短发卡状RNA抑制AKT2基因表达增强卵巢癌细胞对紫杉醇敏感性的研究

目的：构建AKT2基因特异性短发卡状RNA（shRNA）真核表达载体，观察RNA干扰（RNAi）技术，对人卵巢癌A2780和SKOV3细胞中AKT2蛋白激酶表达的抑制作用，并探讨其促进细胞凋亡的机制。方法：运用基因工程技术，设计合成针对AKT2mRNA的特异性shRNA，构建真核表达载体pAKT2-shRNA。将pAKT2-shRNA经脂质体（Lipofectamine^TM 2000）包裹转染人卵巢癌A2780和SKOV3细胞，荧光显微镜观察细胞内DsRed红色荧光蛋白的表达，计算转染效率，半定量RT—PCR（Semi-quantitative RT-PCR）、蛋白质免疫印迹（Western blot）检测AKT2的表达及干扰效率，流式细胞学检测法（FACS）检测细胞凋亡率，比较抑制AKT2基因前后卵巢癌细胞抵抗凋亡能力。结果：成功构建了PAKT2-ShRNA载体。A2780和SKOV3细胞转染pAKT2-shRNA后，荧光显微镜下观察转染效率约40％；Semi-quantitative RT-PCR和Western blot检测结果示，转染后AKT2 mRNA和蛋白表达均显著降低。FACS检测结果显示，转染pAKT2-shRNA后，紫杉醇25nmol／L处理细胞12h，与空白对照组和阴性对照组相比，细胞凋亡率显著增加，P〈0．05。结论：构建的pAKT2-shRNA真核表达载体能有效抑制AKT2基因表达；运用RNAi技术，降低卵巢癌细胞中AKT2基因表达水平，能增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，促进肿瘤细胞凋亡。     

STAT5A基因表达对人肝癌HepG2细胞增殖和凋亡影响的观察

目的:研究抑制STAT5A基因的表达对人肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响,为其作为肝癌基因治疗的新分子靶点提供实验依据,并对RNAi实验方法的优化进行探讨.方法:构建2个针对STAT5A基因不同位点的RNA干扰(RNAi)真核表达载体,为减少脱靶效应和细胞毒性,采用两载体共转染的方法转染人肝癌细胞HepG2,分别采用半定量RT-PCR、蛋白质印迹法检测转染前后细胞中STAT5A mRNA和蛋白表达的变化;采用MTT法检测细胞增殖情况;流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果:酶切及测序结果显示,STAT5A基因两位点的shRNA表达载体均构建成功;两载体共转染HepG2细胞48 h后,与对照组相比,RT-PCR结果显示实验组细胞中STAT5A mRNA的抑制率约为66％,P＜0.05;蛋白质印迹法检测结果显示,STAT5A蛋白的抑制率约为58％,P＜0.05;同时MTT法显示实验组较对照组在转染后24～96 h内细胞生长速度减慢、增殖抑制明显(P＜0.05),流式细胞仪检测实验组细胞凋亡率为(34.68±0.78)％,明显高于阴性对照组(5.12±1.09)％和空白组(4.75±1.65)％,P＜0.05.结论:成功构建了针对STAT5A基因的RNA干扰真核表达载体,两载体共转染可有效抑制STAT5A基因的表达,并能抑制细胞生长、诱导细胞凋亡.     

抑制Bcl-2基因表达增强非小细胞肺癌NCI-H460细胞放射敏感性的研究

背景与目的:Bcl-2基因是一种重要的抑制细胞凋亡的基因,广泛存在于各种肿瘤细胞中.本研究利用短发夹RNA(shRNA)重组质粒抑制Bcl-2基因的表达,观察其对非小细胞肺癌NCI-H460的细胞凋亡和放射敏感性变化的影响.方法:将特异性抑制Bcl-2基因表达的干扰质粒Bcl-2/shRNA稳定转染NCI-H460细胞,获得H460-RNAi细胞,同时设转染含无义序列Neg-shRNA质粒的H460-Neg细胞及未转染的H460细胞为对照组,采用Western blot法,观察Bcl-2基因在蛋白表达水平的变化;X射线照射后,采用细胞形态学及克隆形成实验,检测RNA干扰对NCI-H460细胞凋亡和放射敏感性的影响.结果:H460-RNAi细胞的Bcl-2蛋白表达较对照组明显降低(P<0.05);H460-RNAi细胞的凋亡率[(10.8±0.7)%]明显高于对照组(P<0.05),4 Gy X线照射48 h后的凋亡率[(24.9±1.4)%]明显高于对照组(P<0.05)及未照射组(P<0.05):H460-RNAi细胞的存活参数D0、Dq、N和SF2值分别为0.97、0.75、2.18和0.26,均低于其余两组,而H460细胞组与H460-Neg细胞组比较差异无统计学意义(分别为1.39、1.39、2.72、0.52和1.21、1.28、2.87、0.46).结论:Bcl-2/shRNA重组质粒可以有效抑制非小细胞肺癌NCI-H460细胞的Bcl-2基因的表达,增强NCI-H460的细胞凋亡及放射敏感性.     

靶向SATB1基因的短发夹RNA诱导肺癌A549细胞凋亡

目的:探讨靶向SAT B1(special AT-rich sequence-binding protein-1)基因的短发夹RNA (short hairpinRNA,shRNA)对肺癌A549细胞凋亡的影响及其可能的机制.方法:构建靶向SATB1基因的shRNA重组质粒SATB1-shRNA,采用脂质体法将其转染至A549细胞;分别采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测A549细胞中SATB1、Bcl-2、Bax mRNA和SATB1、Bcl-2、Bax、caspase 3蛋白的表达水平FCM检测A549细胞的凋亡率.结果:成功构建了SATB1-shRNA重组质粒;SATB1-shRNA转染A549细胞后,SATB1、Bcl-2 mRNA及其蛋白表达下调,Bax mRNA和Bax、caspase 3蛋白表达上调(p＜0.05).SATB1-shRNA转染组细胞凋亡率[(14.18±1.59)％]较对照组[(1.84±0.57)％]明显增加(P＜ 0.01).结论:SATB1-shRNA可显著下调肺癌A549细胞中SATB1基因的表达水平并诱导细胞凋亡,其机制可能与下调Bcl-2基因表达所引起的级联效应有关.     

靶向EGFR基因的短发夹RNA对A549细胞生长及药物敏感性的影响

背景与目的已证实非小细胞肺癌中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的过度表达和活化与肿瘤分期、放化疗敏感度下降密切相关.许多阻滞和下调EGFR的方法被用来抑制肿瘤增殖以改善预后,EGFR目前成为公认的肿瘤基因治疗的重要靶点.本研究采用靶向EGFR的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达重组质粒,观察能否在人肺腺癌细胞株A549细胞中引发RNA干扰(RNAi)效应及其对A549细胞生长及药物敏感性的影响.方法构建靶向EGFR的shRNA重组质粒(pShEGFR)和非特异性的shRNA重组质粒(pShNEG),阳离子脂质体将其转染至肺腺癌A549细胞分别命名为A549/pShEGFR、A549/pShNEG和对照组A549,免疫荧光和Western blot法检测转染后细胞中EGFR表达变化;克隆形成实验观察细胞生长变化;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡;MTT法检测细胞对顺铂、多柔比星、紫杉醇的敏感性.结果与对照组A549细胞和A549/pShNEG相比,A549/pShEGFR可显著抑制A549细胞中EGFR表达,转染后第6天抑制率达74.1%(P＜0.01);A549/pShEGFR组细胞克隆形成抑制率为62.8%.与对照组A549细胞和A549/pShNEG相比,A549/pShEGFR组细胞阻滞在G0/G1期(63.2±1.1,64.5±1.4 vs.74.2±0.8;P＜0.01),凋亡细胞比例显著增加(5.8±1.4,7.7±1.2 vs.25.6±1.2;P＜0.01);与A549组相比,A549/pShEGFR可将A549细胞对顺铂、多柔比星、紫杉醇的敏感性分别提高6.7、5.5、6.6倍.结论瞬时转染靶向EGFR基因的shRNA表达重组质粒能够通过下调EGFR蛋白水平抑制肺腺癌A549细胞生长,并提高细胞对不同化疗药物的敏感性.     

蛋白激酶B抑制线粒体Smac释放与卵巢癌顺铂耐药的关系

目的 探讨蛋白激酶B(Akt)和线粒体促凋亡蛋白(Smac)在顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡中的关系及Akt在卵巢癌顺铂耐药中的分子机制.方法 应用Western blot检测顺铂作用前后卵巢癌顺铂敏感细胞OV2008、A2780s和顺铂耐药细胞C13*、A2780cp中Smac含量.将Smac siRNA和Smac N7多肽分别导人0V2008和C13*细胞中,应用流式细胞仪测定细胞的凋亡率,观察稳定转染Akt2的A2780s(A2780s-AAkt2)细胞和转染Akt1/2siRNA的C13*细胞对顺铂耐药性的改变.结果顺铂能导致OV2008、A2780s细胞线粒体释放Smac,并引起细胞凋亡(P＜0.05);但在C13*和A2780cp细胞中无此反应(P＞0.05).转染Smac siRNA后的0V2008细胞,其Smac表达降低,对顺铂的耐药性增加;转染Smac N7多肽能增加C13*细胞对顺铂的敏感性;Akt2过度表达可抑制A2780s细胞Smac释放,并对顺铂产生了耐药性;应用Akt1/2 siRNA后可下调C13*细胞中Akt1/2的表达,使C13*细胞对顺铂的敏感性增加.结论 顺铂对卵巢癌细胞的杀伤在一定程度上是通过线粒体释放Smac所致;Akt抑制了线粒体Smac释放与卵巢癌化疗耐药部分相关.     

survivin基因RNA干涉对宫颈癌细胞凋亡和放射敏感性的影响

目的：观察survivin基因siRNA干涉对宫颈癌细胞HeLa凋亡和放射敏感性的影响。方法：通过脂质体介导将含人survivin基因siRNA的重组真核表达质粒pSilencer2.1-s2转染宫颈癌细胞系HeLa,G418筛选阳性克隆,半定量PCR、Western blot分别检测survivin mRNA和蛋白表达,激酶活性检测法测定半胱氨蛋白水解酶-3(caspase-3)活性变化,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,平板克隆形成实验、多靶单击模型拟合细胞存活曲线观察细胞放射敏感性变化。结果：G418筛选形成稳定转染阳性克隆,建立了3组稳定转染细胞系：HeLa-s2(转染重组质粒pSileneer2.1-s2)、HeLa-NC(转染阴性对照质粒pSi- lencer2.1-NC)和HeLa-U6 neo(转染空载质粒pSileneer2.1-U6 neo)。经与HeLa-NC、HeLa-U6 neo和未转染HeLa细胞比较,HeLa-s2 survivin mRNA和蛋白表达明显下降,与HeLa细胞相比,表达抑制率分别为：62.8%和60.1%；caspase-3激酶活性增强,D_(405)达1.26±0.04(P＜0.05)；细胞凋亡率为：(29.2±1.4)%,明显升高(P＜0.05)；同一剂量X线照射下,平板克隆形成率显著降低(P＜0.05)；细胞存活曲线显示：D_0、D_q值显著下降,分别为：3.15、1.21(P＜0.05),放射增敏比分别为：2.01 (D_0值比)、1.77(D_q值比)。结论：survivin基因siRNA干涉可通过阻抑HeLa细胞中survivin表达,增强caspase-3激酶活性,诱导细胞凋亡,并显著提高细胞的放射敏感性。     

RNAi抑制Survivin基因表达对宫颈癌SiHa细胞放射敏感性的影响

目的通过RNA干扰技术抑制宫颈癌SiHa细胞中Survivin基因的表达,观察其对X线敏感性的变化.方法构建Survivin短发卡RNA表达质粒pSurvivin-shRNA并转染入宫颈癌SiHa细胞,RT-PCR及Western印迹法分别检测Survivin mRNA及蛋白的表达情况,激酶活性检测法测定caspase-3活性变化,流式细胞仪法检测细胞凋亡率,克隆形成实验检测转染细胞放射敏感性的变化.结果与未转染细胞和转染阴性质粒细胞(SiHa/pNeg-shRNA细胞)相比,转染pSurvivin-shRNA质粒的SiHa细胞(SiHa/pSurvivin-shRNA细胞)中Survivin mRNA和蛋白表达明显下降;caspase-3活性明显增强,D405达1.34±0.05(P＜0.05);8 Gy的X线照射24 h和48 h后,SiHa/pSurvivin-shRNA细胞的凋亡率分别为(5.13±0.81)%和(11.27±1.89)%,明显高于SiHa/pNeg-shRNA细胞和未转染细胞(P＜0.05);克隆形成实验结果显示SiHa/pSurvivin-shRNA细胞的成克隆能力明显下降,对X线的敏感性明显增加.结论短发卡状RNA干扰技术阻抑宫颈癌SiHa细胞中Survivin基因的表达,增强caspase-3活性,可诱导细胞凋亡并促进SiHa细胞对X线的敏感性.     

EZH2基因沉默对人脑胶质瘤U251细胞增殖和凋亡影响的研究

目的:研究RNA干扰技术抑制zeste基因增强子人类同源物2(EZH2)的表达对人胶质瘤U251细胞增殖及凋亡的影响.方法:构建靶向EZH2基因的shRNA质粒并转染至U251细胞中,采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测EZH2 mRNA和蛋白的表达情况,利用四甲基偶氮哇盐(MTT)实验和Annexin V-FITC/PI流式细胞术实验观察转染后U251细胞增殖和凋亡情况.结果:靶向EZH2基因的shRNA质粒成功抑制了U251细胞EZH2基因的表达,mRNA和蛋白表达抑制率分别为56.00％和88.73％;转染shRNA EZH2后,U251细胞的生长受到明显抑制(P＜0.01),在转染96 h后,生长抑制率达35.79％;转染48 h后,U251细胞早、晚期凋亡率分别为(26.59±0.83)％和(38.63±0.80)％,较阴性质粒组和空白对照组均增加,以晚期明显,差异有统计学意义,P＜0.01.结论:EZH2基因的沉默能有效抑制胶质瘤U251细胞的增殖、促进其凋亡,提示EZH2可能成为胶质瘤基因治疗的新靶点.     

干扰GTPBP4基因对食管癌EC9706细胞放射敏感性影响

目的 探讨沉默GTPBP4基因对人食管癌EC9706细胞系放射敏感性影响。方法 通过GEO数据库分析食管癌患者组织中GTPBP4的表达情况。利用重组质粒载体介导的RNA干扰(RNAi)技术转染食管癌EC9706细胞系,使细胞中GTPBP4基因沉默,观察GTPBP4基因沉默对EC9706细胞增殖、凋亡及放射敏感性影响。通过qRT-PCR和蛋白质印迹法评估基因沉默效果及检测凋亡相关蛋白表达。应用MTT法检测转染后细胞的增殖变化。采用流式细胞术检测干扰GTPBP4基因表达后细胞凋亡变化。应用克隆形成实验检测细胞照射后放射敏感性变化。结果 GEO数据库分析表明GTPBP4基因在人食管癌组织中的表达明显高于正常邻近食管组织(P<0.001)。与空白对照组和阴性对照组相比,干扰组EC9706细胞的GTPBP4 mRNA及蛋白表达水平明显下降(均 P<0.001),表明质粒成功转染EC9706细胞。MTT检测结果显示干扰组EC9706细胞增殖率受到显著抑制(P<0.001)。流式细胞术结果显示干扰组EC9706细胞凋亡率明显升高(P<0.001),细胞凋亡明显增加(P<0.001);凋亡相关蛋白(Cleaved caspase-9、Cleaved caspase-3、Bax)表达明显升高,抗凋亡蛋白(Bcl-2)表达下降(P<0.001、P=0.001、P=0.0014、P=0.005)。克隆形成实验结果显示干扰组EC9706细胞放射增敏比1.716。结论 GTPBP4基因在人食管癌组织中高表达,RNAi技术可有效抑制EC9706细胞GTPBP4基因表达,从而抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、增强细胞对放射线的敏感性。     

仙人掌原液毒性的初步研究

背景与目的： 研究仙人掌原液的毒性。 材料与方法： 小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、大鼠30 d喂养试验。 结果： 仙人掌原液雌、雄小鼠LD50均大于20.0 g/kg,属无毒物质;Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性;大鼠30 d喂养试验结果显示该样品30 d喂养对大鼠各项观察指标未见毒性作用。结论： 在本次实验条件下,仙人掌原液为无毒物质,未显示有遗传毒性和亚急性毒性作用。     

食管平滑肌瘤10例临床治疗体会

我院１９７５年６月～１９９０年７月共收治食管平滑肌瘤１０例，占同期食管肿瘤总数的０．１９２％（１０／１０９２）。位于食管上段２例，中段５例，下段３例。Ｘ线食管钡餐造影是诊断本病的主要方法。行食管粘膜外肿瘤摘除９例，食管部分切除１例，效果良好。本文就其诊断与手术治疗进行了讨论。     

中晚期贲门癌148例的外科治疗

目的　总结贲门癌手术治疗影响生存率的因素 ,提供今后工作参考。方法　对 14 8例经手术治疗的贲门癌患者进行术后并发症、绝对生存率的X2 检验。结果　本组切除率为 94.5 9% ,近半胃切除占 72 .14 % ,1、3、5年生存率分别为 67.9%、45 %和 2 4.3 %。病期、外侵程度和淋巴结转移等因素对 5年生存率有显著影响 (P <0 .0 1)。术后并发症以吻合口瘘及肺癌并发症为多见 ,其发生率为 3 .6% ,手术死亡率 1.4%。结论　提高生存率的关键在于早期诊断 ,根治手术和术后积极综合治疗。     

仙人掌原毒性的初步研究

背景与目的:研究仙人掌原液的毒性。材料与方法:小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、大鼠30 d喂养试验。结果:仙人掌原液雌、雄小鼠LD50均大于20.0 g／kg,属无毒物质;Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性;大鼠30 d喂养试验结果显示该样品30 d喂养对大鼠各项观察指标未见毒性作用。结论:在本次实验条件下,仙人掌原液为无毒物质,未显示有遗传毒性和亚急性毒性作用。     

胆囊癌29例分析

目的探索胆囊癌的防治方法。方法分析29例胆囊癌病人临床资料、治疗方法及结果。结果术前诊断明确者21例，剖腹探查发现已属晚期，9例为Ⅳ期行根治术，12例为Ⅴ期未行根治术，均于术后1年内死亡。术前怀疑胆囊癌者5例，剖腹探查冰冻切片证实为Ⅴ期及Ⅳ期者各1例，Ⅴ期未行根治术，Ⅳ期行根治术，均于术后1年内死亡；Ⅲ期者3例，行胆囊癌根治术分别于术后10月、13月、17月死亡。2例术中冰冻切片发现的Ⅱ期胆囊癌，行胆囊癌根治术，分别于术后23月、26月死亡。1例意外胆囊癌属Ⅰ期胆囊癌，术后5年半死亡。结论要减少胆囊癌危害，重在及时治疗胆囊结石。     

恶性肿瘤肝转移假性肝硬化发生机制及诊疗的研究进展

随着对恶性肿瘤的深入研究,越来越多的肿瘤患者接受到更规范更多线的治疗.更多线的化疗及靶向治疗,使一部分恶性肿瘤肝转移患者的肝脏发生类似肝硬化的形态学及临床改变,称之为假性肝硬化.由于假性肝硬化罕见,对于它的认识多来自于个案报道.因此,本文通过综述国内外关于假性肝硬化的个案报道及相关研究,对其发生机制、影像学及临床表现和...     

Clinico-Pathological Study of 50 Cases of Tumours of Larynx

Otoacoustic emissions have been advocated in the management of otitis media with effusion. However, otoacoustic emissions cannot differentiate different types of hearing loss. This study was conducted to find factor that can differentiate otitis media with effusion from other common causes of hearing loss in children. Children were enrolled in the study and divided in four groups consisting of 25 ears each after pure tone and impedance audiometry: (1) Otitis media with effusion group, (2) Normal ear group, (3) Sensory-neural hearing loss group, (4) Chronic suppurative otitis media group. Otoacoustic emissions were recorded and results were analyzed statistically. The normal hearing group had significant difference from other groups but total band reproducibility of transient evoked otoacoustic emissions did not show any statistical difference in the cases groups. In distortion product otoacoustic emissions, group 1 showed significant difference from group 3 and group 1 had significant difference from all other groups at 4 kHz. The study did not find any factor that differentiates otitis media with effusion from other diseases. Although, distortion product otoacoustic emissions can indicate otitis media with effusion but impedance audiometry should be the main tool in the management of otitis media with effusion.     

Management of intracranial metastases of differentiated carcinoma of thyroid

Summary Brain metastases in differentiated carinoma of the thyroid is a rare occurrence. We treated five documented cases of carcinoma of thyroid with brain metastases out of 400 cases of thyroid cancer treated between 1972 to 1993. 4 were females out of which one was pregnant during the appearance of brain metastases. All cases were treated with thyroidectomy, and radioiodine as primary therapy. Brain metastases developed 6 months to 11 years following treatment of the primary and were treated with radiotherapy and suppressive levothyroxine. We observed the beneficial effect of suppressive thyroxine and the poor prognosis associated with pregnancy and withdrawl of thyroid replacement therapy. 3 of the 5 patients are alive 12–23 months after treatment for brain metastases, while 2 patients died at 4 months and 7 years post brain metastases due to pulmonary and hepatic failure, respectively.     

Predictors of malignant potential of cystic lesions of the pancreas

Background

Cystic lesions of the pancreas (CLP) are a diagnostic dilemma, the correct characterisation of which determines surgical management.

Methods

From 1995 to 2005, radiology and pathology records were reviewed for the presence of CLP. CLP were divided into three groups; Group 1: Benign, Group 2: Pre-malignant, and Group 3: Malignant.

Results

Seventy-nine of 121 patients were included [Group 1: n = 46, Group 2: n = 10, Group 3: n = 23], with a median age at diagnosis of 68 (31–92) years. The median follow-up period was 24 (14–84) months. On univariate analysis, female gender (p = 0.04), jaundice (p < 0.01), raised serum ALT concentration (p = 0.03), cyst size (≥2.5 cm) (p < 0.01), and biliary duct dilatation (p < 0.01) were associated with malignant potential. Benign cysts were more likely to present incidentally (p < 0.01). On multi-variate analysis, cyst size (≥2.5 cm) was an independent predictor of malignant potential. Sub-group analysis revealed that cysts < 2.5 cm in the head of the pancreas with evidence of biliary obstruction (either abnormal liver function; raised ALT [p = 0.01], ALP [p = 0.01], total bilirubin [p = 0.02], and/or biliary duct dilatation [p < 0.01]) were associated with malignant potential.

Conclusion

Cyst size ≥2.5 cm on computer tomography imaging was an independent predictor of pre-malignant and malignant pancreatic cysts. Cyst size and the presence of biliary obstruction predict potentially malignant cysts of the head of the pancreas, which require surgical management.