HPLC法测定恩替卡韦分散片中恩替卡韦的含量

目的建立HPLC法测定恩替卡韦分散片中恩替卡韦含量的方法。方法采用HPLC梯度洗脱法测定恩替卡韦的含量,色谱柱采用C18为填充剂（4.6 mm×150 mm,5μm）;流动相A：水-乙腈-三氟乙酸（990∶10∶1）,流动相B：水-乙腈-三氟乙酸（700∶300∶1）,梯度洗脱法;检测波长254 nm;流速1.0 ml.min-1;柱温：25℃。结果恩替卡韦浓度在21～50μg.ml-1（r=0.9992）范围内线性关系良好,平均加样回收率为99.14%,RSD为0.15%。结论本方法操作简单,专属性强,重复性好,可用于恩替卡韦分散片中恩替卡韦的含量测定。     

96例急性乙型肝炎患者HBV多聚酶区的耐药变异分析

目的检测未接受过核苷(酸)类似物(NA)治疗的急性乙型肝炎患者感染的HBV是否存在耐药变异。方法收集96例急性乙型肝炎患者住院早期血清,提取HBV DNA,采用巢式PCR方法扩增HBV反转录酶(RT)全基因,对PCR产物进行DNA双向测序,对RT/S基因序列进行分子进化树分析反基因分型,对rt80、rt173、rt180、rt181、rt184、rt202、rt204、rt236和rt250等位点上的耐药相关变异进行分析,并用克隆测序法进行验证,每个样本测定10～20个克隆。结果用直接测序法检出NA耐药变异8例(8.3%),C型6例,B型2例。其中6例为拉米夫定(LAM)耐药变异,包括4例rtM204I、1例rtL80I+rtM204I和1例rtL180M+rtM204I;另2例检出与阿德福韦酯(ADV)耐药相关的rtA181V变异。变异株多数与野生型病毒株共存。克隆测序法的结果与直接测序法的结果大体相符,部分样本中有2种或多种耐药变异株共存,其中1例患者的样本中除LAM变异株外,还检出了ADV和恩替卡韦(ETV)耐药变异株,变异形式分别为rtA181T+rtN236T和rtL180M+rtS202G+rtM204V。结论未接受过NA治疗的急性乙型肝炎患者可以感染NA耐药株病毒,NA耐药病毒可以在人群中传播引起急性乙型肝炎,变异病毒的传播致病不只局限于LAM耐药株。     

恩替卡韦治疗慢性乙型重型肝炎疗效观察

目的：观察恩替卡韦治疗慢性乙型重型肝炎的疗效。方法：将慢性乙型重型肝炎42例，随机分为对照组20例，给予综合治疗；观察组22例，在综合治疗的基础上加用恩替卡韦0.5mg，口服，每天1次。结果：观察组存活17例，占77.39%，对照组存活6例，占30.0％，两组存活率比较，差异非常显著（P〈0.01）。结论：恩替卡韦治疗慢性乙型重型肝炎疗效显著。     

恩替卡韦停药不当致肝衰竭1例

1病例报告患者女,54岁。因肝硬化2年,肝功能异常1年,乏力、黑粪3天入院。1年前因上消化道出血入某医院消化科治疗,肝功能正常、HBV-DNA阴转后,停用恩替卡韦,给予抗病毒治疗8个月,出现乏力和柏油样便3天后,入传染科检查:ALT     

恩替卡韦分散片治疗慢性乙型肝炎24周疗效及安全性评价

目的评价恩替卡韦分散片治疗慢性乙型肝炎的抗乙型肝炎病毒24周疗效及安全性。方法采用随机、双盲、双模拟、阳性药物博路定平行对照试验方法。120例慢性乙型肝炎患者按2∶1的比例随机双盲分成2组,其中试验组80例,对照组40例,治疗24周。试验组口服恩替卡韦分散片0.5mg/d及博路定模拟剂1片/d;对照组口服博路定0.5mg/d及恩替卡韦分散片模拟剂1片/d。结果治疗12周和24周后,试验组与对照组血清HBV-DNA下降水平、HBV-DNA完全抑制率、HBV-DNA水平下降≥21og10的比率、ALT复常率方面,2组差异均无统计学意义。试验组和对照组均未发生任何严重不良反应。结论恩替卡韦分散片在治疗慢性乙型肝炎方面具有显著的抗乙肝病毒作用,疗效与博路定相当,为一种安全有效的抗乙肝病毒药物。     

恩替卡韦耐药乙型肝炎病毒稳定复制细胞系的转录组学分析

目的 分析恩替卡韦耐药乙型肝炎病毒(ETV-r HBV)稳定转染前后宿主细胞转录组水平的基因差异表达,为后续开展HBV感染相关机制研究提供基础数据和参考.方法 对ETV-r HBV稳定转染细胞株(HepG2.A64)及其原始背景细胞株(HepG2)进行转录组测序(n=3),利用DESeq2软件以|log2 Fold C...     

恩替卡韦分散片的溶出度测定

目的建立恩替卡韦分散片溶出度的HPLC测定方法。方法以0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液250 ml为溶出介质,转速为50 r/min,取样时间为45 min,采用桨法测定恩替卡韦分散片的溶出度。结果恩替卡韦检测浓度的线性范围为0.5～10μg/ml(r=0.9999);方法专属性和精密度良好;平均回收率为99.91%,RSD为0.04%;3批样品45 min平均溶出度均在90%以上。结论该法操作简便,结果准确可靠,可用于恩替卡韦分散片的溶出度测定。     

恩替卡韦分散片的稳定性研究

目的研究恩替卡韦分散片在加速试验和长期试验条件下的稳定性并测算其有效期。方法在模拟市售包装条件下,通过加速试验和室温贮存18个月,参照《中国药典》附录对其性状、鉴别、分散均匀性、溶出度、有关物质、微生物限度检查及含量测定等项指标进行定期考察。结果在考察期内,各项指标均符合规定。结论本品在温度40℃、相对湿度75%条件下放置6个月或常温、相对湿度60%条件下放置18个月,药物制剂稳定,故其有效期定为18个月。     

1121例慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶区的耐药突变分析

目的 分析大样本慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶基因上的多位点核苷(酸)类似物的耐药相关突变情况及其临床意义.方法 提取1 121例患者血清HBV DNA,采用巢式PCR方法 扩增HBV反转录酶(RT)基因,对PCR产物进行DNA双向测序,对12个位点上的耐药相关突变进行检测,并结合临床资料进行分析.结果 检出拉米夫定(LAM)耐药突变228例,阿德福韦(ADV)耐药突变32例,恩替卡韦(ETV)耐药突变13例,替比夫定(L-dT)耐药突变4例.多药耐药5例.LAM耐药突变中以M204V和M2041最常见,前者通常伴随U80M突变,后者常单独出现;ADV耐药突变中以N236T±A181位碱基替换为主;ETV耐药突变发生在LAM耐药基础上,以T184位碱基替换为主;L-dT的耐药突变为M2041.结论 用基因序列测定法检测HBV RT基因多位点耐药相关突变,有助于临床及时发现乙肝患者是否存在HBV基因耐药,合理进行抗病毒治疗.     

我国患者多重耐药乙肝病毒感染的基因型和表型特点

目的分析我国大样本来源的慢性乙肝病毒(HBV)感染患者多重耐药HBV的基因型和表型特点。方法回顾性分析11 800例慢性乙肝患者血清中HBV反转录酶(RT)区与核苷(酸)类似物耐药相关的突变类型及频率,采用PCR产物直接测序法和克隆测序法(≥20个克隆/样本)对其中的46例多重耐药HBV突变株进行鉴定。采用体外表型耐药分析法检测核苷类与核苷酸类联合处理对多重耐药HBV的抑制效果。分析临床治疗方案在多重耐药HBV感染的发生及控制中的作用。结果在11 800例慢性HBV感染者中,共3658例(31.0%)检出核苷(酸)类耐药相关突变,其中拉米夫定(LAM)耐药突变2592例(70.9%),阿德福韦酯(ADV)耐药突变665例(18.2%),恩替卡韦(ETV)耐药突变293例(8.0%),替比夫定(LdT)耐药突变62例(1.7%),同时针对核苷类和核苷酸类的多重耐药(MDR)突变46例(1.3%)。对46例多重耐药感染样本的克隆测序显示,40例样本在同一病毒基因组上检出MDR突变,其他6例样本的MDR突变则存在于不同的HBV基因组中。基因型分析显示共有15种病毒变异形式,同时耐LAM(或LdT)和ADV,以及同时耐ETV和ADV的MDR株分别为10种和5种。体外表型耐药分析结果显示,ETV(或LAM)和ADV联合用药可有效抑制HepG2细胞内MDR HBV的复制,但对野生株无类似效果。临床用药方案分析显示,多重耐药HBV感染常出现在LAM(或)LdT、ADV、ETV序贯治疗的患者,以LAM→ADV(22例)和LAM→ADV→ETV(10例)最多见,发生多重耐药后大多出现病毒学和(或)生化学突破。LAM+ADV或ETV+ADV联合挽救治疗可成功将大多数多重耐药HBV的DNA复制控制在检测不到的水平。结论我国MDR HBV株具有多样性和复杂性,表型分析和临床观察均证实核苷与核苷酸类似物联合使用可有效控制MDR HBV复制。多重耐药HBV感染的发生与临床长期应用核苷(酸)类似物序贯治疗有关,密切监测病毒应答及耐药突变对于临床尽早制定最优的抗病毒策略具有重要意义。     

乙肝病毒相关的慢性肝病中病毒血清标志物状态分析

目的调查分析乙肝病毒（HBV）相关的慢性肝病（CLD）[包括慢性乙型肝炎（CHB）、肝硬化（LC）、肝细胞癌（HCC）]中HBV血清标志物不同状态的构成比及其临床意义。方法对2006年1月-2007年12月于广州南方医院住院的2 482例CLD患者的临床资料进行统计分析。结果1 226例CHB中,HBeAg阳性、HBeAg阴性的病例分别占64.4%、35.6%;362例LC和894例HCC中,HBeAg阳性、HBeAg阴性、HBsAg阴性的病例分别占27.1%、66.0%、6.9%和16.4%、75.1%、8.5%。对每一种CLD而言,血清标志物不同状态的男女构成比无显著差异;HCC的男女比值显著高于CHB和LC。CHB中,HBeAg阴性患者的平均年龄显著高于HBeAg阳性者;而LC、HCC中,不同血清标志物状态的患者平均年龄均无显著性差异。HBeAg阴性与HBeAg阳性的CHB病例中,丙氨酸转氨酶（ALT）各区段构成比无显著性差异;而在LC、HCC中,随着HBeAg阳性、HBeAg阴性、HBsAg阴性方向的变迁,ALT低水平区段的构成比均逐渐增加。结论HBV血清标志物状态在慢性肝病中存在着不同的构成比并具有相应的临床意义。     

乙型肝炎病毒所致慢性肝病病人肝脏铁沉积和脂肪变性的MRI定量研究

目的 根据多回波Dixon技术定量测得的R₂*值和质子密度脂肪分数（PDFF）评价乙型肝炎病毒（HBV）所致慢性肝病病人的肝脏铁含量和脂肪含量,探讨定量测量与病情进展的关系。方法 回顾性分析97例HBV所致慢性肝病病人,所有病人均行钆塞酸二钠（Gd-EOB-DTPA）增强MRI检查。根据病情进展状态将病人分为3组,慢性乙型肝炎（CHB）组21例,乙肝肝硬化（LC）组44例,LC合并肝细胞癌（HCC）组32例。另外纳入正常对照（NC）组20例。全部研究对象均进行了MRI多回波Dixon序列扫描,测量其肝实质R₂*值和PDFF;测量HCC病人病灶处的R₂*值和PDFF,获取所有LC病人的肝功能Child-Pugh评分。采用Kruskal-Wallis检验比较组间R₂*值和PDFF差异;采用配对t检验比较HCC组病灶与邻近正常肝组织的R₂*和PDFF。采用Spearman相关分析所有受试者R₂*值与PDFF,及LC病人Child-Pugh评分与其R₂*值、PDFF之间的相关性。结果 ①LC组、HCC组R₂*均高于NC组（均P<0.05）,HCC组R₂*高于CHB组（P<0.05）;HCC组PDFF高于NC组（P<0.05）。其余2组间R₂*和PDFF的差异均无统计学意义（均P>0.05）。②HCC病人病灶处的R₂*低于邻近正常肝组织（P<0.05）,而两者PDFF差异无统计学意义（P>0.05）。③所有受试者R₂*与PDFF呈正相关（r=0.558,P<0.05）,LC病人肝脏R₂*与Child-Pugh评分呈正相关（r=0.336,P<0.05）,PDFF与Child-Pugh评分无相关性（r=0.102,P>0.05）。结论 HBV所致慢性肝病病人可出现肝脏铁沉积和脂肪变性;随着病情的进展,肝脏铁含量和脂肪含量呈升高趋势;癌变病灶表现为肝脏富铁背景下的乏铁灶。     

慢性乙型肝炎患者血清HBV全长序列分析及复制力评价

目的 分析乙型肝炎患者HBV全长基因组序列并对其复制力进行评价.方法 从慢性乙型肝炎患者血清中提取HBV病毒DNA,PCR扩增HBV全长基因组,克隆到pGEM-Teasy载体中,每个样品挑选5～10个克隆测序,分析基因型以及全长基因组耐药相关的突变位点,并对个别位点进行定点突变.将克隆到pGEM-Teasy载体中的全长HBV基因组经BspQ Ⅰ/Sca Ⅰ双酶切后,转染入肝癌细胞系HepG2、Huh7.转染3d后榆测上清HmAg表达量及细胞内HBV复制中间体核心颗粒DNA载量,分析全长HBV基因组的复制力(1.0倍HBV复制模型).结果 从2份慢性乙型肝炎患者血清中成功获得5条HBV全长克隆,来自同一份血清的克隆核苷酸,其一致性为98%～100%,提示HBV存在准种特性.测序结果 表明5条HBV全长基因均为C型.通过定点突变又获得3个全长克隆.经序列分析发现,HBV反转录酶区存在A181V/S、L229M、V84M、M204I氨基酸位点的突变,前C/C区存在T1753C、A1762T、G1764A和G1896A核苷酸位点的突变.复制力分析提示上述位点突变后病毒复制力均有不同程度下降,L229M还可以进一步降低A181V突变株的复制力.结论 自行建立的无载体1.0倍HBV复制模型可在细胞内分泌抗原蛋白以及装配子代病毒,完成生活周期,这为下一步分析HBV的耐药表型打下了基础.此外,还可指导临床制定更加合理的抗病毒策略,筛选针对已出现或将来可能出现的耐药突变的新型抗病毒药物.     

乙型肝炎患者不同血清标志物HBV DNA的表达及意义

 目的探讨血清HBV DNA水平与HBV标志物(HBVM)表现模式的相关性.方法血清HBV DNA定量检测采用PCR ELISA法,HBVM采用ELISA法.结果在HBVM阳性的366例血清中,有199例HBV DNA阳性,占54.4%.血清HB-/ml占65.2%;HBsAg、抗-HBe、抗-HBc阳性者HBV DNA-HBc阳性者HBV DNA阳性率占95.2%,≥106 copiessAg、HBeAg、抗阳性率占29.1%,≥106 copies/ml占17.6%.结论血清HBVM阳性患者中约55.0%的血清HBV DNA阳性,且HBeAg阳性患者中HBV DNA含量及阳性率均明显高于抗-HBe阳性者;在抗-HBs、抗-HBc阳性或HBsAg阴性者血清内也有HBV DNA阳性者.     

慢性乙型肝炎血清学标志、HBV DNA定量分析及HBV前C/C变异的临床研究

目的 :探讨慢性乙型肝炎患者血清学标志、HBVDNA载量及HBV前C/C变异与临床病变的关系。方法 :随机选取慢性乙型肝炎患者 2 4 6例 ,其中轻度 10 2例、中度 88例、重度 5 6例 ,分别应用ELISA、实时PCR法检测其血清中的HBV免疫学标志及HBVDNA含量。同时对HBeAg阴性而HBVDNA含量高拷贝的 3例轻度、6例中度及 8例重度患者血清 ,应用巢式PCR方法分离前C/C区全长基因 ,纯化后克隆入T载体 ,鉴定后进行序列测定。结果 :10 2例轻度、88例中度及 5 6例重度患者中血清学标志HBsAg ,HBeAg,抗 -HBc阳性模式分别为 5 3例 (5 1.9% )、4 6例(5 2 .3% )、33例 (5 8.9% ) ;HBsAg ,抗 -HBe,抗 -HBc阳性模式分别为 37例 (36 .3% )、32例 (37.5 % )、2 1例 (37.5 % ) ;单独HBsAg阳性为 8例 (7.8% )、5例 (5 .6 % )、1例 (1.7% ) ;其他模式分别为 4例、5例、1例。HBVDNA含量平均值分别为 10E 5 .5 3拷贝 /ml、10E 6 .0 3拷贝 /ml、10E 6 .5 8拷贝 /ml。HBeAg阴性而HBVDNA含量 >10E 6拷贝 /ml的病例数分别为 3例、6例、8例。统计分析表明 ,轻、中、重慢性乙肝患者间血清学标志及HBVDNA含量差异均不具统计学意义 ,而HBeAg阴性HBVDNA含量高拷贝的患者出现频率差异具有统计学意义。序列测定结果显示 17例患者血清的HBV分离株的前C/C     

慢性乙型肝炎患者白细胞介素12B+1188(A/C)位点基因多态性分析

目的 探讨白细胞介素12(IL-12)亚基p40(IL-12B)3'非翻译区+1188(A/C)位点的基因多态性与慢性乙型肝炎的相关性以及对HBV DNA水平的影响.方法 应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)和DNA测序的方法检测157例慢性乙型肝炎患者(慢性乙肝组)和122名健康对照(对照组)IL-12B 3'非翻译区+1188(A/C)位点的基因型,采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)测定慢性乙肝患者的血浆HBV DNA水平.结果 慢性乙肝组IL-12B+1188(A/C)位点AA、AC、CC基因型分布频率分别为34.4%、42.0%、23.6%,对照组三种基因型的分布频率分别为47.5%、39.3%、13.2%.慢性乙肝组与对照组间CC基因型和非CC基因型(AA+AC)之间频率分布差异有统计学意义(X2=4.874,P=0.027;ORCC=1.797,95%CI 1.051～3.073).慢性乙肝组等位基因A、C分布频率分别为55.4%、44.6%,对照组分别为67.2%、32.8%,两组比较差异有统计学意义(X2=8.004,P=0.005;ORA=0.824,95%CI 0.722～0.941;ORC=1.360,95%CI 1.094～1.691);慢性乙肝患者中高水平≥5.0×102拷贝/ml(HBVDNA组)C等位基因分布频率明显高于低水平＜5.0×102拷贝/ml(HBV DNA组),差异有统计学意义(X2=9.750,P=0.002).结论 IL-12B 3'非翻译区+1188(A/C)位点基因多态性与HBV感染相关,其中C等位基因可能是慢性乙肝的遗传易感基因,携带C等位基因的个体可能更有利于HBVDNA的复制.     

血清病毒检出核苷(酸)类似物耐药突变的慢性乙肝患者PBMCs中HBV cccDNA基因突变特点分析

目的分析经核苷(酸)类似物治疗并已在血清病毒中产生耐药基因突变的慢性乙肝患者外周血单个核细胞(PBMCs)中HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)反转录酶(RT)区的基因突变特点。方法收集2010年7月-2011年8月于解放军302医院住院的慢性乙肝患者30例,均经6个月以上的核苷(酸)类似物抗病毒治疗并已在血清中检测到耐药相关突变。采集与血清检测同一时间点的全血标本30份并分离PBMCs,提取总DNA,以不降解质粒的ATP依赖的DNA酶(PSAD)消化+滚环扩增+跨缺口PCR方法扩增HBV cccDNA的RT区,分析9个位点的核苷(酸)类似物耐药相关变异。结果 30份样本中,16例检出HBV cccDNA,检出率为53.3%,PBMCs中HBV cccDNA检出率与HBeAg阳性率、血清ALT水平及血清HBVDNA载量均无显著相关性。在16例HBV cccDNA检出者中,B基因型5例,占31.3%,C基因型11例,占68.8%,与血清HBV基因分型结果一致。但是,与血清HBV均检出耐药突变株不同,16例PBMCs cccDNA中检出的病毒均是无核苷(酸)类似物耐药相关突变的野生株。结论在经核苷(酸)类似物治疗的慢性乙肝患者血清中HBV DNA产生耐药突变的情况下,PBMCs中HBV cccDNA仍以原始野生株为优势种群,推测PBMCs可能是体内HBV野生株的"存储库"。     

陕西地区汉族人慢性乙型肝炎与HLA-DRB1基因的相关性研究

目的研究HLA-DRB1等位基冈与HBV感染慢性化的相关性。方法用PCR-SSP方法对陕西地区汉族人群中的慢性乙型肝炎（CHB）患者54例、乙型肝炎表面抗原携带者（ASC）32例及正常健康人108人进行HLA-DRB1等位基因分型比较,并对HLA-DRB1等位基因分型与HBV不同复制状态进行相关性分析。结果陕西地区正常汉族人HLA-DRB1等位基因以DRB1＊04（16．2％）,DRB1＊09（12.5％）,DRB1＊12（11．6％）,DRB1＊15（13．4％）最为常见;CHB组HLA-DRB1＊03的等位基因频率（11．1％）明显高于健康对照组（3．7％）,两组相比差异显著（Pc=0．014;OR=3．57;P〈0．05）;DRB1＊07基因位点在HBV高复制状态较低复制状态多见（Pc=0．034,OR=3．88,P〈0．05）;HLA-DRB1＊15等位基因频率对照组为13．4％,明显高于CHB组7．4％（Pc=0．039;OR=0．48;P〈0．05）。结论HLA-DRB1＊03、HLA-DRB1＊07与陕西地区汉族人HBV感染后的慢性化相关联,HLA-DRB1＊15在陕西地区汉族人与HBV感染的保护相关;HLA-Ⅱ类基因是决定HBV感染后临床转归的重要因素之一。