裂褶菌产内切β-1,3-葡聚糖酶的特性研究

对裂褶茵所产内切β-1,3-葡聚糖酶进行有效分离纯化并用电泳法对其纯度进行鉴定,进而研究其酶学特性.结果表明:经过DEAE-Sephadex A-50离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤分离纯化得到电泳纯分子量约为45 kD的内切β-1,3-葡聚糖酶,其最适pH为5.0,最适温度为45℃;Fe<'2+>、B...     

易错PCR技术提高中性内切葡聚糖酶活性

近年来随着纤维素酶在食品加工工业中具有广阔应用前景,而纤维素酶的工业应用一直受酶活性低,成本高的限制。为了提高中性内切葡聚糖酶的活性,作者利用易错PCR技术对来自枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)C-36的内切葡聚糖酶基因进行定向进化研究,构建了在大肠杆菌中的突变体库。通过刚果红平板筛选,获得了酶活性提高的突变株F-10,活力比亲本酶提高4.2倍。序列分析表明:F-10有5个碱基发生突变,两个氨基酸突变:D212V和T307S。SDSPAGE条带,表明基因表达正确,而表达量较原始菌株显著增加。酶学性质分析,表明该酶的最适反应pH为5.6,最适反应温度为45℃,在pH 4.5~10.0范围内50℃保温30 min可保持80%的剩余酶活,在60~75℃酶活力相对稳定,可保持在最高酶活的80%以上,当温度高于75℃时,酶开始变性失活,酶活力迅速下降。研究获得了酶活性提高的内切葡聚糖酶菌株,为进一步在分子水平研究内切葡聚糖酶的功能和其应用打下了基础,也为高酶活酶分子在其他高表达系统的表达提供了基础材料。     

内切葡聚糖酶与木聚糖酶在毕赤酵母中的共分泌表达

为实现内切葡聚糖酶和木聚糖酶在毕赤酵母中的共分泌表达,进而降低酶制剂的生产成本,构建含木聚糖酶基因的重组表达载体pPICZαA-Aoxyn11A,经SacI线性化后,电转化至含内切葡聚糖酶基因Aucel12A的重组毕赤酵母GSC7中,获得双重重组毕赤酵母GSCX8。经甲醇诱导表达后,GSCX8发酵上清液中内切葡聚糖酶和木聚糖酶的活性分别为47.77IU/mL和192.71IU/mL,为单独表达菌株GSC7和GSX5的85%和80%。酶学性质分析显示,内切葡聚糖酶的最适pH为4.0,在pH3.0~8.5稳定;最适温度为50℃,在60℃以下稳定。木聚糖酶的最适pH为5.5,在pH3.0~10.0稳定;最适温度为55℃,在50℃以下稳定。GSCX8遗传稳定性测试结果表明,内切葡聚糖酶和木聚糖酶在毕赤酵母中实现了稳定的共表达。     

β-1,3-1,4-葡聚糖酶在毕赤酵母中的克隆与表达

β-1,3-1,4-D-葡聚糖酶是一类专一性降解β-1,3-1,4-葡糖苷键中的β-1,4-糖苷键,产生小分子还原糖的水解酶,广泛应用于啤酒工业和饲料工业中。本研究根据毕赤酵母密码子偏好性优化β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因序列,采用PCR法将其插入毕赤酵母表达载体pPICZαA,经SacI线性化后电击整合入毕赤酵母X-33基因组,构建重组酵母;经菌落PCR验证和摇瓶筛选,获得一株X-33/pPICZαA-bgl,甲醇诱导96h后,酶活力达308.5U/mL,经SDS-PAGE电泳,实际蛋白分子量约为33ku。β-1,3-1,4-D-葡聚糖酶最适反应pH为5.0,最适反应温度为50℃。      

毕赤酵母中内切β-1,4葡聚糖酶的表达及共培养制备低分子质量黄原胶

低分子质量黄原胶具有抑菌、益生及抗氧化等多种生物活性,因此通过水解制备低分子质量黄原胶具有广阔应用前景。该研究将来源于绵羊瘤胃元基因组的内切β-1,4-葡聚糖酶首次在毕赤酵母中表达,其在pH 7.0和75℃下发挥最佳作用,并有较高的pH和温度稳定性。此后,建立了毕赤酵母和野油菜黄单胞菌的共培养体系并对发酵条件进行优化,其中野油菜黄单胞菌生成的黄原胶可以被毕赤酵母分泌的内切β-1,4-葡聚糖酶直接降解产生低分子质量黄原胶。摇瓶水平下,共培养体系中总糖最高为11.4 g/L,水解产物中重均分子质量为2 500 Da的低分子质量黄原胶达到93.79%。该研究为功能性低分子质量黄原胶的工业化生产提供了一个潜在的策略。     

黑曲霉内切β-1,3(4)-葡聚糖酶的基因克隆与酶学特性分析

基于黑曲霉CBS 513.88的基因组信息,以黑曲霉CICIM F0510为出发菌株,提取其总RNA,反转录得到c DNA,成功将其3个内切β-1,3(4)-葡聚糖酶的基因(en3g A、en3g B、en3g C)在毕赤酵母中进行了克隆与表达。获得了3个重组菌GS115(p PIC-en3g A)、GS115(p PIC-en3g B)和GS115(p PIC-en3g C)。在摇瓶水平上,这株重组菌的酶活分别为1.3、8.5和10.1 U/m L。重组酶En3g A、En3g B和En3g C的最适作用温度分别为65、50和55°C;最适作用p H分别为5.0、5.0和3.5。此外,3种重组酶对羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethylcellulose,CMC-Na)和凝结多糖都具有典型的内切水解作用。这3个重组β-1,3(4)-葡聚糖酶具有良好的温度和p H稳定性,可为其在啤酒制造以及饲料加工过程中的应用奠定基础。     

裂褶菌产内切β-1,3-葡聚糖酶的分离纯化

采用不同饱和度的硫酸铵溶液对内切β-1,3-葡聚糖酶粗酶液进行分段盐析,以确定最佳盐析条件,将盐析处理后的酶液经透析浓缩、DEAE-Sephadex A-50离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤层析等进一步分离纯化,浓缩纯化后的含酶组分,经过SDS-PAGE电泳分析其纯度并初步确定其分子量。结果显示:经过纯化后的内切β-1,3-葡聚糖酶的比活力由20.90U/mg提高到933.37U/mg,纯化倍数为44.7倍,酶活回收率为11.6%,电泳分析呈单一条带,分子量近似为45ku。     

酶-碱法提取酵母β-1,3-葡聚糖的研究

采用酶-碱法从酵母自溶残渣中提取β-1,3-D-葡聚糖,通过正交试验得出最佳碱处理工艺条件为酶解后的沉淀物用60mL2%氢氧化钠溶液75℃处理6h,经冷冻干燥后,成品葡聚糖的得率为21.38%,其中多糖含量为92.17%,蛋白质含量为1.32%,水分含量为5.53%,酶-碱法处理工艺具有葡聚糖得率高、蛋白质含量低的特点。     

酵母β-葡聚糖水解酶的表达及应用

酵母β-葡聚糖是一种具有多种生物功能的细胞壁结构多糖,但天然的酵母β-葡聚糖水溶性较差,影响了其在医疗、保健食品和化妆品行业中的应用。作者通过β-1,3-葡聚糖水解酶Gly5m和β-1,6-葡聚糖水解酶BT3312水解酵母β-葡聚糖制备小分子酵母葡聚糖,提高其水溶性。以大肠杆菌为宿主,异源表达β-1,3-葡聚糖水解酶Gly5m和β-1,6-葡聚糖水解酶BT3312。在25℃条件下,添加0.2 mmol/L IPTG诱导后,Gly5m和BT3312的最高酶活分别为1 086 U/mL和2 355 U/mL。酵母β-葡聚糖经过Gly5m和BT3312水解后,溶解率分别提高了2.6倍和2.4倍。采用Gly5m和BT3312共同水解,酵母β-葡聚糖溶解率提高了3.2倍(水溶性酵母葡聚糖的质量浓度为12.5 g/L)。因此,Gly5m和BT3312在提高酵母葡聚糖的水溶性和制备小分子酵母葡聚糖领域具有重要的应用价值。     

节杆菌β-1,3葡聚糖内切酶的分离纯化与特性研究

通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和柱层析从节杆菌（Arthrobacter sp．）粗酶制剂分离纯化得到β-1,3葡聚糖内切酶。经SDS凝胶电泳和柱层析测得纯化酶为单体酶,分子量为32．5kDa;纯化酶N末端的10个氨基酸序列为APGDLLWSDE,在pH5～8之间稳定,最适pH6．5,最适温度55℃,但50℃以上失活很快。纯化酶对昆布4,5,6,7糖及昆布多糖底物的米氏常数分别为0．12,0．11,0．067,0．066mM和0．16mg／mL,也可水解热凝胶和地衣多糖,葡糖苷内切酶H（Streptomyces griseus）不能分解它,证明该酶不含糖基。该酶属于糖基水解酶16族系。     

黑曲霉内切菊粉酶基因在毕赤酵母中的表达及应用研究

利用PCR方法从黑曲霉（Aspergillus niger）基因组DNA中扩增内切菊粉酶（endo I）全长基因（1551 bp）,经序列分析后将其连接到表达载体p PIC9K上,得到重组表达载体p PIC9K-endo I。重组质粒经Sac I线性化并电转化到毕赤酵母GS115,阳性转化子进行发酵产酶后考察其酶学性质。酶学性质研究表明,重组酶的最适p H和最适温度分别为5和60℃,重组酶在55℃下保温9 h后,重组菊粉内切酶仍残余83.2%的活性,表现出极高的热稳定性,Cu²⁺、Ag⁺对重组酶有明显的抑制作用。对内切菊粉酶水解菊粉的过程研究表明,重组内切菊粉酶能在8 h内将4%（w/v）菊粉水解为3⁶个聚合度的低聚果糖,水解11 h后,低聚果糖得率达到63.5%,本研究为进一步开发以菊粉为原料生产低聚果糖的应用奠定了基础。      

指数补料发酵提高鲁氏酵母β-1,3-葡聚糖酶产量

高耐盐鲁氏酵母A菌株(耐24%盐)10 L发酵罐产β-1,3-葡聚糖酶的过程中,葡萄糖(YEPD)是鲁氏酵母A生长和产酶的最适碳源,其发酵效率显著高于甘油(YEPG)和乙醇(YEPE),而乙酸钠的可利用性较差。YEPD批培养生长效率(生物量)、最大酶活力以及酶产率分别比YEPG和YEPE批培养提高了1.89%和29.88%、114%和19.65%以及188%和33%。与YEPD批培养相比,15~23 h开始指数流加YEPF培养基,达到最大生物量的周期缩短12 h,最大生物量提高19.29%,而且β-1,3葡聚糖酶几乎以对数增长的方式提前6 h合成到最大酶活力(44.99 U/m L),酶产率提高了76.86%,达到2.14 U/(m L·h),实现了指数补料发酵的目的。研究结果确定了有效提高鲁氏酵母A生物量和β-1,3-葡聚糖酶产量的指数补料模型,为高耐盐鲁氏酵母菌剂和β-1,3-葡聚糖酶产品有效生产以及其在高活性酿造功能食品行业的应用打下了基础。     

扇贝消化腺β-1,3-葡聚糖酶的分离和性质研究

以扇贝加工废弃物消化腺为原料,经磷酸缓冲液抽提、80%饱和度硫酸铵沉淀、DE52纤维素离子交换层析和Sephadex G-100分子筛层析等步骤,获得β-1,3葡聚糖酶.经SDS-PAGE检测,扇贝消化腺β-1,3-葡聚糖酶的相对分子质量为157kDa.β-1,3-葡聚糖酶水解木耳多糖(β-1,3-葡聚糖)的最适pH为7.0,最适温度为30℃.通过Lineweaver-Burk作图,得到其米氏常数Km为13mg/mL.     

皱纹盘鲍内脏β-1,3-葡聚糖酶的提取及其酶学性质研究

从鲍鱼内脏提取β-1,3-葡聚糖酶粗酶并研究其酶学性质。以昆布多糖为底物监控酶的活性。鲍鱼内脏经匀浆后,采用3倍体积0.1mol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH6.0)浸提12h。浸提液经离心后收集上清液,并采用60%饱和度的硫酸铵对上清液中的蛋白进行盐析沉淀得β-1,3-葡聚糖酶粗酶。研究表明,粗酶中β-1,3-葡聚糖酶的最适反应温度为40℃,酶活力在40℃以下稳定;酶的最适pH为6.0,酶活力在pH4.0～7.0范围内稳定。Mn2+能明显激活酶活力,而Cu2+、Fe3+、Hg+对酶活力有抑制作用,其中Fe3+的抑制作用最强;亮肽酶素和1,10-菲啰啉对酶活力有明显的抑制作用,而E-64对酶活力有一定的激活作用;此酶对海藻酸钠也有一定水解能力。     

易错PCR定向进化大幅度提高极耐热β-葡聚糖酶的活性

采用易错PCR方法对来自于极耐热海栖热袍菌的内切葡聚糖酶Cel1B进行定向进化。携带有Cel12B基因的重组质粒pET-20b-Cel12B在固定Mn2+浓度下,通过使用不同浓度的Mg2+优化易错PCR条件,产物构建成pET-20b-Mu-Cel12B重组子,并建立突变体文库,重组子经改进的刚果红平板法筛选,通过透明圈的大小获得了酶活性大幅度提高的突变体3个,突变基因经诱导后的酶活力分别是在同样条件下诱导获得的亲本酶的2.1倍、3.2倍和3.7倍。     

大豆β-淀粉酶基因在毕赤酵母中的高密度发酵表达

大豆β-淀粉酶在麦芽糖浆生产上具有应用优势。该研究应用毕赤酵母表达系统异源表达大豆β-淀粉酶,并对重组酶的酶学性质进行了分析,结果显示,其酶学性质没有改变。为了增强重组β-淀粉酶的表达,采用甲醇/山梨醇混合碳源诱导的毕赤酵母表达策略,10 L发酵罐发酵表达的重组β-淀粉酶酶活力为310 U/mL,比单一甲醇诱导提高了36%。研究结果表明,发酵条件优化对提高异源β-淀粉酶在毕赤酵母中的表达有重要参考价值。     

从酵母细胞壁提取β-1,3-D-葡聚糖的研究

分别采用酸法、碱法来提取酵母细胞壁中的β-1，3-D-葡聚糖。用紫外光谱法、纸层析法法和红外光谱法分析多糖成分。结果发现：经酸法（醋酸溶液浓度为0．5mol／L）提取的β-1，3-D-葡聚糖产品中除含有葡聚糖外，还含有一定量的甘露聚糖和蛋白质成分；而用碱法（氢氧化钠溶液浓度为1．0mol/L）提取时，产品为高纯度的β-1，3-D-葡聚糖。本文从其水解机理上探讨了产生上述两种不同结果的原因，指出碱法提取是从酵母中提取β-1，3-D-葡聚糖的高效方法。     

耐热β-半乳糖酶在乳酸克鲁维酵母及毕赤酵母中的表达研究

将嗜热脂肪芽孢杆菌来源的耐热β-半乳糖酶基因bgaB分别插入穿梭质粒pKLAC1、pPIC9k的α-因子信号肽下游,构建bgaB基因的乳酸克鲁维酵母真核表达载体pKLAC1-bgaB及毕赤酵母真核表达载体pPIC9k-bgaB。载体经酶切线性化后采用电击方法分别转化到乳酸克鲁维酵母K.lactis GG799及毕赤酵母GS115中,并通过同源区各自整合到宿主基因组中。重组酶进行镍柱纯化、Western Blot杂交鉴定及酶学性质分析。结果表明,耐热β-半乳糖苷酶在酵母表达系统中可以实现外源表达且热稳定性保持良好,但不能被酵母系统有效分泌。      

响应面优化木霉TP-24固态发酵生产β-1,3-葡聚糖酶产酶条件

研究采用响应面法(RSM)对木霉TP-24固态发酵生产β-1,3-葡聚糖酶的培养基组成(碳源酵母粉、氮源NH4NO3和料水比)进行了优化。结果表明,采用以麸皮为基质、添加1.91%酵母粉、1.99%NH4NO3和15.79mL水的培养基中,接种木霉TP-24菌株于30℃发酵4d,β-1,3-葡聚糖酶活力可达到594.37U/g·ssc,比对照产酶水平提高了273.55%。     

耐热β-半乳糖酶在乳酸克鲁维酵母及毕赤酵母中的表达研究

将嗜热脂肪芽孢杆菌来源的耐热β-半乳糖酶基因bgaB分别插入穿梭质粒pKLAC1、pPIC9k的α-因子信号肽下游,构建bgaB基因的乳酸克鲁维酵母真核表达载体pKLAC1-bgaB及毕赤酵母真核表达载体pPIC9k-bgaB。载体经酶切线性化后采用电击方法分别转化到乳酸克鲁维酵母K.lactis GG799及毕赤酵母GS115中,并通过同源区各自整合到宿主基因组中。重组酶进行镍柱纯化、Western Blot杂交鉴定及酶学性质分析。结果表明,耐热β-半乳糖苷酶在酵母表达系统中可以实现外源表达且热稳定性保持良好,但不能被酵母系统有效分泌。