞上的沉默效率。方法设计HMGN5基因特异性siRNA靶点,构建于慢病毒pLL-3.7载体,并筛选获得有效的shRNA慢病毒载体,在293T细胞包装成病毒颗粒,将其感染肺癌A549和H1299细胞,应用Real-time PCR方法从mRNA水平上检测HMGN5的沉默效率。结果构建的慢病毒载体shRNA的PCR鉴定和测序正确,包装病毒后滴度达到5×108TU/ml。shRNA慢病毒颗粒感染A549和H1299细胞后HMGN5基因的mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组分别下降了71.7%和50.7%。结论成功构建了HMGN5基因的shRNA慢病毒表达载体,在分子水平能够有效沉默靶基因,为探讨HMGN5在肿瘤基因治疗中的作用奠定了基础。     

慢病毒介导人乳头瘤病毒16型E6基因短发夹状干扰RNA对宫颈癌细胞感染效率和侵袭能力的影响

目的 研究以慢病毒为载体靶向人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6基因的短发夹状干扰RNA(shRNA)对宫颈癌Caski细胞侵袭能力的影响.方法 将靶向HPV16型E6的shRNA表达序列(干扰组)和无义表达(无义干扰组)克隆到慢病毒工作质粒中包装成病毒颗粒,感染宫颈癌Caski细胞.观察绿色荧光阳性细胞的比例以了解慢病毒对Caski细胞的感染效率;用RT-PCR法检测shRNA作用后3组Caski细胞HPV16型E6 mRNA含量的变化;Western blot法检测E6蛋白表达的变化;Transwell小室法检测肿瘤细胞侵袭能力的变化.结果 慢病毒对Caski细胞的最佳每个细胞中的病毒颗粒数目(MOI)为2.5;与无义干扰组相比,干扰组细胞中HPV16E6的mRNA含量减少70%,蛋白表达水平降低63%,Caski细胞的侵袭能力显著下降.结论 慢病毒携带的shRNA能干扰宫颈癌Caski细胞中HPV16型E6的表达,并抑制癌细胞的侵袭能力.     

多功能靶向纳米载体的制备及其对神经母细胞瘤的靶向性和MRI示踪性观察

目的 制备集靶向siRNA传递及MRI显像功能于一体的多功能靶向纳米载体,并验证其对神经母细胞瘤的靶向性及MRI示踪性.方法 制备PEG-PEI-SPION,scAbGD2 -PEG-PEI-SPION并检测其基本特性.利用凝胶阻滞检测纳米载体与siRNA的复合能力;以CLSM及MRI验证纳米载体的靶向性.结果 PEG-PEI-SPION,scAbGD2-PEG-PEI-SPION平均粒径分别为(60.0±2.3)nm及(90.0±7.8)nm.氮磷比(N/P)≥2.2时siRNA与PEG-PEI-SPION,scAbGD2 -PEG-PEI-SPION完全复合.CLSM实验及MRI结果证实scAbGD2-PEG-PEI-SPION具有靶向性.结论 scAbGD2-PEG-PEI-SPION对神经母细胞瘤具有靶向传递siRNA及MRI显影的功能.