快速诊断性DNA测序法鉴定致病性猪链球菌

目的尝试将诊断性DNA测序方法优化后用于猪链球菌的快速鉴定。方法5个来源于临床感染病例的可疑猪链球菌分离株,用诊断性PCR产物直接测序法分析其基因组上的16SrRNA,cps2J和mrp3个特征性靶基因的DNA序列;并对整个技术流程进行优化改进,缩短获得结果的时间。结果获得了5个可疑猪链球菌菌株的3个靶基因片段的DNA碱基序列;这5个菌株被扩增检测的基因区域,有相同的16SrRNA、cps2J和mrp基因片段,长度分别为336、437、520bp;将这3个靶基因片段序列上载到NCBI-BLAST服务器,与GenBank核酸序列数据库的已知序列进行比对分析,结果显示,该5个可疑菌株的被分析的3个靶基因片段与猪链球菌2型的同源性最高。优化后的方法在得到经过适当培养的纯菌后,在不超过7～8h内,就可以获得靶基因片段的DNA测序结果。结论该5个来源于临床感染病例的可疑菌株为血清2型猪链球菌;经优化改进的诊断性DNA测序方法可用于猪链球菌的快速鉴定。     

阿萨希丝孢酵母cph1基因DNA序列分析

目的明确阿萨希丝孢酵母菌(TAS)是否存在与菌丝形成调控相关的cph1基因,分析其核苷酸序列,为进一步对其功能研究奠定基础。方法用简易微量DNA提取方法从TAS中提取细胞总DNA,根据GenBank中白色假丝酵母菌(CAL)cph1基因设计多对引物,PCR方法扩增,纯化后用ABI377核苷酸测序仪对扩增产物进行克隆测序,并对测序结果进行分析。结果在29对引物中只有1对引物从TAS中扩增出长度为827 bp的基因片段,BLAST分析表明与CAL cph1基因的同源性为97.3%。结论本实验首次明确TAS cph1基因中的827个碱基序列,为进一步对该基因全序列的分析及功能研究奠定了基础。     

尿道致病性大肠埃希菌UPEC4030株papA基因的克隆和序列分析

目的比较尿道致病性大肠埃希菌UPEC4030株papA与相关序列的差异,明确是否为未知的基因型。方法采用PCR扩增、基因克隆与测序分析方法,分别对UPEC4030株papA进行基因与氨基酸序列分析,并与相关序列进行比较。结果UPEC4030papA由722个碱基对组成,编码192个氨基酸的多肽。与10个基因型UPECpapA核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行同源性比较,结果分别为36.11%～77.95%和22.20%～78.34%;与papA基因分型多重PCR引物序列比较,下游分型引物在UPEC4030papA相应位置上的序列同源性只有10%～66.67%,推测该菌株papA为未知的基因型。结论UPEC4030papA为未知的基因型,相关致病机制和流行病学意义值得深入研究。     

新疆博乐地区大沙土鼠感染恙虫病东方体基因分型与序列分析

目的鉴定新疆博乐地区恙虫病东方体分离株的基因型别,分析其核苷酸序列。方法应用巢式PCR（nPCR）对新疆博乐地区采集的鼠标本Ot-Sta56KDa基因片段进行检测,PCR扩增产物纯化后测序,进行序列分析。结果博乐地区艾比湖滩涂地优势鼠种为大沙土鼠;在大沙土鼠脾总DNA用群引物扩增出481507bp的目的片段;经相应型引物扩增出了目的片段,序列同源性显示,核苷酸序列与KarpI、SS-11、Taiwan的核苷酸序列的同源性为97%,与Kanda的核苷酸序列同源性为92%。系统发生树表明,分离株与Karp株亲缘关系较近。结论在新疆地区首次从大沙土鼠中分离并扩增到恙虫病东方体基因片段,与Karp株型有较近的亲缘关系。     

新疆博乐地区大沙土鼠感染恙虫病东方体基因分型与序列分析

目的 鉴定新疆博乐地区恙虫病东方体分离株的基因型别,分析其核苷酸序列.方法 应用巢式PCR(nPCR)对新疆博乐地区采集的鼠标本Ot-Sta56KDa基因片段进行检测,PCR扩增产物纯化后测序,进行序列分析.结果 博乐地区艾比湖滩涂地优势鼠种为大沙土鼠;在大沙土鼠脾总DNA用群引物扩增出481～507bp的目的 片段;经相应型引物扩增出了目的 片段,序列同源性显示,核苷酸序列与Karp、ISS-11、Taiwan的核苷酸序列的同源性为97%,与Kanda的核苷酸序列同源性为92%.系统发生树表明,分离株与Karp株亲缘关系较近.结论 在新疆地区首次从大沙土鼠中分离并扩增到恙虫病东方体基因片段,与Karp株型有较近的亲缘关系.     

阿萨希丝孢酵母cphl基因DNA序列分析

目的明确阿萨希丝孢酵母菌（TAS）是否存在与菌丝形成调控相关的cphl基因，分析其核苷酸序列，为进一步对其功能研究奠定基础。方法用简易微量DNA提取方法从TAS中提取细胞总DNA，根据GenBank中白色假丝酵母菌（CAL）cphl基因设计多对引物，PCR方法扩增，纯化后用ABl377核苷酸测序仪对扩增产物进行克隆测序，并对测序结果进行分析。结果在29对引物中只有1对引物从TAS中扩增出长度为827bp的基因片段，BLAST分析表明与cALcphl基因的同源性为97．3％。结论本实验首次明确TAScphl基因中的827个碱基序列，为进一步对该基因全序列的分析及功能研究奠定了基础。     

猪囊尾蚴cDNA文库的免疫学筛选和新基因的发现

目的从猪囊尾蚴cDNA文库中筛选免疫学阳性蛋白的编码基因,为临床猪囊尾蚴患者的免疫学诊断提供特异的重组抗原。方法用脑囊尾蚴病人血清免疫学筛选猪囊尾蚴cDNA文库,阳性克隆经PCR技术扩增噬菌体载体中插入的DNA片段,并将其克隆入PMD-18T质粒载体中,测序结果与GenBank中的核苷酸序列进行同源性分析。结果血清免疫学筛选后,从猪囊尾蚴cDNA文库中挑取了4个阳性斑,PCR后4个片段大小约在200～1800bp,3个大的片段测序结果经分析表明均含有完整开放阅读框,同源序列分析结果显示获得的3个基因片段与GenBank中已知的猪囊尾蚴蛋白基因无同源性。结论本试验中所发现的基因均是猪囊尾蚴新基因,为进一步基因克隆、表达和鉴定等研究奠定了基础。     

一株未知黏附基因型的尿道致病性大肠埃希菌UPEC4030株的基因分析

目的 比较尿道致病性大肠埃希菌UPECA030株papG和papA基因与相关序列的差异.以明确UPECA030 papA基因变异情况及与papG的组合形式,确定是否为未知基因型.方法 采用基因克隆测序方法,分别对UPEC4030株papG和papA基因进行序列分析,并与相关序列进行比较.结果 UPECA030 papA由722个碱基对组成,编码192个氨基酸的多肽.与10个基因型UPEC papA核苷酸序列和推导的氨基酸序列同源性比较,分别为36.11%～77.95%和22.20%～78.34%;与papA基因分型多重PCR引物序列比较,下游分型引物在UPEC4030 papa相应位置上的序列同源性只有10.00%～66.67%,表明该菌株papA确实为未知的基因型.UPECA030菌株papG全基因片段由1100个碱基组成,编码337个氨基酸的多肽,其核苷酸及推导的氨基酸序列与Ⅱ型抛papG代表株UPEC IA2相比较,同源性分别为99.00%和99.11%,表明UPEC4030 papA属于Ⅱ型.结论 UPECA030 papA为未知的摹因型,其papG属于Ⅱ型.     

二羟环氧苯并芘致肺癌相关基因筛选

目的 筛选与二羟环氧苯并芘,(BPDE)引发肺癌相关基因的DNA片段,为进一步探讨BPDE致癌机制提供研究依据.方法 应用扩增片段长度多态性(AFLP)结合免疫磁珠分离等技术对与BPDE相互作用的DNA片段进行富集、扩增,经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示差异片段,并对其回收、克隆、测序及同源相似性比对分析.结果 成功回收了差异片段,经测序得到其碱基序列,基因同源相似性比对分析发现,有8条序列与已知基因同源,另有1条序列未找到同源序列,将该序列向GenBank提交注册,GenBalak已接受并给予登录号为:EF176681.结论 AFLP结合免疫磁珠分离等技术可以用于化学致癌BPDE肿瘤易感基因的筛选,所得9条基因片段可能与BPDE引发肺癌有关.     

山东地区不同季节优势恙螨自然感染恙虫病东方体的分子流行病学调查

目的从分子水平探讨山东地区不同季节优势恙螨自然感染恙虫病东方体（Ot）情况及其作为恙虫病传播媒介的可能性.方法根据Ot-Sta56 kDa外膜蛋白基因部分序列设计Ot种和型特异性引物,对标本提取的DNA先采用种特异性引物扩增,然后再采用型特异性引物扩增分型,并对部分标本进行序列测定.结果从不同季节优势恙螨幼虫共得到11株Ot分离株和16份恙螨匀浆,从这27份标本提取的DNA经首轮PCR扩增后,18份标本有预期的目的带.对首轮PCR产物采用nested PCR扩增分型,结果17份为Kawasaki型,1份（LHGM2株）为Karp型.序列同源性分析结果证实了nested PCR分型结果：XDM2株首轮PCR产物碱基序列与Kawasaki型相应DNA片段的碱基序列同源性最高,为97.00%,在系统发育树上与Kawasaki株位于同一分支,应属于Kawasaki型;LHGM2株首轮PCR产物碱基序列与Karp型相应DNA片段的碱基序列同源性最高,为96.45%,在系统发育树上与Karp株位于同一分支,应属于Karp型.结论山东地区不同季节优势恙螨中存在Ot自然感染,Ot主要基因型为Kawasaki型.     

一种新型β-内酰胺酶OKP-B-13的发现

目的鉴定一种新型超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌的基因亚型并分析其耐药性。方法分析11种抗菌药物对该菌株的最低抑菌浓度(MIC),并以碱裂解法抽提菌株的质粒DNA,应用聚合酶链反应(PCR)扩增产ESBLs株质粒的TEM、SHV、CTX基因,对其扩增产物进行DNA序列分析。结果TEM基因和CTX-M基因的PCR扩增结果均显示为阴性,SHV基因的PCR扩增获得862 bp产物;DNA测序未能在GenBank数据库查询到与之相一致的核苷酸序列,该基因编码的氨基酸序列与OKP型β-内酰胺酶为最相近,存在4~18个氨基酸差异,与SHV-1同源性为90%;此新型β-内胺酶被命名为OKP-B-13(GenBank注册号AY825330)。结论发现了一种新型的产ESBLs肺炎克雷伯菌β-内酰胺酶-OKP-B-13,其酶特性有待进一步研究。     

致肾盂肾炎大肠杆菌毒力因子的基因分布

目的 了解致肾盂肾炎大肠杆菌(UPEC)毒力因子基因的分布.方法 用PCR方法对41株UPEC菌株和40株健康人粪便分离的大肠杆菌进行5种毒力因子基因及新基因R049的扩增检测,并进行对比分析.结果 UPEC组和健康人粪便分离大肠杆菌6种毒力因子基因papC、fimH、hty、cnfl、aer和R049的检出率分别为100%和2.5%,53.66%和5%,63.41%和10%,34.15%和5%,60.98%和35%,40%和7.5%;前者高于后者(P<0.01).结论 UPEC毒力因子基因分布呈现多态性.     

携带双毒力基因的副溶血性弧菌tdh、trh基因分子特征研究

目的了解广西境内海产品牡蛎中分离到的携带tdh和trh两种毒力基因的副溶血性弧菌GX21的基因分子特征,分析与各地副溶血性弧菌的相关性,探讨水产品中副溶血性弧菌流行趋势。方法将监测海产品牡蛎中分离到的一株携带两毒素基因的副溶血性弧菌应用双重PCR的方法检测该菌tdh和trh两种毒力基因。把扩增产物切胶纯化后测序,将测序序列在GenBank DNA序列数据库上BLAST比对,分析比较结果。结果两扩增产物tdh-A和trh-A的序列与GenBank数据库中的多个序列有极高的相似度,最高达99%,只有一个碱基的错配或一个gaps。结论扩增产物tdh-A为副溶血性弧菌GX21的tdh基因不完全cds,trh-A为副溶血性弧菌GX21的trh基因不完全cds。比对表明副溶血性弧菌GX21与日本学者在1994年公布的副溶血性弧菌(TH3766)有很高的同源性。     

细粒棘球蚴内蒙株疫苗候选基因EG95克隆

目的 克隆细粒棘球蚴内蒙株EG95基因,并进行序列分析.方法 根据GenBank中细粒棘球蚴EG95-1基因DNA序列设计引物,提取细粒棘球蚴基因组DNA,PCR扩增目的基因,目的基因克隆到pMD19-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,进行序列分析.结果 克隆到的EG95-NM基因序列长1262bp,与EG95-1基因DNA序列同源性为98%.结论 克隆到细粒棘球蚴内蒙株EG95基因,序列分析表明,EG95-NM基因属于EG95基因家族并具有地理株特点.     

微小隐孢子虫腺苷酸激酶基因克隆及分析

目的获得微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum,Cp)南京(NJ)株的腺苷酸激酶(adenylate kinase,AK)基因的核苷酸和氨基酸序列,比对分析与其他隐孢子虫株AK基因序列的差异。方法采用昆明种小鼠建立微小隐孢子虫NJ株感染模型,根据GenBank微小隐孢子虫Iowa II株AK基因已知序列设计合成2对引物,应用巢式PCR方法从微小隐孢子虫NJ株基因组DNA中扩增AK基因,并将其克隆入pMD18-T载体;对重组质粒pMD18-T-CpAK经PCR及酶切鉴定后测序,应用生物信息学方法分析微小隐孢子虫NJ株AK基因与其他虫株的核苷酸和氨基酸序列差异。结果巢式PCR扩增获得特异的AK基因序列,酶切及PCR鉴定为正确的pMD18-T-CpAK重组质粒,扩增序列为903bp,含隐孢子虫AK全长基因663 bp;核苷酸序列测定及同源性分析表明,微小隐孢子虫NJ株AK基因与人隐孢子虫TU502 type 2株AK的同源性为99%,与微小隐孢子虫Iowa II株AK序列同源性为98%;进化树分析表明,微小隐孢子虫NJ株的AK基因与人隐孢子虫TU502 type 2株AK基因亲缘关系最近。结论成...     

朝阳病毒:黄病毒新种-辽宁首次发现

目的 对辽宁省朝阳市蚊虫中分离的一种新病毒进行分子生物学鉴定.方法 在辽宁省朝阳市采集蚊虫,用细胞培养方法分离病毒,对引起126/06细胞病变(CPE)的病毒进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测,并对阳性PCR产物进行测序分析;对病毒编码区全基因进行测序并与GenBank中36株黄病毒参考毒株序列进行比较;用Mega 3.1软件、以邻位相连法构建黄病毒属编码区全基因遗传进化树.结果 从蚊虫中分离到2株病毒,黄病毒属通用引物RT-PCR检测均为阳性,扩增片段大小986 bp,其中有600～750 bp核苷酸碱基序列与登革病毒2型、伊桂普病毒、塞皮克病毒和班奇病毒有66%～68%的一致性,2株病毒间碱基序列100%一致,为同一种黄病毒;病毒编码区基因序列全长10 308 bp,与其他黄病毒比较结果表明,分离株E基因、NS3基因及NS5基因碱基序列与其他黄病毒碱基序列一致性最高分别为59.6%,61.7%和67.0%;编码区全基因遗传进化树分析结果显示,分离株与登革病毒群、日本脑炎病毒群等蚊传黄病毒拥有共同进化祖先,但在系统发生树上处在单独进化分支.结论 辽宁省朝阳市分离到的黄病毒毒株不属于现有黄病毒属任何一种群,为黄病毒属的一个新种群,经GenBank分析确认为世界首次发现,并命名为朝阳病毒,收录号为FJ883471.     

基于DNA条形码鉴定口岸截获鼠类

目的 利用基于线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ(COⅠ)基因、线粒体控制区（D-loop）基因、16S rRNA基因的DNA条形码技术对广州口岸截获的1只死鼠进行种类鉴定。方法 从鼠肌肉中提取DNA,用PCR法扩增COⅠ、D-loop、16S rRNA基因片段,将测序结果与GenBank和BOLD systems v4中鼠类的DNA条形码进行比对,用Mega 6.0构建系统发育树,计算遗传距离。结果 该鼠类样本能扩增出COⅠ、D-loop、16S rRNA基因片段,通过COⅠ、16S rRNA基因扩增片段序列比对与德氏柔毛鼠Praomys daltoni同源性均为99%,D-loop基因扩增片段序列比对与猪吻柔毛鼠Praomys rostratus同源性为100%,结合形态学特征,最终鉴定为德氏柔毛鼠Praomys daltoni。结论 COⅠ、16S rRNA基因片段能够对鼠类进行有效鉴定,弥补了形态学鉴定的不足之处。     

微小隐孢子虫CRIP基因克隆与分析

目的 比对分析微小隐孢子虫南京(NJ)株亲环素-RNA相互作用蛋白(CRIP)与其他隐孢子虫株CRIP基因序列的差异.方法 根据GenBank微小隐孢子虫IowaⅡ株CRIP基因序列设计并合成2对引物,应用巢式聚合酶链反应(PCR)技术从微小隐孢子虫NJ株基因组DNA中扩增CRIP基因,并将其克隆到pMD18-T载体上,将重组质粒pMD18-T-CpCRIP进行PCR和双酶切鉴定后测序,应用生物信息学方法分析微小隐孢子虫NJ株CRIP基因与其他种属的CRIP基因序列同源性.结果 巢式PCR扩增获得的特异性CRIP基因序列,经PCR及双酶切鉴定确为pMD18-T-CpCRIP重组质粒;测序结果显示,该序列有119 bp,微小隐孢子虫NJ株CRIP基因全长为909bp,编码302个氨基酸;测序结果和同源性分析显示,中国微小隐孢子虫NJ株CRIP基因序列与国外的微小隐孢子虫IowaⅡ株同源性为98％;该隐孢子虫NJ株CRIP基因序列获GenBank登录号JQ396883.结论 微小隐孢子虫NJ株CRIP基因与其他微小隐孢子虫株存在基因变异.     

用分子生物学技术诊断巴尔通体感染

目的 应用聚合酶链反应(PCR)技术建立巴尔通体的检测鉴定方法并用于诊断临床疑似猫抓病合并双侧支气管肺炎患者。方法 根据16S～23S rRNA ITS基因序列较其他属细菌长,而且位于这段基因序列中的tRNA~(Ile)-tRNA~(Ala)基因间隔区具有高度变异性,tRNA~(Ile)和tRNA~(Ala)基因序列在巴尔通体属中完全保守,设计引物;同时应用文献发表的2对引物直接扩增1例临床可疑猫抓病患者全血基因组DNA。将研究设计引物的PCR产物直接测序,并进行序列分析。结果 3对引物扩增全血基因组DNA均获得巴尔通体特异基因片段,根据其中2对引物扩增产物大小与阳性对照不同,可初步确定样本与阳性对照菌株是不同巴尔通体;序列分析结果显示,研究设计引物TIle.455p-TAla.885n扩增产物核苷酸序列与中国云南省巴尔通体-分离株对应位置的序列相一致,同源性100％。结论 应用PCR技术从血液中直接扩增特异基因片段,可以快速检测巴尔通体感染;测序及序列分析结果进一步提供了此种致病巴尔通体在中国南北方均存在的线索。     

辽宁省水痘-带状疱疹病毒基因型分析

目的了解辽宁省水痘-带状疱疹病毒(VZV)基因型别。方法选取水痘患者临床确诊病例7例,采集血清和咽拭子标本,分别检测VZV IgM抗体、扩增ORF22基因VZV核酸片断,进行核苷酸序列测定分析,测序结果与GenBank的VZV参考株基因序列进行比较。结果 7例临床确诊病例VZV IgM抗体均阳性(编号为VZV001～VZV007);其中3例的咽拭子标本扩增到目的片段(VZV001、VZV-002、VZV-005),测序结果证实为水痘-带状疱疹病毒;ORF22基因的单核苷酸多态性(SNP)分析显示,VZV-002与VZV-005基因序列完全一致,且在同一位点的碱基由C代替了A;VZV-001序列2个位点出现碱基代替,提示其基因可能发生点突变;与Dumas株序列比较,3株分离株在6个关键位点上有4个核苷酸不同,与P-Oka株则完全一致,3株VZV分离株的ORF22基因均鉴定为J基因型,与水痘-带状疱疹病毒P-Oka株的同源性为99.56%～99.78%。结论辽宁省检测到的3株VZV基因型均为J型。