水稻(Oryza sativa L.)捕光叶绿素a/b结合蛋白基因全长cDNA的克隆和特性分析

根据捕光叶绿素a/b结合蛋白基因（cab）家族中的保守序列设计PCR引物,扩增出的约310 bp cDNA小片段为分子杂交探针,对构建的水稻cDNA文库进行杂交筛选,并结合PCR分析确定阳性克隆中cDNA片段的大小。通过对插入的cDNA片段最长的阳性克隆进行测序分析验证,克隆了水稻中1个cab基因全长cDNA,命名为cab-n8（GenBank登记号：AY     

枸杞中番茄红素β-环化酶基因(LycB)的分离

以宁夏枸杞叶片为材料,采用异硫氰酸胍—酚—氯仿法提取完整的总RNA,利用PolyATract mRNA Isolation System(Promega公司)分离mRNA,然后利用Universal Riboclone RcDNA Synthesis System(Promega公司)合成双链cDNA,在cDNA末端连接上EcoRⅠ接头,并与λExCell载体连接,利用Packagene Lambda DNA Packaging System进行包装,在国内外首次构建出滴度为2.78×105 pfu/ml,重组效率为88.1%的枸杞叶片cDNA文库。用Digoxigenin(DIG)标记龙胆草LycB探针,并对枸杞叶片cDNA文库进行筛选,获得5个LycB cDNA阳性克隆。释放质粒后,进行酶切鉴定,LycB阳性克隆cDNA插入片段的大小为2.1kb左右。为利用基因工程手段来调控类胡萝卜素的生物合成奠定了基础。     

甘蓝KAPP编码基因的克隆与序列分析

采用PCR、RT-PCR及其他分子生物学方法,以甘蓝基因组DNA、花蕾RNA和叶片RNA为模板,分别对甘蓝KAPP gDNA和KAPP cDNA进行扩增,分别获得3247bp的KAPP gDNA片段、1699bp的KAPP cDNA片段、1578bp的花蕾KAPP2 cDNA片段和1581bp的叶片KAPP2cDNA片段。对克隆的甘蓝KAPP gDNA和cDNA(结合报道的KAPPcDNA)进行比对表明,甘蓝KAPP基因包含11个内含子,均符合"GU-AG"剪接规则,并且克隆得到的KAPP cDNA序列与报道的KAPP cDNA序列有6处单个碱基的差异,但两者的氨基酸序列完全一致。然而花蕾KAPP2 cDNA、叶片KAPP2 cDNA片段与报道的KAPP cDNA序列相似性分别为85.2%和85.0%。这两个序列分别在590bp和593bp处较早出现一个无义突变引起的终止密码子。Blast分析表明,两基因编码的氨基酸序列与拟南芥KAPP氨基酸序列相似性最高,其次为甘蓝KAPP氨基酸序列。以已报道的8种植物KAPP的CDS及本实验所克隆的两个KAPP2序列构建分子进化树,获得序列与甘蓝KAPP序列聚为一支。结合比较作图及分子进化树,推测KAPP基因在甘蓝基因组上有两个拷贝,而笔者克隆到的KAPP2 cDNA序列是其中一个拷贝,是KAPP进化过程中突变失活的拟基因。     

陆地棉体细胞胚胎发生过程中的mRNA差异显示分析

以未经诱导的棉花下胚轴、经愈伤诱导10d的下胚轴和胚性愈伤组织为材料,利用差异显示反转录 PCR(DDRT PCR)技术对陆地棉体细胞胚胎发生过程中的cDNA差异表达进行了初步研究。反转录获得cDNA第一链,经3个锚定引物和随机引物的DDRT PCR,产物经测序胶电泳分离,共得到约200个差异表达cDNA片段,其中51个为陆地棉胚性愈伤组织所特有,从中还获得相关基因上游或下游的调控系列,从其中一个样品中可成功分离、克隆24个cDNA片段。经Northern杂交验证,从获得的差异片段中找到了一个能稳定出现的阳性cDNA片段,该片段仅出现在胚性愈伤组织阶段。对该片段进行克隆、测序和序列同源性分析,发现该片段是一个功能未知的cDNA片段。     

白菜低温要求型晚抽薹性的相关序列克隆与分析

为了阐明低温要求型晚抽薹的分子机制,本研究利用易抽薹大白菜BY和晚抽薹芜菁"M.M"杂交获得的81个DH系群体为试材,从中选择了6个极早抽薹和6个极晚抽薹的株系分别组成早抽薹池和晚抽薹池.以两池和双亲为样本,以无低温和3～5℃处理25 d后获得的mRNA为模板,反转录为cDNA,利用256对AFLP引物组合进行cDNA-AFLP分析,筛选与晚抽薹性相关的特异片段.对其中3条差异表达、且丰度较高的cDNA片段进行了克隆测序.序列测定和Blast分析表明,p65m47 cDNA片段与C2结构域蛋白基因有80%的同源性,期望值为7e-17,C2结构域蛋白在细胞的信号转导中起着很重要的作用;p66m55 cDNA I片段与拟南芥AT1G32530 cDNA有85%的同源性,期望值为5e-36,它编码蛋白结合位点/泛素连接酶/锌指结合蛋白;p66m55 cDNA Ⅱ片段与拟南芥AT1G65590 cDNA有87%的同源性,期望值为4e-37,它编码B-N-乙酰已糖胺水解酶.     

用mRNA差别显示方法分析黑麦盐胁迫下应答基因cDNA片段的表达特性

利用mRNA差别显示方法分析经250mmol/LNaCl处理3d的黑麦幼苗,14个差异cDNA片段,包括8个诱导表达片段,2个增强表达片段和4个抑制表达片段被检测到.NorthernBlot分析证实,其中0.8kb、0.65kb和0.35kbcDNA片段有强烈阳性信号,命名为SI800、SI650、SI350(SaltInduced800bp、650bp、350bp),证明与盐胁迫有关.以SI800为探针与分别经     

利用DDRT-PCR鉴定芸芥自交不亲和系与自交亲和系的差异表达cDNA（英文）

芸芥与芸薹属植物具有亲缘关系,也是芸薹属植物的重要育种资源。自交亲和性是芸芥的一种重要变异性状。为了探明芸芥自交亲和基因的表达器官,并分离与自交亲和性有关的cDNA片段,以芸芥的一对近等基因系,自交亲和系(SC)与自交不亲和系(SI)为试材,利用差异显示RT-PCR技术分别对开花前和开花后的叶片、花药和柱头进行鉴定。结果表明,不论开花前还是开花后,芸芥自交亲和系与自交不亲和系的叶片或花药间的扩增带型是一样的,但在近等基因系的柱头间得到了差异表达条带。这证明芸芥自交亲和基因不是组成型表达,而是组织特异性表达,柱头是其唯一的表达器官。在开花前的自交亲和系中共得到了2条cDNA片段,一条小于100 bp,另一条为750~1 000 bp,在开花后的自交亲和系中得到了1条300 bp的cDNA片段。据分析这3条cDNA片段可能与芸芥的自交亲和性密切相关。在开花前的自交不亲和系中共得到了2条cDNA片段,一条为500 bp,另一条为750 bp,同时在开花后的自交不亲和系中得到了1条500~600 bp的cDNA片段。这些cDNA片段可以用来区分芸芥的自交亲和系与自交不亲和系,还可用于克隆自交亲和基因。     

3种槭属植物秋季叶色时序性变化规律

为评价槭树秋季叶色的观赏性，以紫花槭、白牛槭、拧筋槭3种槭树叶片为试验材料，对其变色期的叶片形态特征、叶色时序性变化及叶色参数进行观测和分析。结果表明，3种槭树的叶片形态特征（叶长、叶宽、叶片长/宽、叶周长、叶面积）存在显著差异。白牛槭和拧筋槭的叶片形态相似；拧筋槭的叶面积最大，紫花槭最小。叶片周长由大到小为白牛槭>紫花槭>拧筋槭。3种槭树进入观赏期的时间为9月末—10月末。拧筋槭的观赏期最长；白牛槭秋季叶色变化最为丰富，最具观赏性。叶色参数L*和b*都呈现出先升高后降低的变化趋势，叶色参数a*呈现出逐渐上升的变化趋势，与叶色的变化一致。     

黄瓜果实CsEXP5基因片段的克隆与序列分析

以授粉后黄瓜幼果组织的总RNA为模板,利用简并引物,采用RT-PCR方法扩增出1条长度为480 bp的cD-NA片段。序列分析结果表明,该cDNA片段与来源于黄瓜根组织的CsEXP5片段序列(AF319471)同属一个基因,序列拼接后得到526 bp的cDNA序列。预测的CsEXP5蛋白具有一系列保守的Trp残基和HFD,KNFRV保守域。该蛋白属于α-扩张蛋白,与CsEXP10蛋白的同源性高达90%。该基因首次从黄瓜幼果中得以克隆,可能与黄瓜果实膨大生长有一定关系。     

苎麻雄性不育相关基因atp6和atp9 RNA干扰载体的构建

植物线粒体基因缺陷是细胞质雄性不育的主要原因。为了获得苎麻atp6和atp9基因RNA干扰(RNAi)表达载体,根据已报道的苎麻atp6和atp9基因序列设计引物,利用RT-PCR克隆了atp6和atp9基因的部分cDNA片段,将目的基因正反向片段连接入RNAi载体pHANNIBAL,再将其表达框连入表达载体pCAMBIA 1300。结果表明,所克隆的cDNA片段经序列比对后确认为目的基因片段,经酶切和测序验证确认完成了atp6和atp9基因RNAi载体pCAM-6SR和pCAM-9SR的构建。atp6和atp9基因RNAi载体是验证苎麻雄性不育的基础,也为苎麻遗传工程改良奠定了技术基础。     

苎麻雄性不育相关atp6和atp9基因RNA干扰载体的构建

植物线粒体基因缺陷是细胞质雄性不育的主要原因。为了获得苎麻atp6和atp9基因RNA干扰(RNAi)表达载体,根据已报道的苎麻atp6和atp9基因序列设计引物,利用RT-PCR克隆了atp6和atp9基因的部分cDNA片段,将目的基因正反向片段连接入RNAi载体pHANNIBAL,再将其表达框连入表达载体pCAMBIA 1300。结果表明,所克隆的cDNA片段经序列比对后确认为目的基因片段,经酶切和测序验证确认完成了atp6和atp9基因RNAi载体pCAM-6SR和pCAM-9SR的构建。atp6和atp9基因RNAi载体是验证苎麻雄性不育的基础,也为苎麻遗传工程改良奠定了技术基础。     

几种槭属植物亲缘关系的ITS序列分析

本文对槭属植物的8个种(含变种)核糖体 DNA 内转录间隔区(ITS)序列进行了PCR扩增和序列分析,扩增出约750bp左右的的序列(包含完整的ITS1、5.8S和ITS2序列及部分18S和26S rRNA基因片段。各样品的 ITS1长度为221~236 bp,ITS2 为 231~237 bp,含有多个特异性信息位点。并利用 ITS 序列为依据对8种槭属植物系统发育进行分析,从分子水平上阐明了8种槭属植物的亲缘关系,为挪威槭嫁接生产中适宜砧木的选择提供了理论依据。     

粉花石榴二氢黄酮醇还原酶基因cDNA片段的分离及鉴定

为了研究二氢黄酮醇还原酶（DFR）在石榴花色形成中的作用,根据GenBank中登录的相关物种DFR基因的保守序列设计简并引物,采用RT-PCR方法,从‘重瓣粉花’石榴花瓣总RNA中扩增出cDNA片段。测序结果表明,该cDNA片段长446 bp,编码148个氨基酸,序列分析表明,该片段与蓝灰石竹、水蓼、苦荞麦、荞麦、甜樱桃、金荞麦、菠菜、马六甲葡萄、山葡萄、马蹄纹天竺葵、仙客来等物种的氨基酸同源性在78%~81%以上,存在一个底物结合特异性决定的氨基酸基序“TVNVQPVQRPVHDETSWSDLDFVWAT”,说明已成功克隆到‘重瓣粉花’石榴DFR基因的cDNA片段,在GenBank中登录号为JN381544。     

K+通道基因MIRK在网纹甜瓜植株中的表达分析

在网纹甜瓜(Cucumis melovar.reticulatus Naud.)叶片中克隆了一个cDNA片段,片段长1 330 bp。这段cDNA序列及由此推测的氨基酸序列分析和多序列比对表明扩增的片段是编码K 通道MIRK(Melon Inward Rectifying K Channel)基因的5′端。由此cDNA片段推测的氨基酸序列包含了6个跨膜片段S1到S6,其间有一个对离子选择性有重要作用的特征序列结构GYGD(Gly-Tyr-Gly-Asp)。进化树分析显示MIRK属于KAT1亚家族,和在葡萄叶片中克隆的K 通道SIRK最相近。半定量RT-PCR试验表明,MIRK在甜瓜植株中根、茎、叶、花、果实等各器官中均有表达,主要在叶片和初期发育的果实中表达,在雌花和茎中也有表达,在根中的表达量最低。MIRK在甜瓜不同器官中的表达模式显示MIRK可能在甜瓜植株发育过程中起重要作用。     

棉蚜羧酸酯酶同工酶cDNA片段的基因克隆与序列分析

采用简并引物和降落PCR技术,克隆了棉蚜2个羧酸酯酶同工酶基因的cDNA片段,分别命名为Ag.est1和Ag.est2。其中Ag.est1为479bp,编码160个氨基酸;Ag.est2为476bp,编码159个氨基酸。序列同源分析表明,PCR扩增获得的Ag.est1和Ag.est2基因与其他昆虫的羧酸酯酶具有较高的相似性。2个羧酸酯酶同工酶基因cDNA片段的GeneBank登录号分别为:AF502083、AF502084。     

利用 DDRT-PCR 鉴定芸芥自交不亲和系与自交亲和系的差异表达 cDNA

芸芥与芸薹属植物具有亲缘关系，也是芸薹属植物的重要育种资源。自交亲和性是芸芥的一种重要变异性状。为了探明芸芥自交亲和基因的表达器官，并分离与自交亲和性有关的 cDNA 片段，以芸芥的一对近等基因系，自交亲和系（SC）与自交不亲和系（SI）为试材，利用差异显示 RT-PCR 技术分别对开花前和开花后的叶片、花药和柱头进行鉴定。结果表明，不论开花前还是开花后，芸芥自交亲和系与自交不亲和系的叶片或花药间的扩增带型是一样的，但在近等基因系的柱头间得到了差异表达条带。这证明芸芥自交亲和基因不是组成型表达，而是组织特异性表达，柱头是其唯一的表达器官。在开花前的自交亲和系中共得到了2条 cDNA 片段，一条小于100 bp，另一条为750～1000 bp，在开花后的自交亲和系中得到了1条300 bp 的 cDNA 片段。据分析这3条 cDNA 片段可能与芸芥的自交亲和性密切相关。在开花前的自交不亲和系中共得到了2条 cDNA 片段，一条为500 bp，另一条为750 bp，同时在开花后的自交不亲和系中得到了1条500～600 bp 的 cDNA 片段。这些 cDNA 片段可以用来区分芸芥的自交亲和系与自交不亲和系，还可用于克隆自交亲和基因。     

龙血树血竭生物合成相关基因分离与分析

龙血树是热带、亚热带地区所特有的珍稀植物,是著名民间药物“血竭”的重要原料。该药在我国中药材市场中占有重要的地位。目前血竭的生产是从多年生的龙血树上取其带脂茎杆提炼而成,该法需要大量的原材料,不断的砍伐已使其资源面临枯竭的威胁,现其己被列为国家三级保护的濒危植物。如何有效地开发和利用龙血树这一宝贵的资源,使其得到可持续和高效的利用是目前研究的一个重要方向。本研究以经诱导物诱导处理刚产生血竭和未经诱导物处理的海南龙血树（Dracaena cambodiann Pierre ex Gagnep）组培苗为材料,利用抑制消减杂交（supression subtractive hybridization,SSH）技术构建了龙血树血竭生物合成相关基因的差减cDNA文库,采用PCR方法筛选差减文库获得431个重组子。随机挑取200个克隆经Reverse Northern Blot筛选剔除假阳性后,共获得59个差异较明显的阳性克隆,测序后得51条差异片段,通过BLASTn和BLASTx进行比较分析,结果表明：分离到与信号转导相关的cDNA片段5个,转录翻译相关蛋白cDNA片段5个,物质能量代谢酶类cDNA片段12个,另外有23个克隆在GenBank中均未发现显著相关的同源序列,推测它们可能是功能未知的新基因或是靠近3--末端的基因片段,因保守性较低,难以通过同源比较推测其功能。     

巴西橡胶树SNARE蛋白全长cDNA克隆及其序列特征分析

从巴西橡胶树Hevea brasiliensis差减cDNA文库中筛选到一个与SNARE蛋白同源性较高的基因片段,根据其序列信息设计特异引物, 采用cDNA末端快速扩增技术RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）进行差异片段的5’和3’端的扩增,获得了长度为1 070 bp的全长cDNA克隆R295。序列分析表明该基因包含600 bp的开放阅读框,5’-UTR为93 bp, 3’-UTR为377 bp,编码199个氨基酸。该基因编码的蛋白具有一个SNARE coiled-coil保守区、一个典型的VAMP基元及一个羧基端的CAAX基元。同源分析表明该蛋白属于一类特殊的longins蛋白。RT-PCR检测表明它在胶乳中特异表达,在叶中没有表达。     

木薯干旱胁迫下离区发育相关基因MeAP2-2酵母单杂交文库构建及其上游调控基因的筛选

为了研究干旱胁迫下调节木薯叶片脱落相关的重要节点基因及其分子调控网络,以‘华南5号’木薯为实验材料,通过采用酵母单杂交筛选系统,将MeAP2-2启动子中激素与胁迫相关的元件串联后整合入酵母染色体,构建诱饵菌株;采用SMART技术进行离区cDNA文库的构建,将离区cDNA与pGADT7-Rec表达载体共同转化诱饵菌株,通过同源重组在酵母细胞内筛选MeAP2-2的上游转录调节因子;利用酵母菌落PCR法获得阳性克隆中的cDNA插入片段,测序后在JGI网站进行Blast分析。结果表明,构建的cDNA文库库容为1.5×106,插入片段大小为250~3000 bp。cDNA 插入片段经测序和Blast同源性分析和定量PCR分析,筛选出1个Metallothionein protein,1个Core histone protein,1个Heavy-metal-associated protein与MeAP2-2相关的调节因子。实验结果证明酵母单杂交文库构建成功,初步筛选获得了调节MeAP2-2的上游调节因子。为研究木薯干旱胁迫下离区发育的信号转导通路奠定了基础。     

小麦脂质转运蛋白cDNA结构及相应肽链构造特征的分析

根据测序获得的1条261 bp cDNA片段,通过电子延伸、设计引物,从小麦Mardler/7*百农3217(Pm2)的cDNA中扩增获得1条651 bp的cDNA片段,通过同源比对发现其包含小麦LTP1 完整的编码序列.该片段包含基因的5'非翻译区42 bp,3'非翻译区261 bp,开放阅读框348 bp,编码115个氨基酸.预计蛋白的分子量为11.2 kD,等电点为9.46.此基因有8个位置保守的半胱氨酸(C)残基及25个氨基酸的信号肽,为典型的植物脂质转运蛋白基因.其基因序列数据库(GenBank)登录号为AY796184(基因)和AAV65513(蛋白).通过疏/亲水性分析,发现肽链分子具有较大范围的疏水面.