β防御素126在成年公山羊组织中的表达特性

为研究成年公山羊不同组织中β防御素126(gDB126)的表达特点,采集健康公山羊睾丸、附辜头、附睾体、附睾尾等生殖器官,以及心、肝、脾、肺、肾等组织器官,采用qRT-PCR探究gDB126mRNA的表达情况。结果显示:gDB126在公山羊生殖器官(输精管、附睾体、附睾尾)中大量表达,尤其在附睾尾1的表达量最高,而在泌尿器官(膀胱、肾上腺、肾脏)和消化器官(肠淋巴、回肠、甲状腺、空肠、十二指肠、食管、腮腺、皱胃)中微量表达另外gDB126在肺中也有较高表达。推测gDB126不仅与动物的抗菌作用相关,还可能与精子发生、运输、贮存、成熟有关。     

山羊Lcn5的表达特点及其在繁殖器官中定位

为探明附睾视黄酸结合蛋白5(Lcn 5)mRNA在公山羊体组织及不同月龄附睾中的表达特性,及其在睾丸、附睾和精子中的定位。采用实时荧光定量PCR方法检测18种组织和不同月龄附睾Lcn5mRNA表达规律;利用蛋白印迹技术对成年公羊睾丸和附睾Lcn 5蛋白表达进行定量分析;利用免疫组化技术对5月龄公羊睾丸和附睾Lcn 5进行定位,利用免疫荧光技术对精子Lcn 5进行定位。Lcn5mRNA在不同组织中均有表达,其中在性腺中的表达量最高,附睾头附睾尾附睾体睾丸;在5月龄前附睾的Lcn5mRNA表达量随月龄逐渐升高,5月龄时达到最高,随后又逐渐降低。Western blotting结果显示,Lcn 5蛋白表达量:附睾头附睾尾附睾体睾丸,支持了Lcn5mRNA定量的结果。免疫组化结果显示,5月龄山羊在附睾管壁的柱状细胞、纤毛细胞检测到较强Lcn 5蛋白表达的阳性信号,附睾尾管腔检测到较强的阳性信号。在睾丸各级生精细胞中也检测到了微弱阳性信号。Lcn 5蛋白包裹在精子头部顶体帽上。Lcn5在山羊附睾中高度表达,其表达具有时空特异性,推测其在精子成熟和维持正常生理功能方面发挥重要作用,其生物学功能需要进一步深入研究。     

公山羊β防御素104a生物信息学分析及表达特性研究

旨在预测山羊β防御素104a蛋白质特性,研究其在成年公山羊生殖组织及其他组织中的表达特性及其定位。采用在线软件对gBD104a基因(KJ508074.1)进行生物信息学分析,用QRT-PCR法检测gBD104amRNA在睾丸、附睾及其他组织中的表达情况,用免疫荧光技术对生殖组织和精子中的gBD104a进行定位。结果,(1)生物信息学分析结果表明gBD104a基因cDNA全长324bp,编码107个氨基酸,第1~19个氨基酸为信号肽,第27~55个氨基酸为潜在的β防御素构象区域,在C端有7个潜在的O糖基化位点;(2)QRT-PCR结果表明,gBD104a在附睾体中表达量最高,在附睾头、气管、皱胃、空肠、回肠等组织中表达量较高,其他组织中表达量均较低;(3)免疫组化定位结果显示,在附睾头和体部的假复层纤毛柱状上皮细胞检测到较强的gBD104a阳性信号,在附睾尾部的纤毛柱状上皮细胞也检测到较强的阳性信号。gBD104a包裹在精子头部顶体和中段线粒体表面。gBD104a是一种分泌型糖蛋白,在成年公山羊机体各组织中广泛表达,但主要表达在附睾体,是精子表面的主要成分。推测可能与精子运动、顶体反应和获能有关。需要进一步深入研究其功能。     

β-防御素caBD-1 mRNA在骆驼组织器官中的表达

根据已知的骆驼β-防御素caBD-1 cDNA序列设计了1对预计扩增产物为203bp的引物，通过RT—PCR检测骆驼的整个消化道黏膜、肝、胰腺、气管黏膜、肺、肾、膀胱黏膜、卵巢、子宫内膜、脾、淋巴结、心等器官内caBD-1 mRNA的表达。结果显示：caBD-1 mRNA在整个消化道、气管、膀胱、子宫等管状器官内的黏膜层有表达，而在实质性器官如心、肝、胰腺、肺、脾、淋巴结、卵巢、肾中无表达。提示，骆驼体内的这种内生性抗微生物肽有助于骆驼的黏膜宿主防御。     

重组猪β防御素2在毕赤酵母中的表达及其鉴定

根据GenBank猪β防御素2(pBD-2)的氨基酸序列,参照酵母偏爱的密码子,设计无信号肽序列的pBD-2的基因编码序列,并由公司合成.将合成的基因通过SnaB Ⅰ和Not Ⅰ位点插入到酵母表达载体pPIC9K的α因子信号肽序列下游,构建成pBD-2基因的分泌表达载体pPIC9K/pBD-2.利用电穿孔法将经Sal Ⅰ线性化的pPIC9K/pBD-2质粒导入毕赤酵母GS115中,通过G418加压筛选得到His+Mut+表型的高拷贝转化子.经PCR检测证明pBD-2基因在毕赤酵母染色体上得到整合.阳性重组酵母经摇瓶发酵培养和甲醇诱导,用SDS-PAGE方法在发酵上清中检测到重组pBD-2的存在,说明构建重组酵母菌能够分泌性表达pBD-2.琼脂孔穴扩散法检测结果显示,pBD-2对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性.     

绵羊β-防御素成熟肽在大肠杆菌中的表达

β-防御素(SBD-1)作为抗菌肽的一种,是一类富含精氨酸的阳离子多肽,广泛分布于动物、植物和昆虫体内。体外抑菌试验结果表明,防御素能对革兰阳性和革兰阴性细菌等病原微生物产生较强的杀伤作用,甚至对支原体、衣原体、螺旋体也具有杀伤作用。运用基因工程技术表达而大量生产的防御素无毒副作用,也不会使病原微生物菌株变异而产生抗药性,且具有广泛的抗性谱。     

猪β-防御素的表达及其生物学功能研究进展

猪β-防御素是一种先天免疫小分子蛋白质,在宿主防御中起着重要作用.它们不仅具有抗细菌和病毒的活性,还能通过连接先天性免疫和适应性免疫来调节免疫功能,抵抗病原体的感染.基于猪β-防御素的抗微生物活性及其免疫调节功能,其既可以作为提高免疫力的内在潜力,也可以开发成外源应用的抗生素替代品.本文将综述猪β-防御素的表达与分布、...     

猪β-防御素1在毕赤酵母中的串联表达

猪β-防御素1(pBD1)是在猪体内广泛分布的一种抗菌肽,在猪的先天免疫系统中发挥重要的作用。本试验为实现pBD1在巴斯德毕赤酵母中的高效表达,根据pBD1基因的成熟肽序列和巴斯德毕赤酵母密码子的偏好性,设计合成pBD1三倍串联体(3pBD1)基因序列,将合成的目的基因克隆到表达载体pHLI-S1中,构建重组表达载体pHLI-S1-3pBD1,线性化后的pHLI-S1-3pBD1电转化至毕赤酵母宿主菌GS115,PCR鉴定阳性转化子,MM平板和MD平板鉴定Mut表型。将鉴定为阳性的Mut~+型重组酵母菌株进行甲醇诱导表达,SDS-PAGE分析表达上清液。结果显示,获得的重组酵母菌株为Mut~+表型,经甲醇诱导表达后,表达上清液中含有分子量为22 kDa的目的蛋白。结果表明,获得了能够表达3pBD1的重组巴斯德毕赤酵母。     

成年公山羊脂质运载蛋白8基因的组织表达谱分析

为探究脂质载体蛋白(Lipocalin,Lcn)家族中Lcn8 mRNA在成年公山羊组织中的表达特点,采集3只5周岁成年公山羊的附睾头、附睾体、附睾尾、睾丸等生殖器官以及脾、肺、肾等组织器官,采用qRT-PCR对Lcn8 mRNA的组织表达特点进行研究。结果显示:Lcn8 m RNA在生殖器官中的表达量较高,其表达高峰在附睾头1;Lcn8 mRNA在气管中也有较高表达,在泌尿器官和消化器官中仅有微量表达。推测Lcn8可能与精子的发生和成熟过程有关,而且参与了机体的免疫调节功能。     

隆林山羊SMPX基因克隆及其组织表达谱分析

为了探究小肌肉蛋白(Small Muscle Protein X-link,SMPX)在隆林山羊中的蛋白结构和组织表达水平,本研究克隆隆林山羊SMPX,并进行生物信息和组织表达谱分析.从NCBI查找山羊SMPX基因序列设计引物,根据TRlzol法提取1月龄隆林山羊心、肝、脾、肺、肾、背肌的总RNA,反转录成cDNA,并...     

山羊睾丸和附睾头β防御素家族的表达谱及生物信息学分析

为探明山羊睾丸和附睾头β防御素家族基因表达特点及其蛋白的特性。利用3只7日龄羔羊睾丸和3只成年种公羊睾丸和附睾头的Illumina HiSeqTM2000高通量转录组测序数据,筛选出β防御素家族基因并进行差异表达基因比较分析,利用生物信息学对β防御素家族蛋白特性进行预测。结果显示:在山羊7日龄睾丸、成年睾丸和附睾头中分别表达7、12和33种β防御素,其表达量最高的分别是gDB123、gDB119和gDB124,成年睾丸中特异性表达是gDB33,附睾头中特异表达有21种β防御素。山羊β防御素分子量在6.89~13.85ku,为小分子、极性、带正电荷、疏水性的强碱性多肽。山羊β防御素也是含高度保守6个半胱氨酸的空间构象,基本结构-C-X2-45-CX3-6-C-X3-13-C-X4-7-CC-,其中24种β防御素结构为-C-X5,6-C-X3,4-C-X9-C-X5,6-CC-。有16种β防御素是分泌型糖蛋白,除gDB126无磷酸化位点外,其余的β防御素蛋白均有磷酸化位点。山羊附睾头特异性高度表达有丰富β防御素,它们是一类抗微生物的阳离子肽,在精子成熟过程中形成精子膜上糖被,或精子运动获得的过程中发挥重要作用;也可作为信号分子,某些信号通路中发挥作用。     

β防御素124沉默通过p38MAPK/AP1通路调控山羊附睾头细胞趋化因子和细胞因子的表达

旨在研究山羊β防御素124（goat beta-defensin 124,gBD124）沉默对p38MAPK/AP1通路及下游细胞趋化因子和细胞因子表达的影响。本研究将设计的3条gBD124-shRNAs载入LV10-U6/RFP&Puro质粒载体,与包装质粒共转染到293T细胞中,用梯度稀释法测定病毒原液的滴度;将构建的3个LV10-gBD124和LV10-gBD124-NC载体转染到山羊附睾头细胞中,筛选有效沉默载体;然后用有效沉默载体联合转染附睾头细胞,设置了空白细胞对照组、LV10-NC组、有效沉默载体组,用2 μg·mL^-1嘌呤霉素筛选后分别收集细胞和培养液,采用qRT-PCR、Western blot和ELISA检测gBD124、MAPK信号通路关键蛋白、细胞因子及趋化因子基因及蛋白表达情况。本研究构建了gBD124沉默慢病毒载体,筛选出LV10-gBD124-51和LV10-gBD124-161两个有效载体,并成功构建了gBD124沉默稳定转染的附睾头细胞株。与NC对照组相比,gBD124沉默显著降低了山羊附睾头细胞MAPK通路中MAPK1以及AP1的两个亚型c-JUN和c-FOS基因表达（P<0.05）,显著增加了RASA1基因表达（P<0.05）;gBD124沉默显著降低了总p38MAPK、总c-JUN和总c-FOS蛋白表达,以及磷酸化p38MAPK和c-JUN蛋白表达（P<0.05）;gBD124沉默显著上调了MAPK通路下游IL-1β及其受体IL-1R2、IL-8和趋化因子CCL6和CCL21基因表达（P<0.05）,下调了CCL5和IL-1α基因表达（P<0.05）;gBD124沉默显著降低了细胞培养液中CCL5浓度（P<0.05）。与空白对照组相比,gBD124沉默显著增加了培养液中IL-1β和IL-8浓度,降低了IL-1α浓度（P<0.05）。gBD124基因沉默通过抑制p38MAPK/AP1信号通路调控附睾头细胞趋化因子和细胞因子的表达。     

β防御素124沉默通过p38MAPK/AP1通路调控山羊附睾头细胞趋化因子和细胞因子的表达

旨在研究山羊β防御素124(goat beta-defensin 124,gBD124)沉默对p38MAPK/AP1通路及下游细胞趋化因子和细胞因子表达的影响。本研究将设计的3条gBD124-shRNAs载入LV10-U6/RFPPuro质粒载体,与包装质粒共转染到293T细胞中,用梯度稀释法测定病毒原液的滴度;将构建的3个LV10-gBD124和LV10-gBD124-NC载体转染到山羊附睾头细胞中,筛选有效沉默载体;然后用有效沉默载体联合转染附睾头细胞,设置了空白细胞对照组、LV10-NC组、有效沉默载体组,用2μg·mL~(-1)嘌呤霉素筛选后分别收集细胞和培养液,采用qRT-PCR、Western blot和ELISA检测gBD124、MAPK信号通路关键蛋白、细胞因子及趋化因子基因及蛋白表达情况。本研究构建了gBD124沉默慢病毒载体,筛选出LV10-gBD124-51和LV10-gBD124-161两个有效载体,并成功构建了gBD124沉默稳定转染的附睾头细胞株。与NC对照组相比,gBD124沉默显著降低了山羊附睾头细胞MAPK通路中MAPK1以及AP1的两个亚型c-JUN和c-FOS基因表达(P0.05),显著增加了RASA1基因表达(P0.05);gBD124沉默显著降低了总p38MAPK、总c-JUN和总c-FOS蛋白表达,以及磷酸化p38MAPK和c-JUN蛋白表达(P0.05);gBD124沉默显著上调了MAPK通路下游IL-1β及其受体IL-1R2、IL-8和趋化因子CCL6和CCL21基因表达(P0.05),下调了CCL5和IL-1α基因表达(P0.05);gBD124沉默显著降低了细胞培养液中CCL5浓度(P0.05)。与空白对照组相比,gBD124沉默显著增加了培养液中IL-1β和IL-8浓度,降低了IL-1α浓度(P0.05)。gBD124基因沉默通过抑制p38MAPK/AP1信号通路调控附睾头细胞趋化因子和细胞因子的表达。     

驯鹿β-防御素-1(reBD-1)mRNA在驯鹿组织器官中的表达检测

为了检测reBD-1 mRNA在驯鹿体内可能的表达器官,研究根据已知的reBD-1 cDNA序列设计了一对预计扩增产物为121 bp的引物,以驯鹿舌、食管、瘤胃、网胃、皱胃、十二指肠、回肠、结肠、肝、肺、气管、肾、膀胱、睾丸、附睾、心脏、脾脏中提取的总RNA为模板,采用反转录PCR(RT-PCR)技术检测驯鹿的上述器官内reBD-1 mRNA的表达情况.结果显示:reBD-1 mRNA在上述组织器官中均有表达,其中在舌、瘤胃、睾丸中表达最强;在食管、十二指肠、结肠、气管、脾脏中有中等量的表达;在网胃、皱胃、回肠、肝、肺、肾、膀胱、附睾、心脏内的表达较弱.β-防御素reBD-1在驯鹿体内的广泛表达提示reBD-1有助于驯鹿的先天性宿主防御.     

牛β-防御素BNBD5基因在毕赤酵母中的表达

本研究在本实验室成功构建的奶牛乳房炎抗性相关cDNA文库的基础上,旨在通过对牛β-防御素基因的分析,进一步揭示乳房炎抗性的分子机理.以牛β-防御素BNBD5基因作为乳房炎抗性的候选基因,通过克隆该基因的编码区,成功构建了毕赤酵母表达载体pPICZαA/BNBD5,并采用毕赤酵母表达系统表达了BNBD5蛋白.该结果为今后BNBD5抗体的制备奠定了基础.     

鸡β-防御素-3在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性测定

采用RT-PCR方法从鸡外周血淋巴细胞中扩增鸡β-防御素-3成熟肽基因,将其克隆到酵母表达载体pPICZα-A的分泌信号肽基因下游.线性化后的重组质粒电击转化毕赤酵母宿主菌GS115,经抗生素Zeocin筛选和PCR鉴定后,得到重组酵母菌.阳性转化菌经甲醇诱导后,SDS-PAGE和western blot鉴定结果表明,在毕赤酵母中得到分泌性表达产物,分子量约为8.9 ku,活性检测表明其具有显著的抑菌活性.     

骆驼β-防御素-1(caBD-1)基因在组织中的表达定位检测

防御素是一类富含半胱氨酸的阳离子抗微生物肽，具有广泛的抗微生物活性。哺乳动物防御素分子内含有由6个保守半胱氨酸残基形成的3对二硫键，根据其分子内二硫键的连接位置不同可分为α-防御素和β-防御素。防御素分子既可亲水又可亲脂，使其能与靶细胞膜相互作用并折断靶细胞膜，使靶细胞膜上形成通道，最终使靶细胞破裂死亡。     

粤北三黄鸡β-防御素基因的表达及其生物活性研究

采用RT-PCR 方法从三黄鸡肝脏中扩增β-防御素 Gal-6基因的 cDNA 片段,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-GAL-6,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21进行原核表达。结果表明,成功获得201 bp的鸡β-防御素基因,SDS-PAGE 电泳分析表明,原核表达的重组鸡融合蛋白分子质量约为32 kD。此外,表达的该重组蛋白对金黄色葡萄球菌有较高抗菌活性。     

β-防御素及其在猪腹泻病防治中的初步试验

哺乳动物机体中具有先天性和获得性两大免疫系统,获得性免疫系统可通过细胞免疫和体液免疫产生的特异性免疫反应物质来保证机体免受病原微生物的侵害,保持机体的平衡和稳定。近年来,科学工作者又发现人与动物机体中的先天性免疫系统中,还具有内在的防御系统。该系统在受到病原微生物侵袭后,可诱导机体产生一种具有拮抗微生物的肽类物质—防御素。