角质细胞无血清培养基促进大鼠毛囊干细胞的增殖

背景：以往研究培养毛囊干细胞多使用DMEM/F12+体积分数10%胎牛血清培养基,而进年来开发出的角质细胞无血清培养基也可应用于毛囊干细胞的培养。 目的：观察3种不同培养基对大鼠毛囊干细胞增殖情况及干细胞纯度的影响。 方法：取大鼠触须部皮肤组织,体式显微镜下分离出毛囊组织,中性蛋白酶Ⅱ与胰蛋白酶和乙二胺四乙酸混合液“两步酶法”消化。所得细胞悬液按细胞数平均分为3份,分别使用角质细胞无血清培养基、DMEM/F12+体积分数10%胎牛血清及角质细胞无血清培养基+体积分数10%胎牛血清共3种培养基培养,Ⅳ型胶原差速贴壁法筛选毛囊干细胞,进行传代培养。 结果与结论：培养毛囊干细胞传至第3代,锥虫蓝染色计数法检测结果显示,此3组间细胞活率差异无显著性意义(P > 0.05)。CCK8比色法检测细胞生长曲线显示,培养前2 d,此3组细胞生长均较缓慢;培养4 d,细胞生长进入对数生长期,3种培养基培养的细胞增殖活性：角质细胞无血清培养基+10%胎牛血清组>DMEM/F12+10%胎牛血清>角质细胞无血清培养基(P < 0.05)。流式细胞仪检测显示,角质细胞无血清培养基组CD34的表达高于角质细胞无血清培养基+10%胎牛血清组(P < 0.05)。DMEM/F12+10%胎牛血清组中CD34、β1-整合素(CD29)及CK15标记物的表达低于其他2组(P < 0.05)。结果表明,角质细胞无血清培养基较DMEM/F12+体积分数10%胎牛血清能培养出纯度更高的毛囊干细胞,并且在此培养基培养的基础上加入血清,能够促进毛囊干细胞的增殖。     

不同血清微环境对大鼠骨髓间充质干细胞体外培养的影响

背景:骨髓间充质干细胞在培养过程中,常在基础培养基中添加一定的血清,最常见的是小牛血清和胎牛血清,但这存在着一定的生物安全性隐患。目的:观察不同血清微环境对大鼠骨髓间充质干细胞体外培养的影响。方法:自成年大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞,采用全骨髓贴壁法培养。分别以下列血清微环境培养:自身血清组:分离细胞后原代用含大鼠自身血清的培养基培养,传代后换用含胎牛血清的培养基培养;同种异体血清组:分离细胞后原代用含同种异体血清的培养基培养,以后用胎牛血清培养基培养;胎牛血清组:分离后用含胎牛血清培养基培养,以后一直用含胎牛血清培养基培养;DMEM组:分离细胞后原代用不含血清的DMEM培养基培养,传代后换用含胎牛血清的培养基培养。在倒置相差显微镜下观察细胞的形态;细胞的贴比率;生长曲线;流式细胞仪观测细胞表面CD11b、CD45和CD90表达。结果与结论:大鼠自身血清微环境及同种异体血清微环境细胞形态均一性、在融合度均高于其他组;首次传代天数低于其他组。24,48,72h贴比率自身血清组、同种异体血清组和胎牛血清组均高于DMEM组(P0.01)。在细胞生长曲线中大鼠自身血清组倍增速率最快,其次为同种异体血清组,再者为胎牛血清组,而DMEM组细胞未见明显倍增现象。流式细胞仪检测含血清培养基培养条件下各组第3代细胞CD11b和CD45阳性细胞率均达到98%以上,CD90阳性率小于2%,可以得到纯度较高的骨髓间充质干细胞。但是在无血清微环境条件下,CD11b的阳性率为95.83%、CD90阳性率达2.07%,而CD45阳性率仅为64.79%,可见无血清环境下培养的骨髓间充质干细胞纯度明显低于含血清微环境。提示大鼠自身血清微环境下更有利于骨髓间充质干细胞的贴壁、生长及纯化。     

自体血清与胎牛血清培养兔关节软骨细胞的生物学特性

背景：目前培养软骨细胞多使用胎牛血清。但近年异种血清培养组织向临床应用的安全性受到质疑,因此自体血清培养越来越受到重视。 目的：比较体积分数10%兔自体血清与体积分数10%胎牛血清培养兔关节软骨细胞生物学特性的差异。 方法：兔自体血清培养液制备后,分离培养兔关节软骨细胞,分别在体积分数10%自体血清和体积分数10%胎牛血清中进行单层传代培养至1,3,5代,采用光镜观察细胞形态变化,绘制生长曲线评估细胞增殖速度,观察甲苯胺蓝染色、Ⅰ,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色结果,以流式细胞仪分析细胞Ⅰ,Ⅱ型胶原以及CD26,CD44的表达变化。 结果与结论：①在细胞形态上自体血清和胎牛血清培养的软骨细胞差异不大。②自体血清培养的软骨细胞较胎牛血清培养的软骨细胞生长速度更快。③甲苯胺蓝染色结果示,无论是自体血清还是胎牛血清所培养的细胞,染色随代龄的增加逐渐变浅,细胞传至第5代时两组几乎均无异染。对于1代和3代细胞而言,自体血清培养的软骨细胞较胎牛血清所培养的软骨细胞较为深染。④Ⅰ型胶原的表达随代数的增加而增加,而Ⅱ型胶原的表达则随代数的增加而减少。在3代时自体血清培养的软骨细胞Ⅰ型胶原的表达水平低于胎牛血清培养的软骨细胞(P < 0.05);在1代和3代时自体血清培养的软骨细胞Ⅱ型胶原的表达水平高于胎牛血清培养的软骨细胞(P < 0.05)。⑤CD26表达呈现先升高后降低的趋势,而CD44的表达不随传代数的增加而改变。提示同异体体积分数10%的胎牛血清相比,体积分数10%的自体血清培养的兔软骨细胞生长速度快,且在大部分指标上可以较好地保持细胞表型。     

低氧对人脐带间充质干细胞生物学特性及增殖的影响

目的探讨低氧培养条件对人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的生长和增殖的影响。方法采用人脐带酶消化法分离培养hUC-MSCs,分别将细胞置入体积分数20%、10%、3%O2条件下培养,通过细胞成脂、成骨分化诱导及流式细胞仪检测其表面标志物,鉴定hUC-MSCs;绘制细胞生长曲线,用流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况。结果低氧条件培养hUC-MSCs具有成脂、成骨等多项分化的潜能;流式细胞仪检测呈CD105、CD73、CD90、CD44、HLA-ABC高表达,CD106、CD29、CD45、CD34、HLA-DR低表达;体积分数3%O2培养组与正常体积分数20%O2培养组及体积分数10%O2培养组相比(各组倍增时间分别为17.2 h、20.8 h、18.9 h),细胞增殖速度加快(P0.05);G0/G1期细胞减少(各组G0/G1期细胞数分别为77.11%±3.89%、83.92%±5.59%、80.19%±5.16%),S期细胞增多(S期细胞数分别为15.73%±2.56%、10.91%±1.86%、13.31%±2.31%),增殖指数升高(P0.05);细胞凋亡率降低(流式细胞仪检测各组凋亡率分别为13.41%±1.39%、20.83%±1.81%、19.11%±2.44%)(P0.05)。结论体积分数3%O2持续培养可促进hUCMSCs的增殖,减少细胞凋亡。     

低氧对人脐带间充质干细胞生物学特性及增殖的影响简

目的探讨低氧培养条件对人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）的生长和增殖的影响。方法采用人脐带酶消化法分离培养hUC-MSCs,分别将细胞置人体积分数20％、10％、3％0,条件下培养,通过细胞成脂、成骨分化诱导及流式细胞仪检测其表面标志物.鉴定hUC-MSCs：绘制细胞生长曲线,用流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况。结果低氧条件培养hUC-MSCs具有成脂、成骨等多项分化的潜能：流式细胞仪检测呈CD105、CD73、CD90、CD44、HLA-ABC高表达,CDl06、CD29、CD45、CD34、HLA-DR低表达;体积分数3％O2培养组与正常体积分数20％O2培养组及体积分数10％0,培养组相比（各组倍增时间分别为17.2h、20.8h、18.9h）,细胞增殖速度加快（P〈0.05）;G0/G1期细胞减少（各组G0／G1期细胞数分别为77.11％±3.89％、83.92％±5.59％、80.19％±5.16％）,S期细胞增多（S期细胞数分别为15.73％±2.56％、10.91％±1.86％、13.31％-4-2.31％）,增殖指数升高（P〈0.05）;细胞凋亡率降低（流式细胞仪检测各组凋亡率分别为13.41％±1.39％、20.83％±1.81％、19.11％±2.44％）（P〈0.05）。结论体积分数3％O：持续培养可促进hUC-MSCs的增殖.减少细胞凋亡。     

血管周围干细胞在大鼠脂肪组织中的含量及其体外扩增后比例的变化

目的探索大鼠脂肪组织中血管周围干细胞(PSCs)在脂肪组织细胞中所占的比例,以及体外培养扩增后的大鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)中PSCs比例的变化,为组织工程自体细胞移植修复骨和软骨损伤的实验研究提供可能的新型种子细胞。方法取大鼠的脂肪组织用II型胶原酶消化得到血管基质成分(SVF)并且体外培养扩增大鼠ADSCs至P3代,用细胞计数仪及流式细胞仪检测SVF细胞密度、活细胞比例、PSCs含量,检测ADSCs中PSCs的含量并与CD45–SVF细胞中PSCs含量进行比较。结果经细胞计数仪分析,每只大鼠约3 ml脂肪组织消化所得SVF中活细胞比例为(69.31±6.57)%,可收获活细胞(40.69±6.81)×106个。经流式细胞仪检测,每只SD大鼠3 ml脂肪组织中平均可以得到PSCs活细胞为(1.60±0.59)×106个,血管外周细胞为(0.18±0.04)×106个,血管外膜细胞为(1.42±0.57)×106个。而体外平面培养扩增的P3代ADSCs中,PSCs及各细胞亚群的比例并没有随着细胞的扩增而改变(P0.05)。结论大鼠脂肪组织中含有PSCs,可以直接通过流式分选获取大量PSCs,不进行体外扩增即可望满足骨和软骨组织工程种子细胞的需要。     

利用自体血清培养人外周血内皮祖细胞

背景：传统方法培养人外周血来源内皮祖细胞操作复杂,费用大,细胞获得率较低。 目的：利用自体血清培养人外周血来源内皮祖细胞,并鉴定其功能。 方法：采用密度梯度离心法从人外周血分离得到单个核细胞,体外培养分化为内皮祖细胞。按培养基条件不同分为EGM-2MV组、添加自体血清组(M199+体积分数10%自体血清+胰岛素样生长因子)、添加胎牛血清组(M199+体积分数10%胎牛血清+血管内皮细胞生长因子+碱性成纤维细胞生长因子+胰岛素样生长因子+表皮生长因子)。观察内皮祖细胞增殖、迁移能力;采用细胞形态观察、双荧光染色法及流式细胞仪等技术对培养的内皮祖细胞进行鉴定。 结果与结论：培养第7天,EBM-2MV组和添加自体血清组细胞增殖能力和迁移率都优于添加胎牛血清组(P < 0.05)。每组细胞经结合Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素双色荧光染色鉴定后双阳性率> 80%,免疫细胞化学检测显示每组细胞CD133,CD34和KDR的表达均为阳性。证实在M199培养液中添加自体血清是一种简单、高效的培养内皮祖细胞方法。     

复发性自然流产患者外周血自然杀伤细胞免疫表型检测

目的 检测复发性自然流产(RSA)患者外周血自然杀伤(NK)细胞的免疫表型。方法 应用流式细胞术检测27例RSA妊娠患者、41例RSA非妊娠患者、32例正常妊娠者和25例正常非妊娠者外周血CD56dimCD 16+、CD56brightCD16+/-、CD69+、HLA-DR+ NK细胞表达并进行比较。结果RSA妊娠组、RSA非妊娠组、正常妊娠组和正常非妊娠组外周血CD56dimCD16+ NK细胞占总NK细胞的比例分别为(88.69.±5.86)％、(79.25±9.31)％、(79.24±10.09)％、(75.49±11.96)％;CD56brightCD16+/- NK细胞的比例分别为(8.18±5.54)％、( 12.20±6.49)％、( 13.13±8.65)％、( 11.53±6.23)％;CD69+ NK细胞的比例分别为(3.42±2.13)％、(2.36±1.72)％、(2.68±1.81)％、(2.08±1.73)％;HLA-DR+ NK细胞的比例分别为(15.26±9.32)％、(9.96±7.18)％、( 10.57±8.05)％、(9.64±6.12)％。与RSA非妊娠组、正常妊娠组及正常非妊娠组比较,RSA妊娠组CD56dimCD16+、CD69+、HLA-DR+ NK细胞显著升高（均P＜0.05）。与RSA非妊娠组及正常妊娠组比较,RSA妊娠组CD56brightCD16+/- NK细胞明显降低（均P＜0.05）。结论 RSA妊娠患者外周血中NK细胞CD56dimCD16+、CD69+和HLA-DR+表达增高,而CD56brightCD16+/-表达下降,可能在RSA的发生发展中起着一定的作用。     

低血清培养对骨髓间充质干细胞细胞周期同步化的影响

目的探索骨髓间充质干细胞细胞周期同步在G0/G1期的培养条件。方法培养骨髓间充质干细胞并用CD44、CD90、CD71、CD11b进行流式细胞术鉴定,观察50、5和100mL/L胎牛血清培养条件下细胞周期的变化情况及对细胞凋亡的影响。结果骨髓间充质干细胞CD44、CD90、CD71阳性,CD11b阴性。50mL/L胎牛血清培养1d和5mL/L胎牛血清培养1~3d可使G0/G1期细胞比例减少,S期和G2期细胞比例增加,但随着时间延长,G0/G1期细胞比例明显增加,S期和G2期细胞比例减少,细胞周期阻滞在G0/G1期,50mL/L胎牛血清不增加细胞凋亡比例,5mL/L胎牛血清在3d内使细胞凋亡比例明显增加,随时间延长又逐渐下降。5mL/L胎牛血清培养5d组G0/G1期细胞比例增加最为明显,由75.9%上升到89.4%,凋亡细胞比例仅为0.162%。结论5mL/L胎牛血清培养5d是使间充质干细胞细胞周期同步在G0/G1期的理想的培养条件。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

目的 探讨生长因子在体外能否诱导大鼠骨髓来源的间充质干细胞（BM-MSC）向心肌样细胞分化,是否增强其旁分泌作用.方法 取4周龄雄性SD大鼠骨髓,贴壁法培养BM-MSC至第3代时,应用流式细胞仪检测其表面标志物CD29、CD44、CD105、CD34、CD45、CD31.将细胞随机分为间充质干细胞组（MSC组）和生长因子共培养组（GF-MSC组）.MSC组继续培养传代;GF-MSC组与生长因子[其中包括培养基（IMDM）、2％胎牛血清（FBS）、20 nmol/L地塞米松、100μmo1/L维生素C（VitC）、50 μg/L成纤维细胞生长因子2（FGF-2）、10 μg/L成骨蛋白2（BMP-2）、2μg/L胰岛素样生长因子1（IGF-1）、青霉素和100 mg/L链霉素]共培养.1周后细胞免疫荧光染色检测两组细胞肌钙蛋白Ⅰ（TnⅠ）和结蛋白（Des）表达;反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测两组细胞Tn Ⅰ和Des mRNA的表达;ELISA法检测两组细胞裂解液以及细胞培养上清中的肝细胞生长因子（HGF）和血管内皮生长因子（VEGF）的蛋白水平.结果 体外培养的BM-MSC表达CD29、CD44、CD105,而不表达CD31、CD34、CD45.免疫荧光染色显示GF-MSC阳性表达TnⅠ和Des.RT-PCR结果显示TnⅠ和Des mRNA在GF-MSC有阳性表达,而MSC为阴性表达.GF-MSC组HGF、VEGF在细胞裂解液和细胞培养上清中的蛋白水平（ng/L）高于MSC组（HGF裂解液32.05±0.41比12.10±0.21,培养上清574.21±4.19比169.16±2.41;VEGF裂解液45.66±2.22比30.37±0.54,培养上清487.78±36.29比44.25±1.31;均P＜0.05）.结论 体外与生长因子共培养,可诱导BM-MSC向心肌样细胞分化,并增强其旁分泌作用.     

Artificial rearing of rat pups using rat milk

The contribution of diet and surgery to the brain weight deficits observed in artificially reared rats was investigated. Four day old Long Evans rat pups were assigned to an artificially reared (AR) or mother reared (MR) group. AR pups were encannulated and fed either rat milk (AR-MOM) or replacement formula (AR-MES). MR pups received a sham encannulation (MR-SHAM) or no surgery (MR-CONT) before being returned to their dam for rearing. On day 7 all the animals were killed. Brain weights and visceral organ weights were obtained. There was no significant difference between the MR groups on any measure except stomach weights. AR-MOM pups had larger visceral organ weights than pups in the other groups. AR-MOM and AR-MES pups had similar whole brain weights, smaller than those of the MR pups. However, the cerebellar weights, and to a lesser extent, brainstem weights, showed improvements in the AR-MOM group, over the AR-MES group. Neither the effect of surgery nor of diet alone can account for the organ weight differences that have been described in AR rats. The possibility that normal growth may be primarily dependent on diet at one stage of development, with other factors gaining importance at later stages is discussed.     

Transplantation of postnatal rat enteric ganglia into denervated adult rat hippocampus

These experiments explore the possible value of the myenteric plexus as a source of donor cells for autografting into the central nervous system. Neurons and glia from 10-12-day postnatal rat myenteric plexus survive for at least one month after transplantation into cholinergically denervated syngeneic adult rat hippocampus. A population of donor cholinergic neurons has acetylcholinesterase-positive processes, but these appear not to innervate host tissue. Host gliosis in response to these implants seems to be less than that seen with other peripheral ganglia, and unlike Schwann cells, the enteric glia form end-feet on brain capillaries.     

Replication of rat coronavirus in a rat cell line,LBC

Summary Rat coronavirus readily propagated and induced marked cytopathic effect in a rat cell line, LBC cell culture, which provided a sensitive, practical assay system for viral infectivity and neutralizing antibody, and a satisfactory source of the virus.With 3 Figures     

Activation of rat complement by soluble and insoluble rat IgA immune complexes

The ability of rat monoclonal IgA, specific for 2,4-dinitrophenyl (DNA), to activate the complement (C) system of the rat was investigated using aggregated IgA or IgA immune complexes (IC). IgA was coated onto a solid phase, and tested for its capacity to bind C3 upon incubation at 37 degrees C in normal rat serum (NRS) in the presence of Mg-EGTA. Binding of C3 was observed dependent on the dose of dimeric (d-), polymeric (p-) and secretory IgA tested. In contrast, little C3 fixation was observed in this system with monomeric (m-) rat IgA or with mouse m- and d-IgA (MOPC315). Soluble and insoluble rat IgA IC were prepared using dinitrophenylated rat serum albumin (DNP8RSA) as antigen (Ag), and assessed for C activation. It was shown that insoluble IC (immune precipitates; IP) containing m-, d- or pIgA of rat origin activate the alternative pathway of rat C, as demonstrated by their capacity to induce C consumption in NRS in the presence of Mg-EGTA. When p- and m-IgA IP were compared for their capacity to activate C, it was found that p-IgA activated C four times as efficiently as m-IgA IP (at 2 mg/ml). Soluble rat IgA IC were prepared in an excess of DNP8RSA, fractionated by gel filtration on Sepharose 6B, and analyzed for C activation and antibody (Ab)/Ag ratio. In contrast to m-IgA IP, soluble m-IgA did not activate C. On the other hand soluble d-IgA IC activated C dependent on their concentration and size: at a concentration of 0.1 mg/ml high-molecular weight d-IgA IC with a high Ab/Ag ratio were four times as efficient as low-molecular weight IC with a low Ab/Ag ratio, and twice as efficient as IP prepared at equivalence. To demonstrate the induction by IgA of the assembly of the terminal membrane attack complex, trinitrophenyl (TNP)-conjugated rat red blood cells (TNP-RRBC) coated with d- or p-IgA were shown to be lysed in NRS in the presence of Mg-EGTA. No lysis of m-IgA-coated TNP-RRBC was observed. The results in this study demonstrate that both soluble and insoluble rat IgA IC activate the alternative pathway of homologous rat C. Alternative pathway activation by soluble rate IgA IC is dependent on the size of the IC. The degree of polymerization of the IgA Ab itself also influences C activation.     

青老年大鼠脑缺血模型的比较

背景：大鼠具有成本低,种系内纯合性好,脑血管解剖特性与人类相似等特点,是目前脑缺血研究最常用的实验动物。 目的：观察青老年大鼠大脑中动脉梗死后的行为学变化,分析年龄对脑缺血的影响。 方法：将青、老年SD大鼠随机分为青、老年假手术组,青、老年模型组(同侧颈总动脉永久结扎大脑中动脉线栓法制备大脑中动脉梗死模型)4组。 结果与结论：老年假手术组体质量低于青年假手术组(P < 0.05),但高于老年模型组(P < 0.05),老年模型组体质量低于青年模型组(P < 0.05)。术后第1,3,5,7天老年模型组改良神经功能损害程度评分高于青年模型组(P < 0.05);与青年模型组及青、老年假手术组比较,术后第3,8,12周老年模型组逃避潜伏期明显延长,跨过平台所在位置的次数明显减少(P < 0.05)。表明在同等缺血打击下,老龄鼠脑缺血模型缺血损伤重、修复能力低,其神经功能恢复、学习和记忆能力明显逊于青年大鼠,提示增龄因素是研究脑缺血后神经损伤的重要影响因素之一。 关键词：大脑中动脉梗死;动物模型;改良神经损害程度评分;学习;记忆;组织构建实验造模  doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.11.024