TGF-β1、IGF-Ⅰ和地塞米松诱导BMSCs体外构建组织工程化软骨

目的探讨体外联合应用TGF-β1、IGF-Ⅰ及地塞米松诱导骨髓基质干细胞(BMSCs)体外构建组织工程化软骨的可行性.方法抽取8周龄猪股骨骨髓,应用贴壁法分选单个核细胞,体外培养扩增后获得BMSCs,收集第2代细胞,以5 × 107/cm3的密度接种到聚羟基乙酸(PGA)制成的圆柱形三维支架材料上,7 d后联合应用TGF-β1、IGF-Ⅰ及地塞米松进行诱导和体外培养,未诱导组作为平行对照.4周和8周分别取材进行大体观察、组织学、组织化学及免疫组织化学检测.结果体外诱导培养4周后,形成的细胞材料复合物表面光滑,质地柔韧,保持原大小形状;组织学显示有较为明显软骨陷窝,并分布有Ⅱ型胶原及聚合蛋白多糖(GAG);8周时外观灰白色,较坚硬,软骨陷窝更为明显,并连接成片,Ⅱ型胶原染色呈强阳性,有更多甲苯胺蓝异染的软骨特异性基质成分.对照组细胞材料复合物逐渐收缩,8周时直径仅约2 mm大小,组织学检测无软骨陷窝结构,Ⅱ型胶原免疫组化结果阴性.结论 TGF-β1、IGF-Ⅰ及地塞米松可以体外诱导BMSCs在三维支架上形成组织工程化软骨.     

TGF-β_1、IGF-I和地塞米松诱导BMSCs体外构建组织工程化软骨

目的 探讨体外联合应用TGF-β1、IGF-Ⅰ及地塞米松诱导骨髓基质干细胞(BMSCs)体外构建组织工程化软骨的可行性。方法 抽取8周龄猪股骨骨髓,应用贴壁法分选单个核细胞,体外培养扩增后获得BMSCs,收集第2代细胞,以5×107/cm3的密度接种到聚羟基乙酸(PGA)制成的圆柱形三维支架材料上,7 d后联合应用TGF-β1、IGF-Ⅰ及地塞米松进行诱导和体外培养,未诱导组作为平行对照。4周和8周分别取材进行大体观察、组织学、组织化学及免疫组织化学检测。结果 体外诱导培养4周后,形成的细胞材料复合物表面光滑,质地柔韧,保持原大小形状;组织学显示有较为明显软骨陷窝,并分布有Ⅱ型胶原及聚合蛋白多糖(GAG);8周时外观灰白色,较坚硬,软骨陷窝更为明显,并连接成片,Ⅱ型胶原染色呈强阳性,有更多甲苯胺蓝异染的软骨特异性基质成分。对照组细胞材料复合物逐渐收缩,8周时直径仅约2 mm大小,组织学检测无软骨陷窝结构,Ⅱ型胶原免疫组化结果阴性。结论TGF-β1、IGF-Ⅰ及地塞米松可以体外诱导BMSCs在三维支架上形成组织工程化软骨。     

骨髓基质干细胞体外软骨定向诱导方法的研究进展

种子细胞来源一直是限制软骨组织工程发展的瓶颈,骨髓基质干细胞(BMSCs)具有取材创伤小、增殖能力强及具多向分化潜能等优点,已逐渐成为软骨构建种子细胞的研究热点。其关键问题是如何获得大量纯化的BMSCs并在体外定向诱导为软骨表型的细胞。该文就BMSCs体外软骨定向诱导方法的研究进展进行综述,以期为应用BMSCs构建软骨组织提供参考。     

骨髓基质干细胞体外软骨定向诱导方法的研究进展

种子细胞来源一直是限制软骨组织工程发展的瓶颈,骨髓基质干细胞(BMSCs)具有取材创伤小、增殖能力强及具多向分化潜能等优点,已逐渐成为软骨构建种子细胞的研究热点.其关键问题是如何获得大量纯化的BMSCs并在体外定向诱导为软骨表型的细胞.该文就BMSCs体外软骨定向诱导方法的研究进展进行综述,以期为应用BMSCs构建软骨组织提供参考.     

猕猴组织工程化周围神经的体外构建

目的:研究以猕猴骨髓基质干细胞作为种子细胞和以PLGA作为支架材料,体外构建猕猴组织工程化周围神经的方法.方法:采用密度梯度离心的方法分离培养猕猴骨髓基质干细胞,利用相差显微镜观察细胞生长情况,描绘其生长曲线;将4/0vicryl编织线在10倍手术显微镜下打散成PLGA细丝纤维,扫描电镜下观测其表面形态;将猕猴骨髓基质干细胞种植到经生物学修饰的PLGA纤维上共培养,倒置显微镜下观察细胞在支架材料上的生长情况.结果:采用密度梯度离心的方法可得到大量增殖能力强的猕猴骨髓基质干细胞;接种后的骨髓基质干细胞很快粘附于PLGA纤维上,生长、分裂、增殖良好,在PLGA纤维表面形成串珠样排列,部分细胞还形成连接在PLGA纤维间的链状或片状细胞桥.结论:猕猴骨髓基质干细胞与PLGA适合体外构建组织工程化周围神经.     

定向诱导骨髓间充质干细胞-藻酸盐复合物构建软骨组织

目的研究骨髓间充质干细胞(M SC s)经向软骨细胞定向诱导后,与藻酸盐复合,构建组织工程软骨的可能性。方法取大鼠股骨骨髓,经梯度离心法和贴壁法分离M SC s,经鉴定后用含转化生长因子1β10 ng/m l、地塞米松1-0 7m o l/L、转铁蛋白3 m g/m l、胰岛素2 m g/m l的诱导因子培养基对M SC s进行诱导,14 d后免疫组化检测Ⅱ型胶原分泌情况,将诱导后和未经诱导的M SC s以1×106/m l细胞密度与藻酸钙复合接种于裸鼠,分别于4周、8周后行组织学检测。结果经诱导的M SC sⅡ型胶原免疫组化阳性,与藻酸盐复合4周,HE染色可见软骨样细胞、软骨陷窝形成,阿辛蓝染色和M asson染色可见新生的软骨细胞和细胞外胶原,8周后软骨细胞明显增多,软骨细胞分泌胶原丰富,而未经诱导的M SC s无明显软骨细胞生成。结论M SC s经定向诱导后,可与藻酸钙复合在体内形成软骨样组织,可能发展为临床修补软骨缺损的一条有效途径。     

利用软骨细胞外基质来源的多孔支架与骨髓基质干细胞体外长期培养组织工程化软骨的试验研究

研究背景 关节软骨损伤临床常见,但损伤后自我修复能力极差,目前的修复方法均有其局限性。在先前的研究中,我们研制了关节软骨细胞外基质来源的多孔支架（Cartilage ECM-derived porous scaffold, CEDPS）并观察了并在裸鼠体内异位构建软骨。但在进一步可能的临床应用之前,应进一步评估其体外培养组织工程软骨的特点及可行性。 方法 本研究利用关节软骨细胞外基质来源的支架及骨髓基质干细胞体外长时间培养构建软骨组织。粉碎人关节软骨,脱细胞处理后差速离心法收集细胞外基质悬液,采用冷冻干燥技术制备三维多孔支架。扫描电镜及Micro-CT观察其微观结构,并进行细胞毒性试验,组织学观察,生化成分定量检测其胶原、氨基葡聚糖（GAG）、DNA含量,生物力学方法测量其干性及覆水状态下压缩弹性模量;骨髓基质干细胞经含TGF-β1, bFGF的条件培养基成软骨诱导后鉴定,种植到支架上,荧光显微镜及扫描电镜观察细胞黏附情况,Dead/Live免疫荧光染色观察支架内部细胞活性,体外培养1,3周后观察大体形态和组织学形态变化,同时行II型胶原免疫组织化学分析。 结果 制备的CEDPS支架无细胞碎片残留,软骨细胞外基质特异性染色阳性,具有相互贯通的三维孔隙结构;支架生化成分定量检测：总胶原含量为708.2?44.7μg/mg,GAG含量为254.7?25.9μg/mg;支架纵向压缩弹性模量E = 1.226?0.288MPa,覆水后压缩弹性模量E = 0.052?0.007MPa。体外培养的BMSCs-CEDPS复合体形成了类软骨样组织,Dead/Live染色表明支架内部均为活细胞,电镜检查结果表明细胞广泛均匀的分布在支架内部,呈圆形或椭圆形,在支架上增殖显著,细胞基质分泌明显。组织学结果表明蕃红花“O”、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,表明随着培养时间的增加,细胞在支架中增殖显著,细胞外有大量基质分泌。 结论 CEDPS支架在生化组成和结构上与软骨细胞外基质成分类似,去细胞彻底,具有良好的生物力学特性,是一种较为理想的软骨组织工程支架载体;成软骨诱导的BMSCs与CEDPS支架在体外可初步构建类软骨样组织。     

体外诱导骨髓间充质干细胞构建纤维蛋白胶软骨模块

目的:探讨体外构建骨髓间充质干细胞、改良纤维蛋白胶及生长因子的组织工程软骨模块的可行性。方法:分离兔骨髓间充质干细胞,种植在改良纤维蛋白胶支架内。实验组培养液中加入TGF-β1和BMP-6,对照组未加入诱导因子。体外进行形态组织学观察。1、2、3和4周取材作Masson染色、Ⅱ型胶原染色和扫描电镜观察。结果:细胞在支架上贴附,增殖。实验组中Masson染色可见胞浆及细胞周围有胶原形成;Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。结论:TGF-β1和BMP-6可诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化,在改良纤维蛋白胶支架内体外成功构建组织工程软骨模块。     

骨髓基质干细胞的成软骨能力

目的 综述近年骨髓基质干细胞成软骨分化的研究进展。方法 广泛查阅近期有关骨髓基质干细胞成软骨分化的研究文献。着重阐述与成软骨分化有关的生长因子及分化后的组织成分。结果 骨髓基质干细胞取材方便，体外扩增迅速，在特定的软骨培养液和生长因子作用下，可形成软骨样组织。作为自体来源的细胞可修复动物关节软骨缺损，避免了免疫反应。结论 骨髓基质干细胞扩增后数量多，具有明确的成软骨能力，作自体移植无免疫反应，用于软骨组织工程有广阔的前景。成软骨分化的调控机制和应用值得进一步研究。     

骨髓基质干细胞在软骨组织工程中的应用进展

自 2 0世纪 80年代美国Vicanti提出组织工程的概念以来 ,由于其广阔的应用前景和巨大的经济利益 ,以及与之密切相关的细胞生物学、分子生物学、免疫学和材料学等基础科学的快速发展 ,组织工程研究和应用得以飞速发展 ,为软骨缺损修复这个医学难题开辟了全新领域。骨髓基质干细胞 (bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)由于其易于获得 ,能保持良好的自我更新 ,并在特定的条件下向特定组织分化的生物学特性 ,在软骨组织工程领域得到广泛的关注和应用。本文对BMSCs在软骨组织工程中的应用进展加以综述。1　BMSCs获得骨髓中主要包含造血…     

新型快速成形的三维多孔支架材料构建组织工程软骨

目的:探讨以骨髓基质细胞(BMSC)为种子细胞,以快速成形的生物相容性材料为支架构建组织工程软骨的可行性.方法:成年兔BMSC在成软骨培养液中诱导培养,使之具有软骨细胞表型后,接种于快速成形的生物相容性三维支架材料聚乳酸/聚羟乙酸共聚物(poly-lactic-co-glycolic acid,PLGA),经体外培养扩增2 wk后植入自体肌袋,术后8 wk取材,进行组织学、甲苯胺蓝染色及II型胶原免疫组织化学观察.结果:成年兔BMSC在体外可诱导为软骨细胞,接种于三维支架材料培养后,扫描电境观察见细胞在支架上可大量扩增;接种细胞的支架植入自体肌袋8 wk,可形成软骨样组织,甲苯胺蓝染色及II型胶原免疫组化染色阳性.结论:具有软骨细胞表型的BMSC接种于快速成形的三维支架材料在体内非关节环境可形成软骨样组织.     

转化生长因子β1诱导时间对骨髓基质细胞体外成软骨分化的影响

目的：探讨转化生长因子β1（TGF-β1）诱导时间对骨髓基质细胞（BMSC）体外成软骨分化,及构建组织工程化软骨的影响。方法：将体外培养扩增的第二代猪BMSC按5．0×10^7个／ml的密度接种于聚羟基乙酸（PGA）制成的圆柱形支架材料上,第5天开始应用含TGF-β1（10μg/L）、IGF-I（50μg/L）和地塞米松（40μg/L）的软骨诱导液培养。按TGF-β1诱导时间的不同分为A（诱导2周）、B（诱导4周）、C（诱导6周）、D（诱导8周）和E（诱导10周）5组。体外培养10周后取材行大体观察、组织学和组织化学检测、聚合蛋白多糖（GAG）定量分析和生物力学测定,同时利用Western印迹和免疫组织化学进行Ⅱ型胶原表达的分析。结果：随诱导时间延长,软骨陷窝由周边开始逐渐向内部增多,排列渐趋均匀,蛋白聚糖等软骨特异性基质成分积聚。免疫组化染色及Western印迹结果均显示Ⅱ型胶原含量随诱导时间延长逐渐递增。这种情况至诱导6周后逐渐稳定,诱导6周和诱导10周间差异无统计学意义。诱导6周以上组弹性模量和抗压强度均明显高于A、B两组。结论：利用BMSC作为种子细胞构建组织工程化软骨,诱导持续时间与形成的软骨质量相关,6周的诱导时间基本可以形成具有良好组织结构、化学组成和力学性质的软骨组织。     

骨髓基质干细胞与骨基质明胶复合构建组织工程化骨

目的探讨骨髓基质干细胞(MSCs)与同种异体骨基质明胶(BMG)复合培养构建组织工程化骨的可能性。方法将SD大鼠来源的MSCs与同种异体BMG复合培养后植入SD大鼠竖脊肌肌袋内,于术后不同的时间点处死大鼠,标本进行碱性磷酸酶(ALP)活性测定及组织形态学观察。结果MSCs与同种异体BMG复合植入体内可产生成熟的骨组织。结论利用MSCs与同种异体BMG复合可产生组织工程化新生骨组织。     

力学刺激影响猪骨髓基质干细胞体外软骨形成的初步研究

目的研究力学刺激对猪骨髓基质干细胞(BMSC)体外构建组织工程化软骨的影响.方法取第二代猪BMSC以5×107/cm3的密度接种于聚羟基乙酸/聚羟基乳酸(PGA/PLA)圆盘形支架上,一周后均改用软骨诱导液[高糖DMEM培养基含10%胎牛血清(FBS) 、转化生长因子(TGF)β110 ng/ml、胰岛素样生长因子(IGF)-I 50 ng/ml、地塞米松 40 ng/ml]体外培养.根据不同的施加力分为3组离心组设定离心力100 g,2次/d,30 min/次,间隔12 h;摇床组设定为80 r/min,每天施力8 h;静止培养作为对照组.分别于第4周、第8周进行大体观察、组织学、组织化学、免疫组织化学,蛋白聚糖(GAG)定量等检测,比较不同力学刺激对诱导BMSC体外软骨形成的影响.结果第4周时两实验组,即摇床组及离心组形成的细胞材料复合物基本保持原来的体积与外形,软骨陷窝形成,呈结节状或巢状分布并伴有GAG沉积及胶原合成,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性.静止组体积缩小,有少量软骨陷窝结构形成;8周时两实验组形成的细胞材料复合物形状保持良好,浅灰白色,光泽好;HE染色结果显示大量成熟软骨陷窝形成,核仁清楚并有多处分裂相,细胞外基质沉积均匀;Safranin-O染色显示有大量的GAG形成,Masson染色显示有较多新生胶原组织形成,免疫组化检测Ⅱ型胶原表达强阳性.静止组可见部分陷窝结构分布在复合物外周,其间分布大量纤维样组织,组织化学及免疫组化检测阳性表达区域明显少于实验组.GAG含量两实验组分别为5.98 mg/g和5.62 mg/g,约为正常耳软骨含量的80%左右,明显高于对照组.结论利用BMSC为种子细胞体外构建组织工程化软骨中,施加力学刺激可以促进软骨组织成熟.     

人骨髓基质细胞软骨诱导分化及其与细胞载体体外复合

目的：观察出生后入骨髓基质细胞（hBMSCs）在体外培养条件下增殖与分化的特点，探讨其向成软骨方向分化及机制。研究诱导细胞体外与PDLLA/壳聚糖多孔材料复合。方法：密度梯度离心法进行hBMSCs体外培养。应用传五代细胞，经化学限定培养基诱导细胞，设实验对照组。采用倒置显微镜观察细胞增殖及形态变化，甲苯胺蓝染色观察诱导细胞合成细胞外基质中的蛋白多糖，RT-PCR检测Ⅱ型胶原mRNA的表达。将诱导的细胞分别与多孔羟基磷灰石、PDLLA/壳聚糖多孔材料复合，应用扫描电镜观察其在细胞载体表面的生长情况。结果：传五代hBMSCs经化学限定培养基诱导后转化成圆形肥大细胞，甲苯胺蓝染色阳性，Ⅱ型胶原mRNA表达与对照组比较有统计学意义。扫描电镜发现hBMSCs在PDLLA/壳聚糖多孔材料表面增殖良好并分泌大量细胞基质。结论：体外培养hBMSCs经化学限定培养基诱导后可向成软骨方向分化，可作为软骨组织工程种子细胞。PDLLA/壳聚糖多孔复合材料是组织工程良好的细胞载体，有利于细胞的黏附与增殖。     

丝素蛋白无纺网支架体外构建组织工程化软骨

目的:探讨丝素蛋白无纺网作为耳廓软骨细胞外支架构建组织工程化软骨的可行性。方法:取成年新西兰兔耳廓软骨,酶消化法获取软骨细胞,体外培养扩增后取原代细胞接种到制备好的丝素蛋白无纺网支架上,体外复合培养。每天倒置显微镜下观察细胞黏附、生长、增殖情况,于复合培养第3、7、10天时取材进行扫描电镜观察;于复合培养第1、2、4、6周取材进行组织学评价,同时取材通过RT-PCR方法检测复合物上软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA的表达情况。结果:48 h后软骨细胞已黏附于丝素蛋白纤维上,72 h后细胞开始分泌少量细胞外基质;电镜下观察显示软骨细胞及分泌的薄层细胞外基质主要分布于支架材料表面。组织学观察显示2周时支架浅层已有一定厚度软骨组织,可见少量类软骨陷窝,4周和6周时支架浅层软骨组织增厚,软骨陷窝增多,但支架内部软骨细胞数目少,细胞呈星形或梭形,细胞分泌的基质也很少。RT-PCR检测显示在各检测时间点均有Ⅱ型胶原mRNA的表达。结论:兔耳廓软骨细胞在丝素蛋白无纺网支架上已初步形成软骨样组织,但培养条件应进一步优化。     

组织工程化神经构建及其修复周围神经缺损的实验研究

目的探讨构建组织工程化神经及其修复周围神经缺损的作用.方法体外诱导人骨髓基质干细胞分化为雪旺细胞,与细胞外基质及可降解聚乳酸导管构建组织工程化神经;建立坐骨神经缺损10mm的动物模型,A组:经诱导骨髓基质干细胞分化为雪旺细胞与天然细胞基质(ECM)凝胶及可降解聚乳酸导管构建组织工程化神经桥接神经缺损;B组:单纯将ECM凝胶注入可降解聚乳酸导管桥接神经缺损;C组:自体神经移植组.术后12周进行神经电生理检测、新生神经组织学观察和轴突计数等检测坐骨神经功能恢复情况.结果诱导后成人骨髓基质干细胞具有雪旺细胞形态及特性;动物模型各组经移植术后12周,再生神经已通过缺损区长至远端.A组、C组各项检测指标均优于B组(PAB=0.021,PBC=0.001),A组与C组无显著性差异(P=0.065);A、B组聚乳酸导管降解吸收明显.结论人骨髓基质干细胞在体外可诱导分化为雪旺细胞,利用其与细胞外基质及可降解聚乳酸导管构建组织工程化神经可以修复周围神经缺损.     

TGF-β1与IGF-Ⅰ对体外培养兔软骨细胞增殖的影响

目的探讨转化生长因子-β 1(TGF-β 1)与胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)联合作用对关节软骨细胞增殖行为的影响.方法采用兔关节软骨细胞体外单层培养方法,将TGF-β 1与IGF-Ⅰ作用于软骨细胞,并用MTT比色分析法对其增殖行为进行分析,探讨多因子对关节软骨细胞增殖行为的影响.结果(1)TGF-β 1组的最佳效应浓度为5 μg/L,IGF-Ⅰ组的最佳效应浓度为50 μg/L.(2)TGF-β 1组(5 μg/L)、IGF-Ⅰ组(50 μg/L)以及两因子联合使用组软骨细胞增殖均较对照组高(P＜0.01),联合使用组促增殖作用最强,优于单一的TGF-β 1最佳效应浓度组和IGF-Ⅰ最佳效应浓度组(P＜0.05).结论TGF-β 1与IGF-Ⅰ联合运用早期促软骨细胞增殖作用优于单一的TGF-β 1或IGF-Ⅰ,在软骨细胞增殖过程中TGF-β 1和IGF-Ⅰ有良好的协同作用.     

IGF-1与TGF-β1联合诱导藻酸钙-脂肪干细胞混合凝珠软骨化的研究

目的探讨以藻酸钙凝珠为载体的立体培养的兔脂肪干细胞(ADSCs),胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、转化生长因子β1(TGF-β1)共同诱导下向软骨细胞分化的作用。方法利用新西兰大白兔提取兔ADSCs培养传代并鉴定。取第3代ADSCs制成藻酸钙-脂肪干细胞混合凝珠进行立体培养并分为4组:A组(未诱导组)、B组(IGF-1诱导组)、C组(TGF-β1诱导组)、D组(TGF-β1和IGF-1联合诱导组)。连续培养3周后对细胞采用HE染色、免疫组化染色方法进行检测,对比各组之间的表达结果。结果流式细胞术的结果显示提取细胞中ADSCs的纯度>95%;HE染色结果表明细胞分化:D组>C组>B组,A组无明显变化;利用Scion Image图像分析免疫组化中Ⅱ型胶原表达量:D组>C组>B组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论以藻酸钙凝珠为载体的脂肪干细胞能定向诱导成软骨细胞,并且在立体培养TGF-β1+IGF-1两种生长因子联合诱导优于TGF-β1或IGF-1单一诱导,两者之间起协同作用。     

骨髓间质干细胞体外预构组织工程化肌腱的实验研究

目的 探讨骨髓间质干细胞与胶原-聚羟基乙酸的细胞相容性，为构建组织工程化肌腱寻求理想方法。方法 以贴壁法分离、培养骨髓间质干细胞，并检测CD44。在实验组中将骨髓间质干细胞置入含胶原-聚羟基乙酸的DMEM培基中培养；在对照组中将骨髓间质干细胞置入DMEM培基中培养。通过MTT方法比较两组的细胞活性和生长情况，并对实验组进行超微观察。以骨髓间质干细胞为种子细胞，以胶原-聚羟基乙酸为支架在体外预构组织工程化肌腱。结果 以贴壁法原代培养骨髓间质干细胞，11天细胞即汇合成片，检测CD44示阳性。骨髓间质干细胞接种于胶原一聚羟基乙酸中混合培养后14天生长良好，始终保持89％VA上的细胞活力，与对照组比较无显著差别；实验组细胞数未发生明显改变．而对照组从第4天开始即发生增殖。透射电镜示实验组细胞培养14天后仍保持旺盛的分泌功能。体外预构的组织工程化肌腱具有良好的形态，细胞伸展成梭形，沿聚羟基乙酸缝线大致平行排列。结论 骨髓间质干细胞与胶原-聚羟基乙酸的细胞相容性好。以骨髓间质干细胞为种子细胞，以胶原-聚羟基乙酸为支架可在体外初步预构组织工程化肌腱。