丝裂原活化蛋白激酶类和蛋白激酶C在转化生长因子β1诱导肾小管细胞结缔组织生长因子表达中的作用

目的了解转化生长因子β1（TGF-β1）诱导肾小管细胞结缔组织生长因子（CTGF）表达的机制，特别是蛋白激酶C（PKC）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）在CTGF基因表达中的作用及其对Smad磷酸化的影响。方法分别应用PKC抑制剂G06850以及MAPK的3个组成成分ERK、JNK和p38MAPK的抑制剂PD98059、U0126、SP600125和SB203580阻断相应通路，观察其对TGF．131诱导的CTGF表达以及Smad2／Smad3磷酸化的影响。结果TGF-β1（5μg／L）以时间依赖方式诱导HK-2细胞中Smad2／Smad3的磷酸化，从基础值0．87±0．09上升至2h时高峰2．350±0.11。PKC抑制剂G06850（5μmol／L）和ERK抑制剂PD98059（10μmol／L）、U0126（10μmol／L）可部分抑制TGF-β1诱导的CTGF表达，而p38MAPK抑制剂SB203580（20μmol／L）和JNK抑制剂SP600125（10μmol／L）对TGF-β1诱导的CTGF的表达无影响。PKC抑制剂G06850（5μmol／L）可减少TGF-β1诱导的Smad2／Smad3磷酸化，而ERK抑制剂PD98059（10μmol／L）和U0126（10μmol／L）对Smad2／Smad3的磷酸化没有影响。结论在肾小管上皮细胞中，TGF-β1诱导CTGF的表达需要PKC和Ras／MEK／ERK的参与。PKC以Smad依赖的方式参与肾小管上皮细胞中TGF-β1诱导的CTGF的表达，而Ras／MEK／ERK对CTGF表达的调节不依赖于Smads。     

结缔组织生长因子诱导人近端肾小管上皮细胞整合素连接激酶的表达及与激酶信号途径的关系

目的探讨结缔组织生长因子（CTGF）对人近端肾小管上皮细胞系HK-2整合素连接激酶（ILK）表达的影响，以及丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇3激酶（P13-K）途径对该因子表达的影响。方法用不同浓度的CTGF作用HK-2细胞24h及50μg／L的CTGF作用HK-2细胞不同时间，以实时PCR和Western印迹方法检测ILKmRNA及蛋白的表达。用信号通路特异性抑制剂预处理，观察其对CTGF的干预作用。结果CTGF呈时间及浓度依赖性诱导人近端肾小管上皮细胞ILK蛋白表达。5、20、50μg／L的CTGF可使ILK表达量分别增加为对照组的3．284、5．103、5．638倍。50μg／LCTGF使ILK的表达在6h开始升高，高峰在48h（为对照组5．740倍），MEK抑制剂PD98059和P13．K抑制剂LY294002显著降低CTGF诱导的HK-2细胞ILK基因和蛋白的表达（P均〈0．05）。p38MAPK抑制剂SB203580对CTGF诱导的ILK表达无显著影响。结论CTGF能诱导HK-2细胞ILK蛋白的表达，该作用可能与ERK1／2和P13-K信号途径激活有关。     

甲状旁腺激素通过丝裂原活化蛋白激酶信号通路诱导人近曲小管上皮细胞结缔组织生长因子表达

目的 观察甲状旁腺激素（PTH）对人肾小管上皮细胞分泌结缔组织生长因子（CTGF）的影响，并探讨丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号途径在此过程中的作用。 方法 采用实时定量PCR、Western印迹、报告基因等技术，观察PTH诱导人近端肾小管上皮细胞系HK-2细胞CTGF表达的情况。使用信号通路抑制剂PD98059、U0126阻断信号通路以明确PTH发挥作用的信号途径。 结果 正常HK-2细胞有基础水平的CTGF mRNA和蛋白表达，PTH刺激后其表达水平显著增加。10-10 mol/L PTH作用12 h后，荧光素酶活性较对照组明显升高[（1.8884±0.0780）比（0.9891±0.0300） A，P ＜ 0.01]。正常HK-2细胞有少量p-ERK1/2表达，PTH刺激后p-ERK1/2表达明显升高，以10-10 mol/L PTH作用30 min时效应最强；MAPK通路抑制剂PD98059、U0126作用后，CTGF mRNA、蛋白、基因启动子表达均明显下降。 结论 PTH可诱导HK-2细胞CTGF表达，其作用可能是通过MAPK信号通路来实现的。     

JNK和TGF-β信号途径协同介导CTGF在瘢痕疙瘩成纤维细胞中过度表达

目的:比较结缔组织生长因子(CTGF)在瘢痕疙瘩成纤维细胞(KF)和正常真皮成纤维细胞(NF)中的表达以及对血清刺激的反应;研究介导CTGF在KF中表达的信号途径.方法:在血清刺激前30 min给予小分子人工合成的信号通路抑制剂预处理,分别为:P13K抑制剂wortmannin(100nM);ERK抑制剂PD98059(50mM);p38 MAPK抑制剂SB203580(10mM);JNK抑制剂SP600125(25 mM);以及TGF-β I型受体抑制剂SB431542(0.1μM、0.5 μM、1μM和10 μM),空白对照组仅加入溶剂DMSO预处理.使用定量实时反转录聚合酶链反应比较CTGF在瘢痕疙瘩成纤维细胞(KF)和正常皮肤来源的成纤维细胞(NF)中的表达.结果:KF血清刺激后CTGF的表达迅速升高,而在NF血清刺激后仅少量上升.JNK抑制剂SP600125和TGF-β I型受体抑制剂SB431542对CTGF表达的升高具有显著的抑制作用(P＜0.05).结论:KF中的CTGF血清反应需要JNK和TGF-β信号途径的协同作用.     

Erk和p38信号转导通路对大鼠肌源性干细胞内结缔组织生长因子表达的调控作用

目的 探讨肌源性干细胞(muscle derived stem cells,MDSC)受转化生长因子β1(transforming growth factor-1,TCF-β1)刺激产生结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的过程中,Erk信号转导通路和p38信号转导通路是否发挥作用.方法 采用细胞差速贴壁法,从新生大鼠骨骼肌中分离提取肌源性干细胞,进行细胞表型鉴定后传代培养.实验设空白组、对照组和实验组共8组:空白组,添加液为基础培养基;对照组,基础培养基中加TGF-β1;PD98059实验组,分别用20、40、80μM的PD98059预处理;SB203580实验组,分别用0.2、0.5、1.0μM的SB203580预处理.用Real Time-PCR和Western Blot分别检测细胞中CTGF mRNA和蛋白质的水平.方果 空白组、对照组和PD98059实验组间CTGF mRNA和蛋白质的相对表达量差异均有统计学意义(P<0.05),对照组和SB203580实验组间差异均无统计学意义(P>0.05).方论 TGF-β1诱导NDSC产生CTCF的过程中,存在着Erk信号转导途径,不存在p38信号转导途径.     

甲状旁腺激素通过NF-κB诱导人近曲小管上皮细胞结缔组织生长因子表达

目的 观察甲状旁腺激素（PTH）对人肾小管上皮细胞分泌结缔组织生长因子（CTGF）的影响,并探讨其信号传导通路及NF-κB在此过程中的作用。 方法 应用荧光实时定量PCR、Western印迹技术,观察PTH诱导人近端肾小管上皮细胞系HK-2细胞CTGF mRNA和蛋白合成情况;从转录水平探讨PTH对CTGF基因启动子活性的调控作用。采用凝胶迁移实验（EMSA）技术检测PTH刺激HK-2细胞后NF-κB的DNA结合能力;NF-κB抑制剂PDTC阻断信号通路以明确PTH发挥作用的信号途径。 结果 HK-2细胞有基础量的CTGF mRNA表达和蛋白合成,PTH刺激后其表达及合成量显著增加。PTH最佳刺激浓度是10－10 mol/L,最佳刺激时间是72 h。10－10 mol/L PTH作用HK-2细胞12 h后,荧光素酶活性显著高于未刺激组（1.8884±0.0780比0.9891±0.0300,P ＜ 0.01）。正常情况下,胞核内NF-κB处于无活性状态,PTH刺激HK-2细胞后,NF-κB的DNA结合能力明显增强,10－10 mol/L PTH作用30 min时NF-κB活性达到高峰;而后随PTH浓度和作用时间增加,NF-κB活性有所下降。PDTC预处理HK-2细胞后,PTH诱导细胞CTGF mRNA表达显著低于PTH组（0.33±0.05比3.84±0.68,P ＜ 0.05）,CTGF蛋白表达亦显著低于PTH组（0.56±0.23比3.76±0.54,P ＜ 0.01）;PDTC亦显著抑制CTGF基因启动子活性,其萤火虫荧光素酶相对活性显著低于PTH组（1.1942±0.0107比1.8884±0.0780,P ＜ 0.01）。 结论 PTH可诱导HK-2细胞高表达CTGF,且在一定范围内呈时间、剂量依赖,其作用可能是通过NF-κB信号通路来实现的。     

金雀异黄素在甲状旁腺激素诱导的人近曲小管上皮细胞结缔组织生长因子表达中的调控作用

目的 探讨金雀异黄素（Gen）对甲状旁腺激素（PTH）引起的人近曲小管上皮细胞分泌结缔组织生长因子（CTGF）的调控作用。 方法 应用实时定量-聚合酶链反应（real time-PCR）、Western蛋白印迹、报告基因等技术,观察Gen对PTH诱导人近端肾小管上皮细胞系HK-2细胞CTGF表达的影响。使用MAPK通路抑制剂U0126阻断信号通路以明确Gen发挥作用的机制。 结果 HK-2细胞有基础量的CTGF mRNA和蛋白表达,PTH刺激后其表达量显著增加（P ＜ 0.05）。10-10 mol/L PTH作用12 h后,荧光素酶活性较对照组明显升高（1.8884±0.0780比0.9891±0.0300,P ＜ 0.01）。Gen剂量依赖性下调PTH诱导的HK-2细胞CTGF表达。正常HK-2细胞有少量磷酸化（p）ERK1/2表达,PTH刺激后p-ERK1/2表达明显升高,以10-10 mol/L PTH作用30 min时效应最强。U0126作用后,CTGF mRNA、蛋白表达均明显下降（P ＜ 0.05）。Gen抑制PTH所致的HK-2细胞ERK1/2活化。 结论 Gen可通过阻断MAPK信号通路抑制PTH诱导的HK-2细胞CTGF表达。     

两种不同病理类型肾病患者尿蛋白诱导肾小管上皮细胞上调表达趋化因子及其分子信号机制研究

目的 观察不同病理类型肾病患者尿蛋白对人近端肾小管上皮细胞（HK-2）分泌趋化因子的影响并探讨其分子信号机制。 方法 所有患者均经临床和肾穿刺活检确诊为原发性局灶节段性肾小球硬化（FSGS）或微小病变性肾病（MCD）。以超滤法浓缩提取患者尿中总蛋白，分别刺激体外培养的HK-2细胞。RT-PCR检测调节正常T细胞表达和分泌的细胞因子（RANTES）及巨噬细胞移动抑制因子（MIF）的mRNA水平。免疫荧光、ELISA及流式细胞仪检测蛋白水平的表达。Western 印迹法检测p38 MAPK和胞外信号调节激酶（ERK）水平。特异性抑制剂SB203580抑制p38磷酸化；PD98059则用于抑制ERK磷酸化。 结果 两种尿蛋白成分有差异，FSGS患者尿蛋白中含有更多的大分子量蛋白。两种尿蛋白均刺激HK-2细胞RANTES及MIF表达上调，而FSGS患者尿蛋白刺激作用更强。两种尿蛋白均显著激活HK-2细胞内ERK和p38 MAPK信号通路。特异性抑制剂分别抑制ERK或p38 MAPK的活化后，FSGS患者尿蛋白介导的RANTES和MIF的上调表达作用可被SB203580或PD98059抑制，而MCD患者尿蛋白的刺激作用却仅能被SB203580所阻断。 结论 FSGS肾病患者的尿蛋白比MCD患者的尿蛋白有更强的上调HK-2细胞RANTES及MIF表达的作用。两种尿蛋白介导趋化因子上调表达的分子信号机制存在差异。     

晚期糖基化终末产物对人肾小管上皮细胞表达结缔组织生长因子和纤维连接蛋白的影响

目的：观察AGE-BSA认对体外培养的人近端肾小管上皮细胞株HK-2表达结缔组织生长因子（CTGF）和纤维连接蛋白（FN）的影响。方法：将HK-2细胞在体外与不同浓度的AGE—BSA和BSA共同培养。以酶联免疫法（ELISA）检测转化生长因子-β1（TGF-β1）的分泌，以逆转录-聚合酶联反应法（RT—PCR）测定CTGF mRNA和FN mRNA的表达。结果：100μg／ml的AGE—BSA刺激HK-2细胞24h，细胞上清中TGF-β1的浓度是对照组的2.37倍。AGE—BSA刺激HK-2细胞48h后，CTGF mRNA的表达开始出现显著升高（P〈0.01）。AGE—BSA能够剂量依赖性的上调HK-2细胞CTGF mRNA和FN mRNA的表达。BSA刺激组没有以上作用。结论：AGE—BSA可上调HK-2细胞CTGF和FN的表达，这可能在糖尿病肾病肾小管间质纤维化形成中起到一定作用。     

丝裂素激活蛋白激酶活化与肾小管上皮细胞生物学行为的关系

目的探讨丝裂素激活蛋白激酶(MAPK)信号通路对血小板源生长因子(PDGF)诱导肾小管上皮细胞表型转化的作用及其对细胞移行能力的影响.方法以PDGF(20 ng/ml)刺激培养的人近端肾小管上皮HK-2细胞,分别观察细胞形态、增殖和移行能力的变化.采用蛋白免疫印记法检测MAPK各亚类活性及α-平滑肌肌动蛋白(SMA)的表达,同时观察分别采用细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38信号通路特异阻断剂PD98059、SP600125和SB203580后上述指标的变化.结果 PDGF刺激6～12 h使α-SMA表达上调近2倍,但刺激24～48 h反而使α-SMA表达低于基础水平.PDGF刺激24 h后HK-2细胞从立方形转变为梭形,细胞虽尚无增殖反应但移行能力增强至3倍(P＜0.01).PDGF诱导的ERK、JNK和p38活性均在2 min时迅速增高,分别在2～5 min达高峰,分别为基础水平的5.7倍、2.6倍和1.6倍(P＜0.05),ERK和JNK活性增高可持续至120 min,而p38活性则于60 min以后恢复至基础水平.在PDGF刺激24 h的情况下,PD98059和SP600125不影响基础状态及PDGF对α-SMA表达的作用,但SP600125可抑制PDGF上调的细胞移行能力(P＜0.01);而SB203580既可抑制α-SMA的基础表达(P＜0.01)及PDGF下调的α-SMA表达(P＜0.001),同时还可显著抑制PDGF诱导的细胞移行能力(P＜0.05).结论 PDGF可刺激MAPK的不同亚类信号通路磷酸化,并可诱导肾小管上皮细胞形态改变及其移行能力增强.在PDGF诱导的表型转化和移行功能改变中,ERK信号通路无介导作用,JNK通路主要与细胞移行能力变化相关,而p38可能是调控α-SMA表达和细胞移行改变的主要信号通路.     

晚期糖基化终产物诱导人肾小管上皮细胞表达结缔组织生长因子

目的观察晚期糖基化终产物（AGE）修饰的牛血清白蛋白（BSA）对体外培养的人近端肾小管上皮细胞株（HK-2细胞）表达结缔组织生长因子（CTGF）的影响，并探讨可能的作用途径。方法将HK-2细胞在体外与不同浓度的AGE-BSA和BSA共同培养。间接免疫荧光法检测糖基化终产物受体（RAGE）。免疫印迹法观察HK-2细胞表达的CTGF蛋白质，ELISA和免疫印迹法检测TGF-β1的合成和分泌。结果在HK-2细胞的胞膜和胞质存在RAGE的表达。AGE-BSA以时间和剂量依赖方式上调HK-2细胞CTGF的表达，8、24、48及72h组分别为0h组的117％、138％、257％及339％：20、50及100mg／L组分别为0mg／L组的186％、240％及287％。在一定的剂量和时间范围内，AGE—BSA能够诱导TGF-β1蛋白质的表达和分泌。抗RAGE和抗TGF-β1的单克隆抗体能够部分抑制AGE-BSA诱导的CTGF蛋白质表达。结论人肾小管上皮细胞表面存在RAGE的表达。AGE—BSA可能部分地通过RAGE介导TGF-β1表达上调。诱导HK-2细胞CTGF表达。     

p38MAPK与 ERK1/2的协同效应及对成骨细胞分化的调控

 目的探讨骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨细胞分化过程中 p38MAPK与 ERK1/2的协同效应及其机制。方法以成骨细胞分化添加剂诱导小鼠 BMSCs向成骨细胞分化,测定碱性磷酸酶活性和钙沉积量。检测磷酸化 p38MAPK和磷酸化 ERK1/2(p-ERK1/2)的表达水平评估通路的激活状况。以 SB203580或 PD98059阻断 p38MAPK或 ERK1/2通路,观察对成骨细胞分化的影响。以 SB203580或亚砷酸钠阻断或激活 p38MAPK通路,观察 p-ERK1/2的变化。以冈田酸抑制蛋白磷酸酯酶 2A(protein phosphatases type 2A,PP2A)活性,观察 p-ERK1/2的变化及对成骨细胞分化的影响。通过免疫共沉淀实验观察 PP2A和 ERK1/2间的结合及 SB203580对结合的影响。结果成骨细胞分化添加剂诱导 BMSCs向成骨细胞分化的过程伴有 ERK1/2和 p38MAPK通路的激活, SB203580剂量±赖性抑制成骨细胞分化,PD98059剂量±赖性增强成骨细胞分化。 SB203580使 p-ERK1/2表达增加,亚砷酸钠减弱其表达。冈田酸使 p-ERK1/2表达增加,并使成骨细胞分化受到抑制。 PP2A可直接与 ERK1/2结合,SB203580使 PP2A与 ERK1/2的结合减弱。结论 p38MAPK可通过 PP2A与 ERK1/2产生协同效应,并调节 BMSCs向成骨细胞分化。     

缺氧时丝裂原激活蛋白激酶类对人肾小管上皮细胞富含半胱氨酸蛋白61基因转录活性的调控

目的 探讨丝裂原激活蛋白激酶类（MAPKs）对缺氧条件下人近端肾小管上皮细胞（HKC）中富含半胱氨酸蛋白61（Cyr61）基因转录活性的调控机制。方法 缺氧培养HKC，Northern印迹检测Cyr61mRNA表达；Western印迹检测Cyr61、p38、细胞外信号调节激酶（ERK1／2）、c—Jun—N末端蛋白激酶（JNK）以及缺氧诱导因子1c（HIF-1α）的表达。构建含有人Cyr61基因启动子的报告基因Cyr61-luc质粒，将其单独或者分别与表达活性MAPKs的质粒Ca—MEK1和Ca—MKK6共同瞬时转染HKC。通过荧光素酶活性检测观察缺氧、MAPKs抑制剂和MAPKs活性酶对Cyr61基因转录活性的调控。结果 缺氧时HKC表达cyr61、HIF-1α增高，ERK1／2、JNK、p38总量不变，而其各自的磷酸化形式均明显增加。HKC转染Cyr—luc后，p38通路抑制剂SB203580和ERK通路抑制剂PD98059显著抑制缺氧时Cyr61的转录活性，两者协同作用时抑制作用显著增强。Ca—MEK1与Cyr—luc共转染HKC后，Cyr61转录活性无改变；而Ca—MKK6与Cyr—luc共转染后，Cyr61转录活性显著增高。对缺氧培养的HKC，PD98059处理使HIF-1α和Cyr61蛋白表达显著降低；SB203580处理可显著降低Cyr61蛋白表达，但对HIF-1α无影响。结论 在HKC中，缺氧可通过p38通路直接上调Cyr61基因启动子活性，也可通过ERK1／2途径促进HIF-1α表达，间接调节Cyr61基因启动子活性。     

转化生长因子β1在大鼠腹膜间皮细胞中的促炎作用

目的 探讨转化生长因子β1（TGF-β1）在大鼠腹膜间皮细胞（RPMC）中的促炎作用及机制。 方法 用TGF-β1（10 μg/L）刺激体外培养的RPMC,观察其对RPMC中单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）表达的影响。体外转染Smad7和pcDNA3空载体至RPMC后,观察 TGF-β1（10 μg/L）对RPMC MCP-1和p38表达的影响。用p38抑制剂SB203580（10 μmol/L）预处理RPMC后,加入TGF-β1（10 μg/L）,观察阻断p38信号通路对MCP-1表达的影响。 结果RT-PCR结果显示,3 h、6 h、12 h、24 h TGF-β1刺激组腹膜间皮细胞MCP-1表达均显著高于0 h对照组（P < 0.05）,6 h刺激组MCP-1表达达高峰（P < 0.01）。ELISA结果显示,6 h、12 h、24 h、48 h TGF-β1刺激组MCP-1表达增多（P < 0.05）,48 h表达达高峰（P < 0.01）。上调表达Smad7和p38抑制剂SB203580都能明显抑制TGF-β1刺激RPMC产生和分泌MCP-1的作用,与pcDNA3空载体组比较,Smad7治疗组MCP-1的表达显著下调（P < 0.05）;与TGF-β1刺激组比较,SB203580治疗组MCP-1的表达显著下调（P < 0.01）。TGF-β1能活化p38磷酸化的过程,上调Smad7可抑制TGF-β1对它们的激活反应;与正常对照组比较,TGF-β1刺激组磷酸化（p）-p38的表达显著上调（P < 0.05）;与TGF-β1刺激组比较,Smad7治疗组p-p38的表达显著下调（P < 0.05）。 结论 TGF-β1能促进RPMC MCP-1的表达,其促炎作用可能是通过激活p38MAPK信号通路介导的。     

甲状旁腺激素对人近曲小管上皮细胞转分化及分泌结缔组织生长因子的影响

目的 探讨甲状旁腺激素（PTH）对人近曲小管上皮细胞系HK-2细胞分泌结缔组织生长因子（CTGF）及细胞转分化的影响。 方法 应用实时定量PCR和Western印迹观察PTH诱导HK-2细胞CTGF mRNA和蛋白表达情况，从转录水平探讨PTH对CTGF基因启动子活性的调控作用。应用免疫荧光技术检测PTH作用下HK-2细胞中α平滑肌肌动蛋白 （α-SMA）的表达。 结果 HK-2细胞有基础水平的CTGF mRNA和蛋白表达，PTH刺激后其表达量显著增加。PTH最佳刺激浓度是10－10 mol/L，最佳刺激时间是72 h。10－10 mol/L PTH干预HK-2细胞12 h后，荧光素酶活性较对照组显著升高（1.888±0.078比0.989±0.030，P ＜ 0.01）；光镜下可见细胞由立方形铺路石样转变为梭形，随作用时间延长转分化现象更显著。PTH刺激HK-2细胞12 h后，免疫荧光检测可见细胞质中有α-SMA表达；PTH刺激24 h后，α-SMA表达明显增多，与CTGF mRNA和蛋白表达的时间效应一致。 结论 PTH可上调HK-2细胞CTGF表达，并具有促进HK-2细胞转分化的作用。     

转化生长因子β1短发夹RNA对白蛋白刺激人肾近曲小管上皮细胞细胞因子表达的影响

目的 研究pcDU6载体质粒介导的转化生长因子β1（TGF-β1）短发夹RNA（shRNA）对人血清白蛋白（HSA）致人肾近曲小管上皮细胞（HK2细胞）增殖，TGF-β1、结缔组织生长因子（CTGF）和纤连蛋白（FN）表达的影响，并探讨有关机制。方法 构建TGF-β1shRNA的pcDU6载体质粒，体外培养HK2细胞株。采用脂质体转染将表达TGF-β1shRNA的pcDU6质粒载体（pcDU6-A1-A2和peDU6-B1-B2）分别导人实验组细胞。用HSA（5g／L）刺激HK2细胞12h或24h。四甲基偶氮唑盐（MTF）比色法测定细胞增殖水平。RT-PCR半定量分析HK2细胞中TGF-β1、CTGF和FNmRNA的表达水平；双抗夹心酶联免疫吸附法检测HK2细胞培养液中TGF-β1及FN蛋白质水平。结果 HK2细胞在HSA刺激下，其TGF-β1、CTGF及FNmRNA的表达明显上调，培养液中TGF-β1和FN的蛋白质含量亦明显升高（P〈0．05）。与pcDU6空载体组比较，pcDU6载体质粒介导的TGF-β1shRNA干扰组TGF-β1、CTGF及FNmRNA的表达明显下调（P〈0．05）。TGF-β1shRNA转染HK2细胞后12h或24h，细胞培养液中TGF-β1和FN蛋白质含量明显下降，HK2细胞增殖被部分抑制（P〈0．05）。在细胞增殖、TGF-β1、CTGF及FN基因表达方面，TGF-β1shRNA干扰组组间比较，以及pcDU6空载体转染组与HSA刺激组比较，差异均无统计学意义。结论 peDU6载体质粒介导的TGF-β1shRNA能够明显抑制HSA刺激下HK2细胞增殖、TGF-β1、CTGF和FN基因的表达。HSA刺激HK2细胞增殖及CTGF和FN基因的过表达可能通过TGF-β1介导。     

p38丝裂原活化蛋白激酶通路介导TGF-β_1/结缔组织生长因子调控人腰椎黄韧带增生肥厚的机制研究

目的探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)通路在TGF-β1/结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)调控人腰椎黄韧带增生肥厚中的作用机制。方法取腰椎间盘突出髓核摘除术中获得的黄韧带组织,采用胶原酶预消化组织块培养法分离培养黄韧带细胞。分别用细胞外调节蛋白激酶通路阻断剂PD98059、c-Jun氨基末端激酶通路阻断剂SP600125、p38通路阻断剂SB203580处理黄韧带细胞,实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA相对表达量。然后取黄韧带细胞分为A、B、C、D组,分别以小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)、p38 siRNA、siRNA+3 ng/mL TGF-β1、p38 siRNA+3 ng/mL TGF-β1转染细胞,转染24 h后行免疫荧光染色观察p38和磷酸化p38(phosphorylation p38,p-p38)表达,qRT-PCR检测各组CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA相对表达量,Western blot检测各组CTGF蛋白表达。结果 p38通路阻断剂SB203580可明显降低黄韧带细胞CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA相对表达量(P0.05)。转染24 h后,免疫荧光染色显示A、C、D组细胞呈阳性反应,有p38、p-p38表达,且C、D组强于A组;B组细胞呈阴性反应,无p38、p-p38表达。与A组相比,B组CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA相对表达量以及CTGF蛋白相对表达量显著减少,C、D组显著增加,C组较D组进一步增加,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 p38 MAPK通路介导TGF-β_1/CTGF表达,在人腰椎黄韧带细胞增生肥厚过程中具有重要作用。     

狼疮肾炎患者尿蛋白通过p38丝裂素活化蛋白激酶信号途径刺激近端肾小管上皮细胞上调表达骨调素

目的探讨p38丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)信号通路在狼疮肾炎(LN)尿蛋白介导近端肾小管上皮细胞(HK-2)表达骨调素(DPN)中的作用。方法收集狼疮肾炎患者24h的尿液提纯总蛋白，体外刺激HK-2细胞，分别用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western印迹法观察应用p38MAPK特异性阻断剂SB203580对。HK-2细胞表达OPN mRNA及蛋白的影响：免疫荧光法检测OPN及其受体CD44在细胞中的表达。结果狼疮肾炎患者尿蛋白可刺激HK-2细胞OPN mRNA及蛋白上调表达，并呈时间和浓度依赖性，而SB203580可明显抑制这一作用。结论狼疮肾炎尿蛋白可通过p38MAPK途径刺激HK-2细胞OPN mRNA和蛋白上调表达。     

转化生长因子β1诱导肌纤维母细胞分化机制的研究

目的 探讨肺移植后闭塞性细支气管炎中转化生长因子β1（TGF-β1）诱导肌纤维母细胞分化的机制。方法 闭塞性细支气管炎动物模型采用Smad3野生型和基因敲除小鼠进行的同种异体异位气管移植,并采用原代培养的气管纤维母细胞,通过免疫组化、免疫荧光、Western Blotting、逆转录聚合酶链反应和DNA凝胶电泳迁移率检测等手段,检测肌纤维母细胞分化的标志物α平滑肌肌动蛋白（αSMA）的表达,以及Smad3、p38和ERK1／2的激活。结果 在闭塞性细支气管炎的受累气道中,发现有αSMA的大量表达。对纤维母细胞进行的离体研究,发现TGF-β1诱导Smad3激活,表现为蛋白磷酸化、细胞核转位和DNA结合。TGF-β1引起肌纤维母细胞分化增加,表现为αSMA在转录和蛋白水平的表达增加;而在缺乏Smad3的纤维母细胞中,TGF-β1诱导的肌纤维母细胞分化明显减少（t=2,080,P=0．027;t=1．982,P=0．032）,但未完全消除。TGF-β1可通过激活p38和ERK1／2来促进少量肌纤维母细胞的分化。结论 TGF-β1可通过激活Smad3依赖性和非依赖性信号传导途径,主要是Smad3依赖性途径,来促使纤维母细胞向肌纤维母细胞的转化,最终导致闭塞性细支气管炎的发展。     

热损伤诱导的丝裂原活化蛋白激酶对活化蛋白-1的影响及其意义

目的 观察成纤维细胞热烫伤后丝裂原活化蛋白激酶以及活化蛋白-1的表达。方法 将培养的人成纤维细胞分成4组：(1)单纯热损伤刺激组；(2)热损伤刺激 碱性成纤维细胞生长因子处理组(10μg／L)；(3)预先加入PD98059(10μmoL/L)，再行热损伤 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)刺激；(4)预先加入PD98059 SB203580(各10μmol／L)阻断剂30min，再行热损伤 碱性成纤维细胞生长因子刺激。伤后0、30、60和180min检测细胞外信号调节激酶(ERK)和原癌基因c-fos蛋白。结果单纯热刺激的成纤维细胞ERK表达增加，随后消失。碱性成纤维细胞生长因子刺激ERK表达增加显著，时间延长。加入PD98059拮抗剂，ERK的表达受抑制。原癌基因c-fos的表达开始增加，随后减弱。同时阻断ERK和p38MAPK两条通路，c-fos弱阳性表达。结论 碱性成纤维细胞生长因子引起热损伤成纤维细胞ERK表达增加，原癌基因c-fos是MAPK信号通路下游重要的靶蛋白。