痘苗病毒载体与肿瘤基因治疗（上）──重组痘苗病毒载体构建及特性

应用重组痘苗病毒载体进行肿瘤基因治疗取得了很大的进展。与其它病毒载体比较，痘苗病毒载体具有较大的外源基因容量，可达２５～４０ｋｂ，宿主范围广泛，可感染非分裂细胞，并且仅在细胞质中复制，无致癌性的报道。目前，随着重组载体构建、减毒、选择标记及外源基因表达调控方面的进展，可望作为一种较理想的载体介导肿瘤的基因治疗     

痘苗病毒载体与肿瘤基因治疗（下）──重组痘苗病毒载体介导的肿瘤基因治疗

目前采用同源重组构建了多种表达外源基因的重组痘苗病毒载体，包括ＩＬ－２，ＩＬ－刀，ＩＬ－４，ＩＬ－５，ＩＬ－６，ＩＦＮα，ＩＦＮγ，ＧＭ－ＣＳＦ，ＴＮＦ，ＩＬ－１０等细胞因子基因及ｐ９７，ＣＥＡ，ＭＵＣ１等肿瘤抗原基因，并应用于肿瘤基因治疗的体内外实验取得了明显的疗效。应用痘苗病毒载体进行ｉｎｖｉｖｏ基因治疗可望成为肿瘤基因治疗的一种新模式。     

痘苗病毒载体与肿瘤基因治疗（下）——重组痘苗病毒载体介导的肿瘤基…

目前采用同源重组构建了多种表达外源基因的重组痘苗病毒载体，包括ＩＬ－２，ＩＬ－３，ＩＬ－４，ＩＬ－５，ＩＬ－６，ＩＦＮα，ＩＦＮγ，ＧＭ－ＣＳＦ，ＴＮＦ，ＩＬ－１０等细胞因子基因及ｐ９７，ＣＥＡ，ＭＵＣ１等肿瘤抗原基因，并应用于肿瘤基因治疗的体内外实验取得了明显的疗效。应用痘苗病毒载体进行ｉｎ ｖｉｖｏ基因治疗可望成为肿瘤基因治疗的一种新模式。     

关于痘苗病毒的毒力

关于痘苗病毒的毒力陈南海，白宏东（中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室，北京１０００５２）随着分子生物学的发展，利用痘苗病毒作为表达外源基因的载体以及研制重组痘苗病毒活疫苗又重新引起了人们的兴趣［１］。与此同时，过去用痘苗病毒作为...     

缺失IFN-γ受体基因的天坛株减毒重组痘苗病毒载体的构建

目的 构建缺失WN-7受体基因的天坛株重组痘苗病毒载体，初步研究其毒力的改变及B8R缺失区插入外源基因表达的稳定性。为研制表达多价抗原重组痘苗病毒载体、提高痘苗病毒载体安全性进行探索。方法 采用PCR技术、多步克隆构建带有天坛株痘苗病毒B8R基因外左右侧同源臂、痘苗病毒启动子序列pE/L、p7．5及下游LacZ序列的转移质粒pSKB8R、pSKB8RLacZ。将痘苗病毒VTT与转移质粒pSKB8RLacZ共转染CEF细胞进行同源重组，经蓝白斑筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因(IFN-7受体基因同源序列)缺失为LacZ所取代的重组病毒vIT△B8RLaeZ。结果经酶切、测序鉴定转移质粒构建正确，核酸水平、外源基因生物学活性检测表明VIT△B8RLacZ在CEF细胞连续培养传代中B8R基因的缺失和插入外源基因LacZ表达均很稳定。VTTΔB8RLacZ在细胞中的繁殖复制水平与VTT相当。兔皮内毒力实验表明B8R基因缺失显著降低VTT的毒力。结论 本研究表明B8R基因缺失可显著降低痘苗病毒天坛株的毒力并可作为外源基因的插入区，缺失B8R基因的重组痘苗病毒可能作为新一代的表达多价抗原痘苗病毒载体。     

痘苗病毒载体在冠状病毒反向遗传学中的应用

反向遗传学方法是研究RNA病毒的主要方法，痘苗病毒载体则是感染性克隆技术的主要媒介，目前这一技术已趋向成熟并扩大其应用领域及对象。本文对痘苗病毒载体的构建、在冠状病毒反向遗传学中的应用情况以及目前该领域的进展作一综述。     

痘苗病毒A47L缺失对细胞免疫反应的影响

目的 以去除A47L表位的痘苗病毒为载体,导入外源基因OVA,研究去除A47L后对细胞免疫和免疫记忆效应的影响,以期通过去除痘苗病毒载体中对外源抗原的免疫性具有显著抑制作用的表位,提高疫苗的有效性.方法 将扩增的OVA基因导入pSC11穿梭质粒,在CV-1细胞中与去除A47L的痘苗病毒重组,通过多轮筛选纯化获得重组病毒...     

重组痘苗病毒载体介导的IL-2基因局部转染对小鼠黑色素瘤的治疗作用

采用编码人ＩＬ－２基因的重组痘苗病毒载体（ｒＶＶ－ＩＬ－２），以ｉｎｖｉｖｏ模式体内局部转染小鼠黑色素瘤，结果肿瘤生长速度明显减慢，荷瘤小鼠存活期显著延长。体内免疫功能的检测表明，荷瘤小鼠脾细胞的ＮＫ活性及诱导后的ＬＡＫ、ＣＴＬ活性明显高于对照组，表明采用ｒＶＶ－ＩＬ－２载体介导ｉｎｖｉｖｏ的肿瘤基因治疗具有一定的前景。     

去除痘苗病毒显性表位B8R对外源抗原免疫原性的增强

目的 去除B8R对外源抗原免疫原性的影响,为降低载体的免疫优势从而提高疫苗的有效性提供参考.方法 利用针对痘苗病毒的pSC11质粒,构建插入OVA的质粒pSC11-OVA,在CV-1细胞中与去除B8R的痘苗病毒重组,筛选纯化获得重组病毒.利用体外培养细胞,检测B8R缺失和外源抗原插入对病毒感染复制特性的影响;利用感染小鼠模型,检测重组病毒诱发的针对OVA的细胞免疫应答和免疫记忆效应;采用体征及神经行为学评分系统,检测重组病毒的毒力.结果 B8R缺失和OVA导入对痘苗病毒的生物学特性无明显影响;去除B8R后,外源性OVA成为显性表位,针对OVA的细胞免疫应答和免疫记忆效应明显增强;去除B8R还可显著降低痘苗病毒的毒力.结论 去除B8R可有效降低痘苗病毒的免疫优势效应,增加外源性抗原的免疫原性.去除痘苗病毒本身的显性表位,可为疫苗和基因治疗提供更为有效的载体.     

重组痘苗病毒载体介导的IL—2基因局部转染对小鼠黑色素瘤的治…

采用编码人ＩＬ－２基因的重组痘苗病毒载体（ｒＶＶ－ＩＬ－２），以ｉｎｖｉｖｏ模式体内局部转染小鼠色素瘤，结果肿瘤生长速度明显减慢，荷瘤小鼠存活明显著延长，体内免疫功能的检测表明，荷瘤小鼠脾细胞的ＮＫ活性及诱导后的ＬＡＫ，ＣＴＬ活性明显高于对照组，表明采用ｒＶＶ－ＩＬ－２载体介导ｉｎ，ｖｉｖｏ的肿瘤基因治疗具有一定的前景。     

痘苗病毒载体在冠状病毒反向遗传学中的应用

反向遗传学方法是研究RNA病毒的主要方法,痘苗病毒载体则是感染性克隆技术的主要媒介,目前这一技术已趋向成熟并扩大其应用领域及对象.本文对痘苗病毒载体的构建、在冠状病毒反向遗传学中的应用情况以及目前该领域的进展作一综述.     

应用痘苗病毒载体表达的重组甲肝抗原特性的研究

目的 探讨以痘苗病毒载体表达的甲肝病毒培养合适的细胞系和重组病毒灭活以及甲肝病毒抗原保存条件.方法 将构建成功的表达甲肝抗原的重组痘苗病毒分别接种于K4、143、HEL、Hep-2和Vero等细胞,用ELISA测定重组甲肝抗原的表达产量和不同方法灭活重组病毒后的抗原活性.结果 在K4、143和HEL细胞表达重组甲肝抗原的产量略优于Hep-2和Vero细胞,重组病毒经β-丙内酯和甲醛灭活后,甲肝抗原活性不变,制备的重组甲肝抗原稳定性好.结论 痘苗病毒表达载体可以提高甲肝抗原表达效率,具有十分广阔的应用前景.     

应用痘苗病毒载体表达的重组甲肝抗原特性的研究

目的 探讨以痘苗病毒载体表达的甲肝病毒培养合适的细胞系和重组病毒灭活以及甲肝病毒抗原保存条件.方法 将构建成功的表达甲肝抗原的重组痘苗病毒分别接种于K4、143、HEL、Hep-2和Vero等细胞,用ELISA测定重组甲肝抗原的表达产量和不同方法灭活重组病毒后的抗原活性.结果 在K4、143和HEL细胞表达重组甲肝抗原的产量略优于Hep-2和Vero细胞,重组病毒经β-丙内酯和甲醛灭活后,甲肝抗原活性不变,制备的重组甲肝抗原稳定性好.结论 痘苗病毒表达载体可以提高甲肝抗原表达效率,具有十分广阔的应用前景.     

HIV复制型痘苗病毒载体疫苗免疫原性分析

目的 分析比较HIV复制型痘苗病毒载体疫苗在小鼠和家兔体内的免疫原性。方法 HIV痘苗病毒载体疫苗vTKgpe以肌内、皮下、皮内3种途径接种小鼠，每周采血检测HIV特异性抗体和针对痘苗病毒载体的抗体，4周时取脾细胞用流式细胞仪检测细胞免疫。此外vTKgpe皮内途径接种2只家兔，每周采血检测抗体。结果 肌内和皮下免疫的小鼠在2周时开始出现HIV特异性抗体，4周时开始消失；针对痘苗病毒载体的抗体滴度在4周时急剧升高；血清吸附实验表明痘苗病毒抗体的升高对HIV特异性抗体检测有一定的掩盖。细胞免疫仅在皮内免疫的小鼠中检测到。家兔的HIV特异性抗体在2周时出现，并能维持一段时间。结论 在小鼠体内，肌内和皮下注射2种途径倾向于诱导体液免疫，而皮内接种则以诱导细胞免疫为主。家兔对痘苗病毒的敏感性要高于小鼠。     

构建以痘苗病毒为载体的人用狂犬病基因工程疫苗株的研究

构建了一个可以适于人用的表达狂犬病病毒糖蛋白的重组痘菌病毒疫苗株。构建的方法是：先构建一个表达β－半乳糖苷酶基因（简称ｌａｃ基因）的不经传代细胞的重组痘苗病毒，以此为亲本株，再与载体ＰＴｋ１１ｋＲＧ（狂犬病病毒糖蛋白基因插在胸苷激酶Ｔｋ区，并置于痘苗病毒１１ｋ启动子下游，Ｔｋ侧冀序列和启动子均来自痘苗病毒天坛株），在鸡胚细胞中同源重组，以蓝色空斑中挑白斑的方法筛选阳性重组病毒，用免疫荧光方法和ＡＰＡＡＰ免疫酶法证明，该病毒能较好地表达狂犬病病毒糖蛋白。动物实验表明，该病毒能较好地诱导小鼠和狗的抗狂犬病毒的中和抗体，并对狂犬病病毒ＣＶＳ株和ＳＲＶ（街毒）的攻击有保护作用。     

人CD28基因的分子克隆及其痘苗病毒载体介导的真…

用ＲＴ－ＰＣＲ方法从人Ｊｕｒｋａｔ细胞克隆了ＣＤ２８ ｃＤＮＡ，将ＣＤ２８全编码区基因片段重组入ＰＵＣ质粒，测序证实所获得的为人ＣＤ２８基因。以痘苗病毒天坛株国载体，构建表达人ＣＤ２８的重组痘苗病毒株，并在重组病毒感染的细胞膜上表达人ＣＤ２８膜抗原，拟用该抗原免疫小鼠以制备抗ＣＤ２８的抗体。     

腺相关病毒载体研究进展

腺相关病毒作为基因治疗的载体，具有感染范围广，可长效稳定地表达外源基因，可定点整合致宿主基因组等诸多优点而备受青睐。近年来，有关腺相关病毒及重组腺相关病毒的生物学特点有不少研究进展，本文就此做一综述。     

人CD28基因的分子克隆及其痘苗病毒载体介导的真核表达

用ＲＴ－ＰＣＲ方法从人Ｊｕｒｋａｔ细胞克隆了ＣＤ２８ｃＤＮＡ，将ＣＤ２８全编码区基因片段重组入ＰＵＣ质粒，测序证实所获得的为人ＣＤ２８基因。以痘苗病毒天坛株为载体，构建表达人ＣＤ２８的重组痘苗病毒株，并在重组病毒感染的细胞膜上表达人ＣＤ２８膜抗原，拟用该抗原免疫小鼠以制备抗ＣＤ２８的抗体。     

HIV-1中国流行株gag与hIL-2在重组痘苗病毒中的共表达及其与核酸疫苗的实验免疫研究

目的：将HIV-1中国流行株B亚型gag基因、gag和hIL-2基因在天坛株痘苗病毒中进行共表达，以期获得重组痘苗病毒，观察细胞因子的佐剂作用，与核酸疫苗混合免疫，评价免疫效果，为新型艾滋病疫苗研制开发打下基础。方法：将HIV-1中国流行株 gag基因、gag和hIL-2基因片段插入到 pJ38载体启动子下游，经同源重组和血凝素阴性空斑筛选重组痘苗病毒，SDS-PAGE、Western blot检测目的蛋白。以重组病毒和核酸疫苗免疫Balb/c小鼠，进行淋巴细胞转化实验、CTL、CD4 、CD8 T细胞数目以及血清抗体的细胞免疫和体液免疫指标检测。结果：获得了重组痘苗病毒 vJ38gag和 vJ38gag-IL-2。与 vJ38-gag相比，vJ38gag-IL-2，具有更好的免疫原性，重组痘苗病毒免疫3次的效果好于重组病毒免疫2次，以2rVV-DNA混合免疫效果最好。结论：重组痘苗病毒vJ38gag和vJ38gag-IL-2能够表达外源蛋白并诱导机体产生细胞免疫和体液免疫。细胞因子IL-2发挥了免疫佐剂的作用。     

sgp13OcDNA在痘苗病毒载体系统中的表达

ｇｐ１３０是一种分子量为１３０ｋＤ的细胞膜糖蛋白,是ＩＬ－６等多种细胞因子共用的信号传递分子。本研究将含ｇｐ１３０胞外区全长的可溶性片段的基因（ｓｇｐ１３０ｃＤＮＡ）构建到痘苗病毒载体中,并与野生型痘苗病毒在ＴＫ－１４３细胞中发生同源重组,用ＢｕｄＲ和Ｘ－ｇａｌ双重选择,得到带有人ｓｇｐ１３０的重组痘苗病毒（Ｖｓｇｐ１３０）。采用ＩＤＡ和ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｉｎｇ法证实：感染Ｖｓｇｐ１３０的ＴＫ－１４３细胞上清中有较强的ｓｇｐ１３０表达,表达产物分子量为１００ｋＤ左右。